Đề tài: Đánh giá thực trạng nhiễm HPV (human papilloma virus) ở cổ tử cung phụ nữ người kinh tại tỉnh KonTum năm 2014 bằng kỹ thuật real-time PCR

Chia sẻ: Nguyen Thi Thuy Trinh | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

452
lượt xem 93
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài: xác định tỷ lệ nhiễm HPV, nhiễm các tuýp HPV nguy cơ cao dẫn đến ung thư cổ tử cung ở phụ nữ người Kinh tại Tỉnh Kon Tum năm 2014 bằng kỹ thuật Real-time PCR, đề xuất một số vấn đề liên quan đến việc phòng ngừa và phát hiện sớm ung thư cổ tử cung.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: Đánh giá thực trạng nhiễm HPV (human papilloma virus) ở cổ tử cung phụ nữ người kinh tại tỉnh KonTum năm 2014 bằng kỹ thuật real-time PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN BỘ MÔN SINH HỌC THỰC NGHIỆM ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG NHIỄM HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS) Ở CỔ TỬ CUNG PHỤ NỮ NGƯỜI KINH TẠI TỈNH KONTUM NĂM 2014 BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thùy Trinh Lớp: Cử nhân Sinh K11 ĐẮK LẮK, NĂM 2013
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Tính cấp thiết Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là một trong những bệnh ung thư phụ khoa thường gặp ở phụ nữ ở tuổi 35 trở lên. Trên thế giới, cứ 2 phút lại có một phụ nữ chết do UTCCT, hàng năm có khoảng 530.232 trường hợp mắc mới UTCCT được chuẩn đoán, chiếm 8,8% các trường hợp UTCCT ở phụ nữ và khoảng 275.008 phụ nữ (51,9%) chết vì UTCCT. Tại Việt Nam, ước tính cứ 100.000 người phụ nữ thì có 20 trường hợp mắc bệnh UTCCT và 11 trường hợp tử vong, hàng năm có khoảng trên 5.000 tr ường hợp mắc mới và trên 2.000 trường hợp tử vong do UTCCT. Một số lý do dẫn đ ến tỉ l ệ mắc bệnh UTCTC cao bao gồm số phụ nữ tham gia khám phụ khoa định kỳ để được tầm soát ung thư còn thấp, các chương trình tầm soát cũng chưa đ ược bao phủ r ộng, ý thức phòng bệnh UTCCT ở phụ nữ còn hạn chế do thiếu chương trình tuyên truyền giáo dục. UTCTC có thể xảy ra với bất kì người phụ nữ nào và đặc biệt bệnh thường gặp ở người phụ nữ ở 35 – 40 tuổi trở đi. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong cuộc đời người phụ nữ với nhiều thiên chức lớn lao: làm vợ, làm mẹ, là người chăm sóc gia đình và hơn thế nữa, ở độ tuổi này người phụ nữ đồng thời đã tạo dựng sự nghiệp cho mình. HPV (Human Papilloma Virus) được xác định là nguyên nhân cần thiết gây UTCTC. Hiện nay có hơn 100 tuýp HPV được biết đến nhưng chỉ có 16 tuýp được xếp vào dạng có nguy cơ cao gây UTCTC, trong đó tuýp HPV16 và HPV18 gây nguy hiểm nhất. Tiếp theo là tuýp HPV45 gây ra hơn 70% trường hợp UTCTC. Các tuýp còn lại chỉ có khả năng gây các tổn thương vùng sinh dục lành tính hoặc gây muộn cóc ở tay chân. Ở các vùng địa lý khác nhau thì tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ và sự phân bố các nhóm nguy cơ khác nhau là khác nhau. Một số yếu tố được xem là tăng nguy cơ nhiễm HPV và phát triển UTCTC như: phụ nữ có quan hệ tình dục sớm (trước 18 tuổi) hoặc quan hệ với nhiều người; dùng thuốc tránh thai kéo dài; sinh đẻ nhiều (từ 4 lần trở lên); hút thuốc lá; tình trạng suy giảm miễn dịch như nhiễm HIV; mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục, đặc biệt là bệnh viêm sinh dục do nhiễm Trichomonas, Chlamydia trachomatis, Herpes simplex virus týp 2 (HSV2)... UTCTC không xảy ra đột ngột mà âm thầm trải qua các giai đoạn từ lúc nhiễm HPV, gây nên những biến đổi bất thường ở tế bào cổ tử cung, các tổn thương tiền ung thư rồi đến ung thư, kéo dài trung bình từ 10 – 15 năm. Đặc biệt giai đoạn tiền ung thư
gần như không có triệu chứng gì, do đó người dân không thể nhận biết bệnh nếu không đi khám phụ khoa. Đây là nỗi lo của người phụ nữ khi bắt đầu quan hệ tình dục. Làm thế nào để phòng ngừa và phát hiện sớm UTCTC luôn là câu hỏi lớn cần được trả lời. Tỉnh Kon Tum là Tỉnh có dân số trẻ. Đến năm 2009, dân số toàn Tỉnh là 432.865 người, có 24 dân tộc sinh sống, trong đó dân tộc thiểu số chiếm trên 53% dân số, có 6 dân tộc ít người sống lâu đời bao gồm: Xơ Đăng; Bana; Giẻ - TRiêng, Gia Rai; Brâu và Rơ Măm. Có khoảng 234.114 dân số trong độ tuổi lao động làm việc trong các ngành kinh tế, trong đó có khoảng 162.470 người lao động trong các ngành nông - lâm – th ủy sản. Đời sống người dân ổn định nhưng vẫn còn nhiều người nghèo, trình đ ộ dân trí chưa cao, vẫn còn một số phong tục tập quấn lạc hậu