Đề tài nghiên cứu khoa học: Đánh giá tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan của viên nang TD0024

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:53

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Đánh giá tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan của viên nang TD0024" được thực hiện với mục đích nhằm đánh giá tác dụng bảo vệ gan với tổn thương gan cấp gây ra bởi paracetamol (PAR) trên chuột nhắt trắng của viên nang TD0024; đánh giá tác dụng phục hồi tổn thương gan cấp gây ra bởi paracetamol (PAR) trên chuột nhắt trắng của viên nang TD0024. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài nghiên cứu khoa học: Đánh giá tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan của viên nang TD0024

TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TẾ THANH HÓA BỘ MÔN DƯỢC - YHCT CAO THÙY HÂN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ VÀ PHỤC HỒI TỔN THƯƠNG GAN CỦA VIÊN NANG TD0024 Chuyên ngành : DL - DLS Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thị Vân Anh HÀ NỘI – 2016
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
4 ĐẶT VẤN ĐỀ Gan là cơ quan chính của quá trình chống độc trong cơ thể. Các chất độc nội sinh sinh ra trong quá trình chuyển hóa được khử độc ngay tại gan. Gan còn được gọi là cửa ngõ đầu tiên với các chất ngoại nhập (xenobiotics) theo đường tiêu hóa. Suy gan làm tăng lắng động các chất độc nội ngoại sinh gây rối loạn nhiều chức phận trong cơ thể. Sức làm việc của gan rất lớn, gan đồng thời cũng là cơ quan dễ bị tổn thương nhất. Tổn thương gan do thuốc trong phòng và trị bệnh, do rượu, do các chất độc hại trong thực phẩm, các hóa chất nông nghiệp, các chất thải công nghiệp,…đang ngày càng gia tăng. Trong đó có viêm gan (VG) do nhiễm độc thuốc hoặc hóa chất rất thường gặp, đặc biệt viêm gan do dùng thuốc chống lao và paracetamol [10]. Ngoài ra, còn phải kể đến các loại virus (A, B, C, D…), vi khuẩn (E.coli, lao…), ký sinh trùng (sán lá gan) mà thường gặp nhất là viêm gan do virus (VGVR) chiếm 16,7% trên tổng số các case bệnh lý lâm sàng về gan. Theo Phạm Hoàng Phiệt, Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ của viêm gan B với khoảng 10 triệu người mang HbsAg [20], ước tính tỷ lệ tử vong có liên quan tới viêm gan B vào khoảng 48.000 người/năm [25]. Để điều trị viêm gan, chỉ có một số trường hợp dùng các thuốc đặc hiệu theo nguyên nhân, còn trong đa số trường hợp, thuốc làm tăng cường khả năng hồi phục và bảo vệ tế bào gan, nhất là các trường hợp VG chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (viêm gan do rượu, do thuốc hoặc các chất độc). VGVR có thể điều trị bằng các thuốc kháng virus (interferon – alpha, lamivudin, adefovir dipivoxil…) nhưng các thuốc này giá thành cao, nhiều tác dụng không mong muốn. Hơn nữa, đã xuất hiện dòng đột biến kháng lamivudin [25]. Hiện nay, có một số thuốc bảo vệ gan được dùng trong lâm sàng như silymarin (Legalon) nhưng chủ yếu nhập ngoại, giá thành cao, không phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người bệnh khi phải điều trị lâu dài [17]. Việc tìm kiếm và nghiên cứu những thuốc mới, đặc biệt là thuốc có nguồn gốc thực vật có tác dụng, ít độc, dễ dùng là một vấn đề thiết thực và mang tính thời sự. Ở nước ta, dược liệu có tác dụng phòng và chữa trị viêm gan khá phong phú. Tác dụng chủ yếu thường là thanh nhiệt, giải độc, hóa thấp, dưỡng can. Cũng bởi sự sẵn có dồi dào và những lợi ích thu được vì vậy việc sưu tầm, tìm kiếm, nghiên cứu các thuốc có tác dụng bảo vệ và phục hồi gan có nguồn gốc từ thực vật trở thành vấn đề cấp thiết hiện nay.
