Công nghệ sinh học thực phẩm (ThS. Phạm Hồng Hiếu Trang) - Chương 6: Một số kỹ thuật kiểm tra hiện đại

Chia sẻ: To Thi Ly | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:35

Thêm vào BST

Báo xấu

181
lượt xem 32
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Là kỹ thuật dùng để phát hiện các phân tử đặc trưng trong mẫu (e.g. proteins & carbohydrates, vi khuẩn, virus, độc tố...). Là công nghệ của lĩnh vực miễn dịch: sử dụng kháng thể (antibodies).Dùng để định tính và định lượng mẫu. Rất nhạy. Được ứng dụng nhiều trong y học và thực phẩm

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Công nghệ sinh học thực phẩm (ThS. Phạm Hồng Hiếu Trang) - Chương 6: Một số kỹ thuật kiểm tra hiện đại

MỘT SỐ KỸ THUẬT KiỂM TRA HIÊN ĐẠI
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Kỹ thuật ELISA?  Là kỹ thuật dùng để phát hiện các phân tử đặc trưng trong mẫu (e.g. proteins & carbohydrates, vi khuẩn, virus, độc tố...)  Là công nghệ của lĩnh vực miễn dịch: sử dụng kháng thể (antibodies).  Dùng để định tính và định lượng mẫu.  Rất nhạy.  Được ứng dụng nhiều trong y học và thực phẩm
Antibodies  Là những Proteins được tiết ra bởi tế bào B- lymphocytes (bạch cầu) ở động vật có Fab xương sống. fragments  Có khả năng phát hiện và liên kết với kháng Fc fragments nguyên (antigens) IgG molecule
Các bước cơ bản của phương pháp ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay 1. Antigen được hấp thu trên bề mặt plastic (‘sorbent’). 2. Antigen được nhận biết bởi các antibody đặc trưng (‘immuno’). 3. Antibody được nhận diện bởi antibody (‘immuno’) thứ 2 có gắn với enzyme (‘enzyme-linked’). 4. Phản ứng cơ chất với enzym được thực hiện (thường tạo hợp chất màu) Màu của sản phẩm= đo được sự hiện diện của antigen
Secondary antibody Substrate Coloured product Primary antibody Different antigens in sample
Botrytis cinerea conidiophore
Chuẩn bị mẫu Place half a Add 2ml Filter into raspberry in Break up new tube PBS tissue with tube using glass rod muslin
Coating the wells  Nhỏ 1 giọt mẫu vào giếng (well)  Giữ yên trong khoảng 10 phút để mẫu hấp thu vào bề mặt plastic.
Thêm kháng thể (primary antibody)  Thêm vào khoảng 4 giọt primary antibody (mouse monoclonal) vào mỗi giếng
Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody) Inject mouse with antigen Obtain Grow mouse Mouse spleen myeloma (tumour) B-lymphocytes cells in culture Fuse B-lymphocytes with myeloma cells Antibody-producing hybridoma cells
B-lymphocyte and Unlimited supply myeloma mixture of antibody specific for single epitope Keep clone Select fused producing antibody and reproducing which best detects hybridoma cells antigen via growth medium Make Screen clones from hybridomas individual for antibody antibody- production producing cells
Sản xuât kháng thể thứ hai (Secondary antibody) Mouse serum Polyclonal injected into a antibodies which different species, can recognise any e.g. rabbit, goat. mouse antibody Animal makes various antibodies against the Select anti-mouse different antigens antibodies from in serum plasma Take blood from animal
Thêm vào kháng thể thứ 2 secondary antibody  Được liên kết với enzyme horseradish peroxidase.  Thêm vào 4 giọt secondary antibody (anti- mouse polyclonal) vào mỗi giếng  Để yên trong khoảng 20 phút.
8. Observe colour development 7. Add substrate 1. Add antigen for enzyme 2. Wash with 6. Wash with PBST PBST 4. Wash with PBST 3. Add primary 5. Add secondary antibody antibody
Ứng dụng ELISA  Phát hiện bệnh ở người, động vật và thực vật.  Phát hiện các tác nhân gây dị ứng trong thực phẩm.  Phát hiện các hormones, kháng sinh trong thực phẩm.  Phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm
PCR PCR và real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở do vậy chúng ta có khả năng không phải bị lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngoài, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ
KHÁI NIỆM • PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction • PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng khuếch đại gen". • PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. • PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống
LỊCH SỬ Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase
THỰC NGHIỆM PCR • PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. • PCR cần rất nhiều thành phần. - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi (primer), - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA- polymerase