nên kiến thức về chăm sóc s ức khỏe sinh sản nói chung, viêm nhiễm đường sinh dục nữ còn rất hạn chế. Do đó việc phát hiện nhiễm HPV, ngăn ngừa ung thư cổ tử cung tại địa bàn Tỉnh Kon Tum là việc đáng quan tâm. Thực tế 95% bệnh ung thư cổ tử cung là do các tuýp HPV nguy cơ gây nên, có nghĩa là phương pháp phát hiện tin cậy có liên quan đáng kể đến chuẩn đoán và tiên lượng. Các phương pháp thông thường nhất hiện nay để phát hiện vi rút đều sử dụng kỹ thuật PCR. Tuy nhiên kỹ thuật PCR chỉ mang tính định tính chú không mang tính định lượng trong khi kỹ thuật Real – time PCR có thể vừa định tính vừa định lượng cho phép xác định mức độ nhiễm vi rút. Trên cơ sở đó tôi nghiên cứu đề tài “Đánh giá thực trạng nhiễm HPV (Human Papilloma Virus) ở cổ tử cung phụ nữ người Kinh tại Tỉnh Kon Tum năm 2014 bằng kỹ thuật Real-time PCR”. 2. Mục tiêu của đề tài 1. Xác định tỷ lệ nhiễm HPV, nhiễm các tuýp HPV nguy cơ cao dẫn đến ung thư cổ tử cung ở phụ nữ người Kinh tại Tỉnh Kon Tum năm 2014 bằng kỹ thuật Real- time PCR 2. Đề xuất một số vấn đề liên quan đến việc phòng ngừa và phát hiện sớm ung thư cổ tử cung. 3. Ý nghĩa 3.1. Ý nghĩa khoa học Bằng kỹ thuật Real-time PCR, đề tài xác định tỷ nhiễm HPV, tỷ lệ nhiễm các tuýp có nguy cơ cao, mức độ nhiễm HPV ở tế bào cổ cung phụ nữ người Kinh tại Tỉnh Kon Tum năm 214. Ngoài ra đề tài còn đề xuất các vấn đề liên quan đ ến việc phòng ngừa và phát hiện sớm ung thư cổ tử cung. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần vào công tác tư vấn bảo vệ sưc khỏe cho cộng đồng, đặc biệt là phụ nữ người Kinh tại Tỉnh Kon Tum trong việc hiểu biết,
nhận thức về bệnh và các biện pháp đề phòng ngừa và phát hiện sớm ung thư c ổ t ử cung.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Khái niệm ung thư cổ tử cung Ung thư cổ tử cung là tổn thương ác tính phát triển từ các tế bào tại cổ tử cung. Ung thư xuất hiện khi các tế bào tử cung biến đổi bất thường một cách tự động và không kiểm soát. Ung thư cổ tử cung tiến triển bằng cách có thể xâm lấn tại chỗ hay lan rộng đến các cơ quan khác của cơ thể và gây tử vong. Nhiễm HPV lâu dài là điều kiện thuận lợi dẫn đến ung thư cổ tử cung. Một trong những triệu chứng thông thường nhất là chảy máu âm đạo bất thường, ở giai đoạn muộn hơn, người bệnh có thể có những biểu hiện như ra huyết trắng có mùi hôi, có lẫn máu, chảy máu âm đạo sau giao hợp hoặc sau khi làm việc nặng dù không đang ở chu kỳ kinh nguyệt. Nặng hơn có thể chảy dịch có máu ở âm đạo, kèm theo đau bụng, lưng, vùng chậu và chân. Cũng có nhiều trường hợp không có triệu chứng gì cho đến khi phát hiện ung thư. Người phụ nữ đầu tiên trên thế giới bị phát hiện là mắc bệnh ung thư cổ tử cung là Henrietta Lacks, một người Mỹ gốc Phi đã qua đời khi 31 tuổi. Tuổi thường gặp ung thư cổ tử cung là 30 – 59, đỉnh cao là 48 – 52 tuổi. Có thể nhận thấy là đỉnh của ung thư cổ tử cung muộn hơn tân sinh cổ tử cung khoảng 10 – 15 năm. Có 99,7% các trường hợp ung thư cổ tử cung có sự hiện diện của HPV tuýp nguy cơ cao theo nghiên cứu của Cơ quan Quốc tế về ung thư. Ở Việt Nam UTCCTU là ung thư thường gặp nhất ở người phụ nữ từ 15 – 44 tuổi mà nguyên nhân chính gây ra bệnh là do nhiễm HPV. 1.1.1. Cấu tạo của cổ tử cung Gồm hai phần: cổ ngoài và cổ trong. - Cổ ngoài: là phần nhô vào trong âm đạo, được bao phủ bởi biểu mô lát tầng không sừng hóa, giống tế bào biểu mô lát tầng của âm đạo nhưng trơn láng hơn, gồm có 5 lớp tế bào từ L1 – L5. + L1: lớp đáy (lớp sinh sản) có 1 hàng tế bào. + L2: lớp cận đáy có 1 – 2 hàng tế bào. + L3: lớp trung gian (lớp tế bào gai) có 6 – 8 hàng tế bào. + L4: lớp bề mặt (lớp tế bào gai trưởng thành) có 5 – 6 hàn tế bào. + L5: lớp bong vảy. - Cổ trong: là một ống hình trụ nối cổ ngoài với thân cổ tử cung được bao phủ bởi một lớp tế bào đơn tiết nhầy, giữa mặt đáy của tế bào này và màng đáy bên dưới có một lớp tế bào không liên tục, các tế bào này có kích thước nhỏ, nhân tòn, tương đ ối khó thấy gọi là tế bào dự trữ. Các tế bào dự trữ có chức năng t ương tự tế bào l ớp đáy