5 Từ kinh nghiệm dân gian cũng như các đề tài nghiên cứu thu được trong nhiều năm qua trong ở trong nước cũng như trên thế giới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và phục hồi tổn thương gan của viên nang TD0024. Đề tài được tiến hành với mục tiêu sau: 1. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan với tổn thương gan cấp gây ra bởi paracetamol (PAR) trên chuột nhắt trắng của viên nang TD0024. 2. Đánh giá tác dụng phục hồi tổn thương gan cấp gây ra bởi paracetamol (PAR) trên chuột nhắt trắng của viên nang TD0024. CHƯƠNG 1
6 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về gan Gan là cơ quan lớn nhất của cơ thể gồm 4 thùy chính. Mỗi thùy gan được chia thành nhiều tiểu thùy. Bên trong tiểu thùy, máu chảy qua các tế bào gan nhờ những xoang tĩnh mạch từ các nhánh của tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy. Máu của động mạch gan cũng chảy vào các xoang tĩnh mạch. Các tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy đổ vào tĩnh mạch gan. Mỗi tế bào gan cũng áp vào một số kênh mật gan thì hai ống hợp lại thành ống gan chung. Sau đó ống gan chung cùng với ống túi mật tạo thành ống mật chung đổ vào hành tá tràng qua lỗ Oddi có cơ thắt Oddi bao quanh [6]. 1.2. Chức năng sinh lý và sinh hóa của gan 1.2.1. Chức năng chuyển hóa các chất - Chuyển hóa glucid: Gan có tác dụng tổng hợp glycogen và chuyển hóa glycogen thành glucose để cung cấp cho cơ thể hoặc sau đó chuyển glucose thành acid glucuronic để tham gia vào quá trình khử độc của gan [2]. - Chuyển hóa lipid : Gan sản xuất muối mật để nhũ tương hóa lipid giúp cho việc tiêu hóa và hấp thu lipid qua thức ăn. Ngoài ra gan còn tham gia vào quá trình tổng hợp, thoái hóa lipid [2]. - Chuyển hóa acid amin - protein : Gan tổng hợp protein cho gan và máu. Vì vậy, nếu chức năng gan giảm sẽ làm nồng độ protein toàn phần trong huyết thanh, đặc biệt là albumin và tỷ số albumin/globulin giảm. Gan chứa nhiều acid glutamic và các enzym trao đổi amin như aspartat aminotransferase (AST) và alanin aminotransferase (ALT), do vậy quá trình trao đổi và khử amin xảy ra rất mạnh ở gan. Khi gan bị tổn thương, các enzym này tăng cao trong huyết thanh, nên ALT và AST huyết thanh là chỉ số để đánh giá tổn thương tế bào gan [2]. 1.2.2. Chức năng khử độc và tác dụng bảo vệ gan Chức phận khử độc của gan thực hiện theo 2 cơ chế khác nhau: cơ chế hóa học và cơ chế cố định thải trừ [2] [49]. - Cơ chế hóa học: Đây là cơ chế khử độc quan trọng nhất. Các chất độc bị gan giữ lại, theo sự biến đổi hóa học rồi nhanh chóng được đào thải ra ngoài. Gồm có 2 pha: + Pha I: những pha giáng hóa gồm phản ứng oxy hóa xảy ra ở microsom gan thông qua họ enzym cytochrom P450 (CYP). Họ enzym này được chứa thành nhiều dưới nhóm như CYP1A2, CYP3P4, CYP2B6, CYP2E1,… mà mỗi thuốc
7 hoặc chất độc được chuyển hóa nhờ các dưới nhóm khác nhau. Một isoenzym giữ vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa thuốc/ chất độc là CYP2E1. Trong số các thuốc/ chất được chuyển hóa qua CYP này có paracetamol (PAR) và carbon tetraclorid (CCl4) [51] CYP tham gia chuyển hóa các chất độc và chất lạ được biểu diễn tóm tắt theo phản ứng hóa học sau : X - H + NADPH + H+ + O2 X-OH + NADP + H2O Cơ chế tác dụng của hệ CYP là làm phơi bày những nhóm chức của các chất lạ hoặc chất độc để chúng phân cực hơn và nhạy cảm hơn đối với các enzym khử độc. Thuốc hoặc chất độc chuyển hóa qua pha I sẽ dễ tan trong