của biểu mô cổ ngoài, giữ nhiệm vụ sinh sản ra các tế bào trụ tiết nhầy mới thay thế cho tế bào đã bị hư hỏng, bong tróc. Biểu mô này gấp nếp sâu vào trong mô đ ệm d ưới tạo thành khe tuyến. Lỗ ngoài cổ tử cung là ranh giới giũa cổ ngoài và cổ trong cổ tử cung. - Vùng tiếp giáp: là vùng nằm giữa biểu mô lát tầng không sừng hóa của c ổ ngoài và biểu mô tuyến trụ đơn của cổ trong được gọi là lỗ cổ ngoài mô học. Đây là vùng chuyển tiếp của hai loại tế bào biểu mô Gai – Trụ. Khi chưa đến tuổi dậy thì đuờng tiếp hợp Gai – Trụ ra xa khỏi lỗ ngoài tử cung. Ở phụ nữ trong tuổi hoạt đ ộng tình dục, tuyến cổ trong lan dần xuống cổ ngoài tạo ra vùng lộ tuyến cổ tử cung, đ ẩy đường tiếp hợp Gai - Trụ ra xa khỏi lỗ ngoài cổ tử cung, biểu mô cổ trong phải thích nghi với môi trường ưa a xít của âm đạo bằng cách tăng sản các tế bào d ự tr ữ t ạo nên các lớp tế bào biệt hóa theo hướng gai, đẩy dần lớp tế bào trụ lên trên và cuối cùng hình thành nên một biểu mô lát tùng hình thành nên một biểu mô lát tầng tương tự cổ ngoài. Chính do hoạt động tăng sản chuyển sản này cùng với tác nhân viêm kéo dài, dẫn đến nghịch sản và nếu không điều trị thì sẽ chuyển thành ung thư cổ tử cung. 1.1.2. Tác nhân gây ung thư cổ tử cung Nguy cơ ung thư cổ tử cung liên quan tới các yếu tố như: nhiều bạn tình, quan hệ tình dục ở tuổi thiếu niên, sinh đẻ nhiều, sử dụng thuốc ngừa thai lâu dài, thời gian đặt vòng tránh thai, mắc các bệnh truyền nhiễm qua đường tình dục, viêm nhiễm dai dẳng, hút thuốc lá, trong đó nhiễm HPV tuýp nguy cơ cao là đứng hàng đầu. Vài năm sau khi bắt đầu sinh hoạt tình dục và giao hợp thường xyên, người ta có 50 – 80% khả năng nhiễm HPV và nguy cơ mắc bệnh tăng theo con số bạn tình trong đời. Phần lớn, cơ thể con người có khả năng tạo miễn nhiễm tiêu diệt HPV và trong vòng 1 – 2 năm HPV sẽ biến mất trong cơ thể. Tuy nhiên 2 – 7 % phụ nữ không diệt được siêu vi trùng và bị nhiễm dần nặng lên. Sau vài năm, HPV sẽ gây biến đổi bất thường trong niêm mạc cổ tử cung, tạo ra những tế bào bất thường, có khả năng hóa ác. Nếu không được khám nghiệm, phát giác và theo dõi, những tế bào này phát triển thành ác tính, xâm lấn đưa đến ung thư cổ tử cung. Nhà khoa học người Canada Alexander Meisels đã lần đầu tiên phát hiện sự hiện diên của các tế bào bóng hay còn gọi là tế bào rỗng khẳng định trên phết tế bào cổ tử cung có nhiễm HPV năm 1976. Các năm sau đó ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung. Vào năm 2000 mối liên quan
giữa nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung đã được các nhà khoa học khẳng định sau khi tổng hợp các kết quả nghiên cứu về nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung. Nhà vi rút học người Đức Harald Zur Hausen đã nhận được giải Nobel y học về sự kiện này vào năm 2008. 1.1.3. Sự hình thành ung thư xâm lấn cổ tử cung do nhiễm HPV Quá trình tiến triển từ khi bị nhiễm HPV đến ung thư cổ tử cung theo lâm sàng trải qua 5 giai đoạn: - Giai đoạn 0: ung thư tại chỗ. - Giai đoạn I: tế bào ung thư khu trú ở cổ tử cung. + Ia: vi xâm lấn – tổn thương có d < 2 mm + Ib: xâm lấn – tổn thương có d > 2mm - Giai đoạn II: ung thư lan rộng tới âm đạo trừ 1/3 dưới, lan đ ến chu cung nhưng chưa đến vách chậu. + IIa: lan đến âm đạo trừ 1/3 dưới. + IIb: chu cung nhưng đáy tử cung còn di động được - Giai đoạn III: ung thư lan rộng đến 1/3 dưới âm đạo, lan đến chu cung – vách chậu. + IIIa: lan tới 1/3 dưới âm đạo + IIIb: lan tới vách chậu - Giai đoạn IV: di căn + IVa: ung thư lan rộng ra các cơ quan vùng chậu như bàng quang, tr ực tràng hay cơ quan xa hơn. + IVb: di căn xa Quá trình hình thành và tốc độ biến chuyển của ung thư cổ tử cung còn phụ thuộc vào hệ miễn dịch của người bị nhiễm mạnh hay yếu. Khoảng 80% phụ nữ ở tuổi trưởng thành bị nhiễm HPV ít nhất 1 lần trong đời. Tuy nhiên chỉ có 10% phụ nữ bị nhiễm HPV sẽ có biểu hiện loạn sản ở giai đoạn tiền ung thư, trong số này có gần 8% sẽ ung thư tại chổ. Khoảng 10 – 20% số người ung thư ở giai đoạn chưa xâm lấn còn giới hạn ở cổ tử cung, nếu không điều trị sẽ trở thành ung thư ở dạng xâm lấn. Như vậy, trong tổng số một triệu phụ nữ bị nhiễm HPV ban đầu sẽ có trung bình 0,16% hay 1.600 người bị ung thư xâm lấn [ ]. 1.1.4. Cơ chế sinh học phân tử gây ung thư cổ tử cung
Các týp HPV nguy cơ cao là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến ung thư cổ tử cung. Cơ chế sinh học phân tử gây ung thư cổ tử cung diễn ra như sau: khi vi rút xâm nhiễm vào lớp tế bào đáy thuộc biểu mô lát tầng của cơ thể, các týp HPV nguy cơ cao sản sinh các gen gây ung thư (oncogen) chủ yếu là E6 và E7. Sau đó gen này chèn vào hệ gen của tế bào vật chủ làm cấu trúc của gen E2 của HPV bị phá vỡ và không còn khả năng kiể soát hai gen E6 và E7, khi đó 2 gen này sẽ sao mã và tổng hợp các gen t ương ứng đồng thời sẽ tương tác và vô hiệu hóa các gen điều hòa chu trình phân bào của tế bào chủ như pRb và p53 và thúc đẩy quá trình phân bào. Kết quả là các tế bào nhiễm HPV sẽ sinh sản một cách tự phát, không kiểm soát được và phát triển thành tế bào ung thư. Đồng thời khi gen điều hòa pRb của tế bào chủ bị kìm hãm bởi sự tương tác với gen E7, tế bào sẽ tăng sinh gen điều hòa p6INK4A nhằm tái lập sự kiểm soát. Kết quả làm cho các tế bào bị nhiễm HPV týp nguy cơ cao tăng cao hàm lượng E7 của vi rút và p6INK4A và có khả năng chuyển thành dạng ung thư. Các nghiên cứu của Microarray cũng cho thấy khi nhiễm HPV, các gen có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của tế bào và đáp ứng miễn dịch interferon chống vi rút đều bị kiềm hãm, đồng thời làm tăng biểu hiện hàng loạt của các gen có vai trò trong hình thành khối u. Nhiều nghiên cứu cho thấy đồng nhiễm nhiều týp HPV với sự có mặt ít nhất một tuýp nguy cơ cao sẽ làm tăng khả năng tiến triển ung thư cổ tử cung. Tuy các tuýp nguy cơ thấp hầu như không gây ung thư khi lây nhiễm độc lập, nhưng khi đồng nhiễm cùng các tuýp có nguy cơ cao chúng sẽ làm tăng nhanh sự chuyển dạng tế bào và rút ngắn thời gian tiến triển thành ung thư cổ tử cung. Tỷ lệ đồng nhiễm rất cao trên 39% [] . 1.2. Đặc điểm sinh học của HPV (Human Papilloma Virus) 1.2.1. Cấu tạo của HPV Human Papilloma Virus là một loại vi rút có lõi là ADN không có vỏ bọc thuộc họ Papovaviridae, dòng Taxonomic cổ. Có kích thước nhỏ, đường kính trung bình khoảng 50 – 55 nm, vỏ casid của HPV có 20 mặt và được cấu thành 72 capsomer, mỗi capsomer gồm có hai loại protein casid là L1 và L2. Protein L1 là một pentamer và là thành phần chủ yếu của vỏ capsid. Genome của HPV là một phân tử ADN kép, khép vòng, siêu xoắn, có kích thước nằm trong khoảng từ 7,2 kbp đ ến 8,1 kbp. Khung đ ọc mở mã hóa cho toàn bộ protein của HPV nằm trên một mạch của phân tử ADN kép.
Dựa vào chức năng, genome của HPV được chia thành ba vùng chính: - Vùng gen mã hóa cho các protein sớm (E-Early) gồm các gen E1, E2, E3, E4, E6 và E7. Chứa các khung đọc mở mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sao chép, phiên mã và chuyển dạng tế bào trong quá trình nhân lên của vi rút và sự tiến triển của ung thư cổ tử cung . - Vùng gen mã hóa cho protein muộn (L – Late) chứa các khung đọc mở mã hóa cho các protein cấu trúc L1 và L2 hình thành vỏ capsid của vi rút. - Vùng điều hòa ngược còn gọi là vùng điều khiển dài (LCR – Long Control Region) không có chức năng mã hóa, làm nhiệm vụ kiểm soát quá trình phiên mã, vùng này có kích thước 400 – 1000bp. Vùng LCR mang các trình tự điều khiển quá trình sao chép của HPV . 1.2.2. Các tuýp của HPV HPV hiện có hơn 100 tuýp được phát hiện dựa vào sự khác biệt về trình tự ADN, nhưng sự khác biệt về bộ gen giữa các tuýp chỉ vào khoảng 10%. Các tuýp này được xác định bằng các lai phân tử ADN của tuýp nghiên cứu và các týp đã bi ết, n ếu mức độ tương đồng nhỏ hơn 50% thì coi như tuýp mới. Dựa vào khả năng gây ung thư của vi rút ta có thể chia chúng thành 2 nhóm: - Nhóm nguy cơ cao (HR – HPV – Hight Risk Human Papilloma Virus): gồm các tuýp 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 55, 56, 59, 66, 68. Các týp này có kh ả năng t ổ h ợp ngẫu nhiên vào ADN của tế bào chủ dẫn đến tăng hoạt động của 2 gen E6, E7 của vi rút. Gen E7 gây bất hoạt gen ức chế u nằm trên nhiễm sắc thể 17 là p53 và gen ức chế u nằm trên nhiêm sắc thể số 13 là pRb (Rb – Retino blastoma) của tế bào chủ. Gen E6 thúc đẩy sự giáng hóa của gen p53 và gen bax – gen thúc đẩy sự tự hủy tế bào, đ ồng thời tái hoạt hóa telomerase, kết quả là tế bào chủ bị thúc đẩy tăng sinh và bất tử hóa, dẫn đến loạn sản và ung thư cổ tử cung[ ]. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy các tuýp HPV nguy cơ cao như 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 hiện diện trong gần 100% các tr ường hợp ung thư cổ tử cung xâm lấn, 75 – 90% và trong các tổn thương tiền ung thư. Có đến 99,7 % phụ nữ ung thư cổ tử cung tìm thấy HPV trong phết tế bào cổ tử cung, trong đó tuýp 16 chiếm 50%, tuýp 18, 31 và 45 chiếm 30%. - Nhóm nguy cơ thấp (LR – HPV – Low Risk Human Papilloma Virus): gồm các týp 1, 2, 4, 6, 7, 11, 26, 42, 53, 54, 62, 66, 70, 73 AD c ủa các týp này tồn t ại d ưới d ạng vòng và không được tổ hợp vào ADN của tế bào chủ nên ít có khả năng gây ung thư, chỉ