nước hơn, giảm độc tính và tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II. Trong một số trường hợp đặc biệt, thuốc hoặc chất độc phải chuyển hóa qua gan mới có tác dụng hoặc tạo thành chất độc. Sau chuyển hóa qua CYP 2E1, cả PAR và CCl4 đều sản sinh ra các gốc tự do và chất chuyển hóa có hoạt tính gắn liền với quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào [51]. + Pha II: các chất đi qua pha này để trở thành những chất không có hoạt tính, có tính phân cực mạnh và tan tốt trong nước thải trừ ra ngoài. Pha II gồm những phản ứng liên hợp…Các phản ứng này cần năng lượng và cơ chế nội sinh [1]. Cơ chế cố định thải trừ: Trong cơ chế này, các chất độc được gan giữ lại rồi đào thải qua đường mật mà không bị biến đổi hóa học. Các chất độc được gan khử độc theo cơ chế này là các muối kim loại nặng (muối Cu, Pb,…) các chất màu (các dẫn chất phtalein) [2]. 1.2.3. Chức năng bài tiết mật: Mật được tiết ra từ những tế bào gan đưa xuống túi mật qua ống dẫn mật, để nhũ tương hóa lipid của thức ăn. Khi bài xuất mật xuống ruột, mật kéo theo rất nhiều chất độc được gan giữ lại và đào thải ra ngoài theo phân. Nếu gan bị tổn thương sẽ ảnh hưởng đến quá trình tạo và bài xuất mật, ảnh hưởng đến tiêu hóa, hấp thu lipid, các vitamin tan trong dầu và đào thải chất độc qua đường mật [2]. 1.2.4. Chức năng tạo và phá hủy hồng cầu Gan trong thời kỳ bào thai có khả năng tạo máu. Gan là nơi sản xuất protein, cần thiết cho việc cấu tạo nên hồng cầu, là nơi dự trữ sắt lớn nhất cho cơ thể. Gan
8 còn dự trữ vitamin B12, vitamin K và các yếu tố chống chảy máu A,B,C. Mặt khác, tổ chức võng nội mô của gan và lách là nơi phân hủy hồng cầu già [6]. 1.3. Bệnh viêm gan 1.3.1. Viêm gan cấp Viêm gan cấp do virus Viêm gan virus (VGVR) là bệnh phổ biến với sự lưu hành của các loại virus A, B, C, D, E và G. Với virus A và E thường gây thành dịch nhưng lành tính, ngược lại VGVR B, C, D tiến triển ầm ĩ dễ gây tình trạng mạn tính dẫn tới viêm gan mạn, xơ gan, ung thư gan với tỷ lệ cao. Mỗi năm trên thế giới có 2 triệu người chết bởi hậu quả suy gan cấp, xơ gan và ung thư gan do virus B gây nên. Bệnh gặp nhiều nhất ở các nước đang phát triển như Việt Nam, Ấn Độ …[34] [55]. Viêm gan cấp do thuốc Gan là nơi chuyển hóa rất nhiều loại thuốc. Sau khi chuyển hóa sẽ tạo thành những sản phẩm ít độc, tan được trong nước, có tính phân cực cao và được đào thải ra ngoài [1] [3] [12]. Tuy nhiên, có một số trường hợp chính chất mẹ có độc tính với gan: tetracyclin, hoặc độc tính do chất chuyển hóa ổn định và gây độc như 5 florouracin. Cũng có thể chuyển hóa thuốc tạo ra những chất có phản ứng mạnh tấn công trực tiếp vào tế bào gan, gây viêm gan, hủy hoại tế bào gan như paracetamol, isoniazid,…Paracetamol (PAR) là một thuốc hạ sốt, giảm đau được sử dụng phổ biến. Liều điều trị thông thường PAR không gây độc cho gan, nhưng khi dùng liều quá cao sẽ sinh ra nhiều N-acetyl p-benzoquinoneimin (NAPQI) là các chất gây tổn thương tế bào gan [1], [10], [54]. Theo thống kê tại Mỹ, viêm gan do dùng quá liều PAR chiếm khoảng 39% các trường hợp viêm gan cấp do thuốc. Ở Anh, ngộ độc PAR chiếm khoảng 35- 45% trường hợp ngộ độc do thuốc [51]. Ở Việt Nam, theo thống kê tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, ngộ độc thuốc hạ sốt, giảm đau trong 2 năm 1998-2000 chiếm 6,34% [29]. Trong 2 năm sau (2002-2003) Ngô Hữu Hà thống kê thấy tỷ lệ này tăng lên 12,2% và đứng thứ 3 trong