gây ra các muộn cóc ở vùng sinh dục týp 1, 2, 4, 7 hoặc u lành ở cổ tử cung gọi là condylom týp 6, 11 hoặc có thể không biểu hiện triệu chứng bệnh trong kết quả lâm sàng. Trong các tuýp HPV thì tuýp 16 là nguy hiểm nhất vì với những phụ nữ nhiễm tuýp này với nồng độ cao có nguy cơ bị ung thư cổ tử cung tăng gấp 6 lần so với ph ụ nữ bị nhiễm HPV các tuýp khác. 1.2.3. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của HPV Cổ ngoài và cổ trong của cổ tử cung là nơi tiếp giáp hai loại biểu mô khác nhau, biểu mô trụ có cấu trúc tuyến và biểu mô lát tầng không sừng hóa. HPV tác động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa là lớp biểu mô có chức năng che chở, bảo vệ sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó sẽ bong ra gọi là biểu mô gai. Vi rút tấn công vào lớp tế bào sinh sản của biểu mô gai khi có những tổn thương nhỏ như trầy xướt nhẹ hoặc là các chấn dộng nhẹ ở lớp biểu mô này và gây ra hiện tượng tế bào phất triển mạnh hơn ình thường rồi sau đó là các lớp t ế bào ti ếp theo của biểu mô gai. Chu trình nhân lên của HPV bắt đầu bằng sự xâm nhiễm của vi rút vào l ớp tế bào đáy của biểu mô gai lát tầng của cổ tử cung. Đa số các tuýp HPV cả nguy cơ cao và nguy cơ thấp có thể xâm nhập vào biểu mô gai lát tầng của cổ tử cung mà không cần các thụ thể đặc hiệu. Tuy nhiên một số tuýp HPV còn cần có sự trợ giúp của các thụ thể đặc hiệu. Ngay sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, ADN của HPV nhân lên theo quá trình biệt hóa của lớp tế bào đáy và phát triển tiến đến các lớp tế bào bề mặt c ủa bi ểu mô. Ở lớp đáy, sự nhân lên của vi rút không có hiệu quả, vi rút tồn tại ở d ạng bổ sung, và nhân lên nhờ bộ máy sao chép của tế bào chủ, hoặc tồn tại ở đó qua nhiều thế hệ. Trong tế bào có chứa keratin đã được biệt hóa ở phía trên lớp đáy của biểu mô, genom của vi rút sẽ được tái bản. Protein capsid của vỏ HPV cũng được tổng hợp và l ắp ráp với ADN để hình thành vô số các hạt virion mới phóng thích vào môi trường. Như vậy có mối liên quan giữa quá trình nhân lên của vi rút và quá rình biệt hóa mô. 1.2.4. Khả năng đáp ứng miễn dịch khi nhiễm HPV Những lớp tế bào ngoài cùng của biểu mô gai lát tầng chịu sự giám sát chặt chẽ của hệ thống miễn dịch. Khi cổ tử cung bị viêm nhiễm, hệ thống miễm dịch này được kích hoạt sẽ tấn công trở lại vi rút. Do đó ban đầu khi xâm nhiễm vào tế bào chủ, HPV
hầu như không gây ra tình trạng viêm, không hoạt hóa hệ miễn dịch và HPV lợi dụng sự bong vảy của tế bào để lẫn trốn miễn dịch. Một số ít kết quả nghiên cứu cho thấy có sự gia tang nồng độ kháng thể với HPV sau khi bị nhiễm tự nhiên nhưng nồng độ này chưa đủ để gây đáp ứng miễn dịch. Trường hợp người mắc hội chứng suy giảm miễn dịch, khả năng bảo vệ chống vi rút của hệ miễn dịch giảm đi đáng kể. Do đó các bệnh nhân nà dễ nhiễm HPV và khi đã nhiễm thì ung thư tiến triển nhanh vầ nghiêm trọng. 1.3. Tình hình nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HPV trên thế giới và tại Việt Nam 1.3.1. Trên thế giới Ung thư cổ tử cung được xếp vào hàng thứ hai trong các ung thư phổ biến ở phụ nữ nhưng lại chiếm vị trí hàng đầu trong các ung thư của các phụ nữ ở những nước đang phát triển. Theo Globocan vào năm 2008, hàng năm có thêm khoảng 530.000 người mắc bệnh UTCCT và 275.000 trường hợp tử vong. Tây Á, Bắc Mỹ, Úc và Tân Tây Lan là nơi có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong thấp nhất thế giới. Các nước đang phát triển, đặc biệt là Đông Phi, quần đảo Tây Nam Thái Bình Dương là nơi có tỷ lệ mắc bệnh và chết cao nhất thế giới. Theo WHO năm 2007 tỷ lệ nhiễm HPV hằng năm ở Châu Mỹ là 15,6% và tỷ lệ mắc bệnh UTCTC là 70,7% trong khi ở các khu vực phát triển hơn thì tỉ lệ này chỉ là 7,7%. Theo Munoz năm 2004 tỷ lệ nhiễm HPV của 3.607 phụ nữ bị mắc bệnh UTCTC tại 25 quốc gia khác nhau là 96% và 30 tuýp khác nhau đã đ ược xác đ ịnh, tuýp phổ biến nhất là 16, 18, 45, 33, 52, 58, 39. Theo Toshiyuki Maehama nghiên cứu tại ba đảo riêng biệt của Okinawa – Nhật bản tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng là 9 – 10%, phổ biến nhất là tuýp 16, 18, 31, 35, 58. Chan Roy nghiên cứu 187 gái mại dâm ở Singapore tỷ lệ nhiễm HPV là 14,4%, các tuýp phổ biến nhất là 16, 58, 17. Mối quan hệ giữa việc nhiễm HPV và UTCTC đã được đề cập đến ừ năm 1980 ở Trung Quốc. Một nghiên cứu tại bệnh viện Chaozhou ở Tỉnh Quảng Đông – Trung Quốc cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ trong độ tuổi 35 – 50 tuổi là 24,5% cao hơn 5 – 10% tỷ lệ nhiễm HPV chung của thế giới. Các tuýp HPV thường gặp nhất là 52, 16, 58, 68, 33.
1.3.2. Ở Việt Nam Ung thư cổ tử cung là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất ở phụ nữ Miền Nam Việt Nam. Theo nghiên cứu của Viện Ung Bướu ở Hà Nội, bệnh viện Hùng Vương ở Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Proyecto Epidemiologico Guanacaste, Santa Ana, Costa Rica – International Agency for Research on Cander, Lyon, France – Chilaren’s Hospital & Regional Medical Center, Viology Laboratory seattle, WA, USA and VU Medical Center, Amsterdam, the Netherlands năm 1997 ở phụ nữ đã kết hôn độ tuổi 18 – 69 tại Miền Nam và Miền Bắc Việt Nam. Trong số 922 phụ nữ ở Thành phố Hồ Chí Minh thì có 10,9% người nhiễm HPV. Có 30 tuýp HPV khác nhau đã được tìm thấy ở Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh trong đó các tuýp phổ biến nhất là 16, 58, 18, 56. Theo nghiên cứu của Vũ Thị Nhung, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Nguyễn Hoàng Chương và Nguyễn Thị Vân Anh năm 2003 tại bệnh viện Hùng Vương, Thành phố Hồ Chí Minh có 38/50 bệnh nhân nhiễm HPV chiếm 76% trong đó các tuýp HPV phổ biến nhất là 11, 16. Năm 2004 Lê Thị Kiều Dung đã nghiên cứu được tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ là 80%. Theo nghiên cứu của Vũ Thị Nhung năm 2006 tại Thành phố Hồ Chí Minh thì tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng là 11, 86%, các tuýp HPV phổ biến nhất là 18, 58, 16. Năm 2007 Phạm Hùng Vân đã phát triển phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gen L1 để nhờ đó xác định kiểu gen của HPV. Năm 2008 Nguyễn Thị Tuyết Ngân nghiên cứu 472 phụ nữ trong độ tuổi sinh sản tại Huyện Cư Mgar, Tỉnh Đắk Lắk đưa ra kết quả tỷ lệ nhiễm HPV là 7,6%, các tuýp HPV phát hiện là 16, 18, 58, 81, 45. Theo nghiên cứu của Lan Vũ năm 2012 trên 4.500 phụ nữ đã lập gia đình ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Thái Nguyên, Huế, Cần Thơ cho thấy tỷ l ệ nhiễm HPV ở các khu vực lần lượt là 6,13%, 8,27%, 9,2%, 8,6% và 10,2%. 1.4. Các yếu tố nguy cơ ung thư cổ tử cung Các nhà nghiên cứu đã xác định được một số yếu tố làm tăng khả năng mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở phụ nữ. Trong đa số trường hợp, tế bào ung thư cổ tử cung được hình thành khi có ít nhất hai yếu tố xảy ra cùng lúc.
Quan hệ tình dục sớm (trước 18 tuổi) và có nhiều bạn tình: các nghiên cứu đã chỉ ra những người phụ nữ quan hệ tình dục khi còn quá trẻ và quan hệ tình d ục v ới nhiều người khác nhau sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư cổ tử cung cao hơn vì khả năng nhiễm vi rút lây qua đường tình dục cao hơn đặc biệt trong đó có vi rút HPV. Hút thuốc lá: thuốc lá làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư cổ tử cung. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cổ tử cung tỷ lệ thuận với lượng thuốc lá và thời gian hút thuốc lá của phụ nữ. Sử dụng diethylstilbestrol (DES): những phụ nữ có mẹ sử dụng DES trong khi mang thai để ngừa sảy thai cũng có nguy cơ mắc bệnh UTCTC cao hơn. Suy giảm hệ hệ thống miễn dịch: những phụ nữ có hệ miễn dịch bị suy yếu do nhiễm vi rút suy giảm hệ miễn dịch ở người hay sử dụng thuốc ức chế hệ miễn dịch ở các bệnh nhân ghép tạng...có nguy cơ mắc bệnh UTCTC cao hơn bình thường. Sử dụng thuốc tránh thai: phụ nữ sử dụng thuốc tránh thai nhiều và thường xuyên là tăng nguy cơ mắc bệnh UTCTC. Sử dụng vitamin A: hiều nghiên cứu cho thấy vitamin A góp phần phòng chống những thay đổi tiền ung thư trong những tế bào giống như những tế bào bề mặt ung thư cổ tử cung. 1.5. Kỹ thuật real – time PCR. Kỹ thuật real – time PCR là kỹ thuật duy nhất để xét nghiệm hiện tại có nhiễm HPV hay không khi tế bào chưa có dấu hiệu biến đổi, nếu có thì HPV thuộc tuýp nào? Nhóm nguy cơ cao hay thấp? Kỹ thuật real – time PCR có ưu điểm so với PCR truyền thống là ngoài việc cho phép xác định có nhiễm HPV hay không còn định lượng được số bản sao khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Số liệu của real – time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di trên gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn, số lượng nguyên liệu được đưa vào quá trình được tăng lên và được đánh giá trong một hệ thống đóng kín nên giảm thiểu các cơ hội nhiễm bẩn. Kit có chứng nội tích hợp nên tránh trường hợp âm tính giả.