các loại ngộ độc thuốc [10]. Viêm gan cấp do nhiễm độc: Thường gặp ở nhiễm độc thuốc trừ sâu, các hợp chất hydrocarbua đa vòng, phẩm nhuộm, nấm độc, nhiễm độc thực phẩm, điển hình là hóa chất công nghiệp carbua tetrclorid. Carbua tetraclorid (CCl4) không màu, dễ bay hơi, là một chất gây hủy hoại tế bào gan điển hình, được dùng nhiều trong mô hình gây tổn thương gan cấp để nghiên cứu về các thuốc có tác dụng bảo vệ gan. CCl 4 tạo thành các gốc tự do, gây phá hủy cấu trúc và chức năng của hệ thống lưới, làm tổn thương tế
9 bào gan [49], [55]. Mức độ tổn thương gan phụ thuộc vào liều lượng CCl 4, tổn thương tập trung chủ yếu ở vùng trung tâm tiểu thùy [63]. 1.3.2. Viêm gan mạn - Viêm gan mạn do virus: Có nhiều loại virus khác nhau gây nên viêm gan: A, B, C, D, E, G. VRVG B là nguyên nhân dẫn đến viêm gan mạn, xơ gan, ung thư gan, gây tử vong với tỷ lệ cao. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ viêm gan B cao nhất thế giới. Theo thống kê, tỷ lệ người mang bệnh là 17%, tuy trong những năm qua đã có tiêm phòng viêm gan B nhưng tỷ lệ mang bệnh vẫn cao [5], [8], [9], [45]. Viêm gan do virus C chiếm khoảng 2% trong các trường hợp VRVG, 55-85% bệnh nhân viêm gan C nếu không được chữa trị sẽ chuyển thành viêm gan mạn, nghiêm trọng hơn là 15% trong số này sẽ trở thành ung thư gan. Cơ chế bệnh sinh của viêm gan mạn là do virus liên quan đến quá trình đáp ứng miễn dịch, trong đó chủ yếu là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và sự tăng sinh của gốc tự do đã tạo ra các phản ứng oxy hóa dẫn đến tổn thương viêm và hoại tử tế bào gan [36], [44]. - Viêm gan mạn do thuốc hoặc hóa chất: Nguyên nhân thường gặp là do dùng một hoặc nhiều loại thuốc/chất độc với gan trong thời gian dài như trong điều trị lao, sốt rét, ăn thức ăn có chứa formon, … hoặc do nhiễm độc nghề nghiệp, do tiếp xúc với hóa chất độc hại hoặc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật không đúng phương pháp.Theo thống kê của trung tâm ADR quốc gia (2006) ADR do thuốc chống lao đứng thứ 2 chỉ sau ADR do kháng sinh, trong đã gặp nhiều trường hợp viêm gan do dùng phối hợp isoniazid với rifampicin [7]. - Viêm gan mạn do rượu: Nghiện rượu sẽ làm tăng khả năng nhiễm trùng, giảm khả năng khử độc của gan dẫn tới gan nhiễm mỡ, viêm gan và xơ gan. Tổn thương gan do rượu là do tăng quá trình peroxyd hóa lipid và giảm các chất chống oxy hóa [5], [36]. - Viêm gan mạn tính tự miễn: Là tình trạng mất hoặc giảm khả năng thích ứng miễn dịch của gan với chính các tổn thương của gan. Nguyên nhân và cơ chế chưa rõ, nhưng viêm gan tự miễn luôn có mặt các tự kháng thể (kháng thể kháng nhân, kháng thể kháng cơ trơn) và tăng gama globulin máu [5]. - Viêm gan tiềm tàng:
10 Một số trường hợp có biểu hiện tình trạng viêm gan mạn nhưng không thấy bất kỳ nguyên nhân nào. Nhưng với phương pháp chẩn đoán miễn dịch học và sinh học phân tử ngày càng chính xác thì viêm gan tiềm tàng ngày càng giảm do đã xác định được nguyên nhân [5]. 