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu 1. Đánh giá tỷ lệ nhiễm HPV, nhiễm các tuýp HPV nguy cơ cao dẫn đến ung thư cổ tử cung ở phụ nữ người Kinh tại Tỉnh Kon Tum năm 2014 bằng kỹ thuật Real-time PCR 2. Khảo sát một số vấn đề liên quan đến việc phòng ngừa và phát hiện sớm ung thư cổ tử cung 2.2. Đối tượng nghiên cứu Phụ nữ người Kinh tại Tỉnh Kon Tum. 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3.1. Địa điểm nghiên cứu - Địa điểm thu mẫu: Tỉnh Kon Tum. - Địa điểm thực hiện phương pháp Real – time PCR để định tính HPV: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường, Trường Đại học Tây Nguyên. - Địa điểm xác định tuýp HPV: công ty CPCN Việt Á, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.3.2. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 11/2014 đến tháng 05/2015. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Thiết kế nghiên cứu Mô tả lát cắt ngang Tỉnh Kon Tum từ tháng 11/2014 đến tháng 05/2015. 2.4.2. Mẫu nghiên cứu - Cỡ mẫu: cỡ mẫu được tính theo công thức theo mục tiêu chính của đ ề tài là xác định tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ người Kinh theo công thức: Trong đó + n: cỡ mẫu tối thiểu cần điều tra để ước lượng tỷ lệ nhiễm HPV ở cổ tử cung phụ nữ. + Z: trị số từ phân phối chuẩn. + α: xác suất sai lầm loại 1, chọn α = 0,05 thì = 1,96. + ρ: trị số mong muốn của tỷ lệ nhiễm HPV cổ tử cung phụ nữ, chọn ρ = 0,1186.
ρ = 0,1186 theo tỷ lệ nhiễm HPV theo nghiên cứu của Vũ Thị Nhung ở Thành phố Hồ Chí Minh năm 2006. + Độ chính xác tương đối (sai số cho phép tương đối), chọn ε = 0,37. Thay số liệu vào tính được n = 209 mẫu. - Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu ngẫu nhiên hệ thống. Số lượng mẫu 210 mẫu. Những yêu cầu của phụ nữ trước khi lấy mẫu: + Không thụt rửa sâu vào âm đạo trước khi xét nghiệm. + Không quan hệ tình dục trước khi xét nghiệm 3 – 5 ngày. + Không điều trị bệnh phụ khoa trước khi lấy mẫu ít nhất 6 – 7 ngày. Người nghiên cứu và Cán bộ Y tế giải thích rõ mục tiêu và yêu cầu của nghiên cứu. Đối tượng đồng ý tham gia nghiên cứu sẽ được phát giấy mời có ghi thời gian địa điểm thu mẫu. - Tiêu chí chọn mẫu. + Tiêu chí đưa vào: tất cả phụ nữ người Kinh đã tham gia quan hệ tình dục từ 15 – 60 tuổi đã có quan hệ tình dục và đồng ý tham gia nghiên cứu. + Tiêu chí loại trừ:  Đang trong chu kỳ kinh nguyệt.  Phụ nữ đã cắt bỏ cổ tử cung.  Viêm nhiễm nặng và đang đặt thuốc.  Phụ nữ có bệnh tâm thần.  Phụ nữ có thai.  Không hợp tác. 2.4.3. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm HPV trong nghiên cứu Tất cả các mẫu sau khi thu nhận từ đối tượng được nghiên cứu sẽ được xét nghiệm Sinh học phân tử bằng kỹ thuật Real – time PCR để xác định các mẫu âm tính hay dương tính với vi rút HPV. Sau đó các mẫu dương tính với vi rút HPV sẽ tiếp tục được phân tích định tuýp bằng kỹ thuật Real – time PCR. - Xét nghiệm Sinh học phân tử bằng kỹ thuật Real – time PCR xác định nhiễm HPV: nhiễm HPV là biến nhị giá có 2 giá trị: + Nhiễm: dương tính với vi rút HPV, có đường biểu diễn dương tính bắt đầu từ chu kỳ 25 trở về sau.
+ Không nhiễm: âm tính với vi rút HPV và chứng nội phải dương tính, có đường biểu diễn dưới đường cơ bản. - Xét nghiệm bằng Real – time PCR định tuýp HPV: tuýp HPV là biến định tính, có các giá trị : tuýp 16, 18, 31, 33, 35... 2.4.4. Phương pháp khảo sát một số vấn đề liên quan đến phòng ngừa và phát hiện sớm ung thư cổ tử cung. Các yếu tố nguy cơ lây nhiễm HPV: - Dân tộc: biến định tính xác định thông qua giấy chứng minh nhân dân, có 2 giá trị: kinh; dân tộc thiểu số. - Khu vực sinh sống: biến định tính không liên tục, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: nông thôn; thị trấn, thị tứ; thành phố. - Thời gian sinh sống ở địa phương đến nay: biến định lượng không liên tục, tính bằng năm, sau đó mã hóa thành biến định tính, gồm 5 giá trị: nhỏ hơn 5 năm; từ 5 – 9 năm; từ 10 – 14 năm; từ 15 – 19 năm; từ 20 năm trở lên. - Tuổi: biến định tính không liên tục, tính hằng năm, xác định thông qua giấy chứng minh nhân dân, sau đó mã hóa thành biến định tính, có 4 giá trị: 18 – 19 tuổi; 20 – 29 tuổi; 30 – 39 tuổi; 40 – 60 tuổi. - Trình độ học vấn: biến số định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 5 giá trị: mù chữ; tiểu học; trung học cơ sở; trung học phổ thông; sau trung học phổ thông. - Nghề nghiệp: biến số định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 6 giá trị: công chức nhà nước; công nhân; nông dân; buôn bán; nội trợ; nghề khác. - Tình trạng hôn nhân: biến số định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 4 giá trị: có chồng; góa chồng; ly dị, ly thân; độc thân có quan hệ tình dục. - Tuổi bắt đầu quan hệ tình dục: biến định lượng không liên tục, tính bằng năm, xác định thông qua phỏng vấn, sau đó mã hóa thành biến định tính, có 3 giá trị: 15 - 19 tuổi; từ 20 - 29 tuổi; 30 – 39 tuổi; 40 – 60 tuổi. - Tuổi bắt đầu sinh con: biến định lượng không liên tục, xác định thông qua phỏng vấn, sau đó mã hóa thành biến định tính, có 4 giá trị: 15 – 19 tuổi; 20 – 29 tuổi; 30 – 39 tuổi; 40 – 60 tuổi. - Số lần sinh con: biến định lượng không liên tục, tính bằng số lần sinh, xác định thông qua phỏng vấn, sau đó mã hóa thành biến định tính, có 3 giá trị: chưa sinh; sinh 1- 2 lần; từ 3 lần trở lên.
- Tính chung thủy của người chồng: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, gồm 3 giá trị: chung thủy; không chung thủy; không biết. - Số bạn tình: biến định lượng không liên tục, tính bằng số người, xác định thông qua phỏng vấn, sau đó mã hóa thành biến định tính, có 2 giá trị: 1 người; từ 2 người trở lên. - Tình hình viêm nhiễm đường sinh dục, biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn. Có 3 giá trị: không; có ; dai dẳng. - Tình hình sử dụng bao cao su: biến định tính xác định thông qua phỏng vấn, gồm 3 giá trị: thường xuyên; không thường xuyên; không dùng. -Tình hình sử dụng thuốc tránh thai: biến số định tính, xác định thông qua phỏng vấn, gồm 4 giá trị: có; không; thường xuyên; không thường xuyên. - Tiền sử nạo hút thai: biến số định tính, xác định thông qua phỏng vấn, gồm 2 giá trị: có; không. - Tinh hình hút thuốc lá: biến số định tính, xác định thông qua phỏng vấn, gồm 4 giá trị: có; không; chồng hút; cả vợ và chồng cùng hút. + Không hút thuốc lá: chưa từng hút bất kỳ loại thuốc lá nào hoặc số điếu hút trong quảng đời nhỏ hơn 100 điếu và hiện đã bỏ thuốc ít nhất 12 tháng tính đến ngày nghiên cứu. + Hút thuốc lá: số điếu thuốc hút trong quảng đời từ 100 điếu trở lên và hiện đang tiếp tục hút thuốc lá hoặc đã bỏ thuốc nhưng kể từ thời điểm bỏ hút đến ngày nghiên cứu chưa đầy 12 tháng. - Tình hình sử dụng rượu bia: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn; gồm có 3 giá trị: không; có nhưng ít; có và sử dụng nhiều. Kiến thức của phụ nữ đối với HPV: - HPV gây bệnh gì: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 2 giá trị: bệnh về đường sinh dục, ung thư cổ tử cung..; không biết. - Đã từng nghe thông tin về HPV chưa: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 2 giá trị: chưa từng nghe; đã từng nghe rồi. - Nghe thông tin về HPV từ đâu: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: báo, đài, ti vi; pano, tờ rơi; từ nguồn thông tin khác. - HPV lây truyền qua đâu: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 5 giá trị: quan hệ tình dục; máu; ăn uống, vệ sinh; không biết; con đường khác...
- Có biết vaccine phòng bệnh do HPV gây ra không: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: có; không; không biết. - Lợi ích của việc tiêm vaccine HPV là: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: phòng bệnh do HPV gây ra; không có tác dụng; không biết. Thái độ của phụ nữ đối với HPV: - Hiểu biết mức độ nguy hiểm của bệnh do HPV gây ra: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: nguy hiểm; không nguy hiểm; không biết. - Mức độ quan tâm tới thông tin liên quan tới HPV: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 2 giá trị: không quan tâm; có quan tâm; rất quan tâm. - Thái độ về việc tiếp xúc với người bệnh do HPV gây ra: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: tiếp xúc bình thường; hạn chế tiếp xúc; không tiếp xúc. - Thái độ về việc phân biệt đối xử với người bệnh do HPV gây ra là có nên hay không: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: có; không; không biết. - Thái độ về việc xét nghiệm phát hiện HPV đối với phụ nữ trong độ tuổi sinh sản là có nên hay không: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: có; không; không biết. - Thái độ về việc tiêm vaccine phòng bệnh HPV là có nên hay không: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: có; không; không biết. Thực hành của phụ nữ trong độ tuổi sinh sản đối với HPV: - Tình hình vệ sinh bộ phận sinh dục: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 4 giá trị: thường xuyên; không thường xuyên; rất ít; ý kiến khác. - Tình hình khám phụ khoa định kỳ 6 – 12 tháng 1 lần: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: định kỳ; không định kỳ; chưa đi khám. - Việc xét nghiệm phát hiện HPV: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: đã xét nghiệm; chưa xét nghiệm; không cần thiết xét nghiệm. - Việc tiêm vaccine phòng bệnh do HPV gây ra: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: đã têm; chưa tiêm; không cần thiết. - Việc sử dụng các biện pháp phòng bệnh do HPV gây ra: biến định tính, xác định thông qua phỏng vấn, có 3 giá trị: có; chưa; ý kiến khác. 2.4.5. Phương pháp thu thập số liệu