1.4. Một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương gan: 1.4.1. Nhóm enzym trao đổi amin (aminotransferase) Có 2 loại enzym được chú ý nhất là: - AST (aspartat aminotransferase) AST hay GOT (glutamat oxalat transaminase): là enzym có ở mọi mô nhiều hơn ở cơ tim, gan và cơ xương, một phần khu trú ở khu bào tương, 2/3 ở ty thể, còn được tìm thấy ở các cơ quan khác với nồng độ thấp (ty thể, lách, phổi,…) Dạng ty thể của AST tìm thấy chủ yếu ở gan, khi có tổn thương tế bào gan enzym này sẽ thoát vào máu và xúc tác cho phản ứng: AST L-aspartat + α-cetoglutarat Oxaloacetat + L-glutamat -ALT (alanin aminotransferase) ALT hay GPT (glutamat pyruvat transaminase): là enzym khu trú ở bào tương, đặc trưng cho các bệnh lý về gan vì có mặt nhiều nhất ở gan, rất ít ở tim và cơ vân. ALT xúc tác cho phản ứng: ALT L-alanin + α-cetoglutarat Pyruvat + L-glutamat - Cả 2 enzym này đều tìm thấy trong huyết thanh và trong một số dịch cơ thể: dịch mật, dịch não tủy,…không tìm thấy trong nước tiểu ( trừ khi có dấu hiệu suy thận). Nguồn gốc hai enzym này trong huyết thanh chủ yếu là từ tế bào gan [16]. -Ý nghĩa lâm sàng : ● Tăng từ 10 -100 lần so với bình thường hay gặp trong VGVR, hoại tử gan, viêm gan nhiễm độc, còn gặp trong suy tuần hoàn cấp hoặc trong nhồi máu cơ tim. Đặc biệt các enzym này tăng rất cao trong nhiễm độc CCl4, nhiễm độc rượu cấp có mê sảng hoặc ngộ độc PPHC. Thông qua hoạt động AST và ALT có thể đánh giá được mức độ tổn thương tế bào gan. Trong viêm gan, hoạt độ ALT tăng
11 cao hơn AST, tổn thương ở mức độ tế bào là chủ yếu. Khi hoạt độ AST tăng cao hơn ALT thì ngược lại, tế bào gan đã tổn thương ở mức dưới tế bào, vào tới ty thể. Chỉ số De Ristis (AST/ALT) cho ta đánh giá tổn thương ở mức tế bào hay dưới tế bào [16], [58]. ● Trong viêm gan mạn, xơ gan, AST và ALT chỉ tăng gấp 2-5 lần giá trị bình thường. Trong xơ gan do rượu và các nguyên nhân khác, AST tăng khoảng gấp 2- 4 lần, ALT tăng ít hơn và bắt đầu giảm so với AST, chỉ số De Ristis lớn hơn 1 và trên nữa [28]. 1.4.2. Cholesterol (CHO) Là thành phần lipid có nhân sterol, là chất rất quan trọng và cần thiết để tham gia cấu tạo màng tế bào, tham gia vào quá trình tổng hợp hormon steroid, vitamin D3 và các acid mật. Cholesterol toàn phần trong huyết thanh giảm là dấu hiệu của sự suy giảm chuyển hóa tế bào gan [16], [27]. 1.4.3. Albumin huyết tương Xét nghiệm định lượng albumin huyết tương có ý nghĩa để đánh giá chức năng của gan vì protein do gan tạo ra là albumin. Trong tổn thương gan, suy gan nặng, xơ gan, VGVR…làm giảm tổng hợp albumin. Bình thường albumin huyết tương = 38-54 g/l. 1.5. Các phương pháp điều trị viêm gan: Hiện nay, vẫn chưa có biện pháp điều trị đặc hiệu với viêm gan mạn tính. Đối với viêm gan mạn tính giai đoạn ổn định thì chế độ ăn và sinh hoạt hợp lý là quan trọng: ăn giàu năng lượng, vitamin, giảm mỡ, bỏ bia rượu, hạn chế lao động nặng quá sức. Viêm gan mạn tính giai đoạn tiến triển thì ngoài chế độ ăn, sinh hoạt hợp lý phải sử dụng thuốc phối hợp. Đối với viêm gan do virus, điều trị triệt để nguyên nhân gây bệnh bằng cách diệt virus, điều trị dự phòng biến chứng, giải quyết tình trạng viêm gan, dự phòng xơ gan và ung thư gan. Trong những năm gần đây, đã có một số thuốc chống virus (lamivudin, entercavir…) có hiệu quả, mở ra một hướng mới trong điều trị VGVR có tác dụng mạnh hơn interferon, ít tác dụng phụ hơn, dễ sử dụng hơn [25]. Trong viêm gan tiềm tàng, điều trị triệu chứng là chủ yếu vì chưa rõ căn nguyên. Điều trị viêm gan do thuốc/hóa chất độc hại ngoài việc loại bỏ các chất đó ra khỏi cơ thể, phải dùng kèm theo các thuốc phục hồi và bảo vệ tế bào gan. Các thuốc bảo vệ gan (hepatoprotective drugs) có thể tác dụng theo nhiều cơ chế như: - Hạn chế sự có mặt của các tác nhân gây bệnh bằng cách ngăn cản sự tạo thành các chất độc với gan của các chất hoặc thuốc khi đưa vào cơ thể.
12 - Dọn sạch các gốc tự do (một yếu tố tấn công và hủy hoại tế bào mạnh mẽ) khi các gốc tự do đã được hình thành. - Làm vững bền màng tế bào, giúp tế bào tăng sức chống đỡ với tác nhân gây bệnh. Hiện nay, có nhiều thuốc bảo vệ gan dùng trong lâm sàng như silymarin, Arginin- veyron, Livolin, …và nhiều thuốc y học cổ truyền khác [18], [19], [33]. 1.6. Tổng quan về phương pháp gây tổn thương gan thực nghiệm 1.6.1. Mô hình gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid CCl4 được sử dụng phổ biến trong các mô hình gây tổn thương gan cấp, mạn tính và ung thư gan do có thể gây thoái hóa mỡ, xơ gan, sinh ung thư và gây chết tế bào. CCl4 không trực tiếp gây độc cho gan, mà được chuyển hóa ở microsom gan, tạo thành các gốc tự do [47], [63]. Cơ chế: CCl4 khi vào cơ thể được chuyển hóa chủ yếu qua hệ CYP bởi isoenzym CYP2E1 ở lưới nội bào gan để tạo thành gốc tự do trichloromethyl (CCl3 •) CCl4 CCl3 • + Cl CCl3 • CCl3OO• CCl3 • kết hợp với oxy hình thành nên CCl3OO• là gốc tự do có hoạt tính mạnh, khởi đầu một chuỗi các phản ứng của quá trình peroxyd hóa lipid, phá hủy các acid béo không no, đặc biệt là các acid kết hợp với phospholipid (ở màng tế bào, ở màng lưới nội bào, ở màng ty thể). CCl 3 • gắn vào ADN là bước khởi đầu của quá trình ung thư gan. Qúa trình alkyl hóa protein và peroxyd hóa lipid màng tế bào, dẫn tới hủy hoại tế bào gan [49], [63], [65]. 1.6.2. Mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol (acetaminophen) Các con đường chuyển hóa của Paracetamol: Acetaminophen (PAR) Acetaminophen glucuronid CYP2E1 (CYP1A2, Phenolsulfo CYP3A4) transferase N-acetyl-p-benzoquino (NAPQI) Acetaminophen sulfat
13 Glutathion (GSH) Acetaminophen liên hợp glutathion Cystein, liên hợp mercapate Paracetamol được chuyển hóa tạo thành các chất không còn hoạt tính, chiếm 90% thông qua quá trình glucoru - hợp và sulfo - hợp. Chỉ có 5 - 15% được chuyển hóa qua CYP để tạo thành NAPQI là chất chuyển hóa gây độc với tế bào gan. Có 3 isoenzym của CYP tham gia chuyển hóa PAR là CYP 2E1, CYP1A2, CYP3A4, nhưng chủ yếu do CYP2E1. Vì vậy, các yếu tố ảnh hưởng đến enzym này đều ảnh hưởng tới lượng NAPQI được tạo ra. NAPQI là một chất độc với tế bào, nó gắn với protein của tế bào gan, gây viêm và hoại tử tế bào gan. Với liều điều trị, một lượng nhỏ NAPQI tạo ra sẽ liên hợp với glutathion - chất chống oxy hóa tự nhiên của cơ thể sẵn có trong gan để tạo thành hợp chất không độc và đào thải ra ngoài. Tuy nhiên, nếu tốc độ sinh NAPQI lớn hơn tốc độ khử độc bởi GSH trong gan thì NAPQI dư thừa sẽ oxy hóa các chất có trọng lượng phân tử lớn ở gan như protid, lipid, làm biến đổi nội môi, thay đổi tính thấm của màng tế bào với Ca ++, dẫn đến peroxyd hóa lớp lipid kép của màng tế bào, tạo ra các gốc tự do gây hủy hoại tế bào gan [49]. 1.6.3. Một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm và tác dụng của thuốc thử Đánh giá mức độ tổn thương gan trên mô hình thực nghiệm và tác dụng của thuốc thử thường thông qua việc xác định hoạt độ AST và ALT trong huyết thanh và quan sát tổn thương mô bệnh học. Ngoài ra để tìm hiểu cơ chế tác dụng của thuốc có liên quan đến cơ chế chống oxy hóa hay không, thường định lượng malondialdehyd (MDA) trong gan. Như đã trình bày ở mục 1.6.1 và 1.6.2 với 2 mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4 và PAR trong cơ chế đều có điểm chung là đều bị chuyển hóa qua CYP, chủ yếu là CYP2E1 để tạo thành các gốc tự do và các chất độc với gan (CCl 3 • và NAPQI). Chính các gốc tự do này sẽ phản ứng với lớp lipid kép của màng tế bào gây ra sự peroxy hóa lipid màng tế bào, từ đó gây tổn thương, hủy hoại tế bào gan. Có nhiều phương pháp được dùng trong nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Các phương pháp này dựa trên: 1. Sự xác định các sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid.
14 2. Sự nhận biết các gốc tự do trong chuỗi phản ứng. 3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của mô. Trong 3 nhóm trên, phương pháp xác định sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid (1) là đơn giản nhất. Malondialdehyd (MDA) là sản phẩm cuối cùng của quá trình oxy hóa lipid màng tế bào, do đó đánh giá nồng độ MDA trong gan có thể đánh giá được quá trình peroxy hóa lipid. Phương pháp này sử dụng acid thiobarbituric thường được áp dụng để xác định nồng độ MDA trong tổ chức tế bào, từ đó đánh giá khả năng chống oxy hóa invito hoặc invivo của chất nghiên cứu thông qua việc làm giảm hàm lượng MDA. 1.7. Các thuốc bảo vệ gan và tình hình nghiên cứu thuốc bảo vệ gan 1.7.1 Các thuốc bảo vệ gan tổng hợp và bán tổng hợp trên lâm sàng - Silymarin: là thuốc tổng hợp nguồn gốc thực vật được chiết từ quả cây cúc gai (Silybum marianum L. hoặc Carduus marianus L. họ cúc Asteraceae), từ thời văn minh cổ đại cây cúc gai đã được dùng làm thuốc hạ sốt, kích thích ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa, đến 1968 mới phát hiện ra flavonoid trong quả có tác dụng chống độc cho gan [18], [41]. + Silymarin bảo vệ màng tế bào, làm ổn định màng tế bào từ đó ngăn cản hấp thu một số chất độc vào tế bào gan. + Silymarin ức chế quá trình peroxy hóa lipid đồng thời có khả năng thu giữ các gốc tự do. + Silymarin chống xơ hóa, kích thích sinh tổng hợp protein, làm phục hồi nhanh chóng hệ enzym trong tế bào, phục hồi màng tế bào đã tổn thương và làm tăng quá trình phân bào, kích thích tái tạo tế bào [19]. - Arginin: chứa L-arginin HCl, dạng viên để điều trị những rối loạn chức năng có nguồn gốc từ gan hoặc những trường hợp ăn uống khó tiêu, dạng tiêm truyền để điều trị những bệnh lý não do gan [18]. Trên lâm sàng còn có arthionin, citrarginine, hepa-merz, các thuốc lợi và thông mật có nguồn gốc cổ truyền như: actiso, diệp hạ châu đắng, râu ngô…[18]. 1.8. Tổng quan về bài thuốc trong TD0024 Thuốc thử TD0024 của công ty cổ phần Sao Thái Dương. Được bào chế dưới dạng viên nang cứng. Có tác dụng ổn định men gan trong các trường hợp viêm gan cấp do rượu hoặc virus viêm gan siêu vi. Giúp bảo vệ và phục hồi chức năng các tế bào gan đang bị tổn thương. Tăng tái tạo các tế bào gan mới. Hiệu quả trong hỗ trợ điều trị xơ gan cổ trướng. 1.8.1. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.)
15 Thành phần dược liệu chính thứ nhất là Diệp hạ châu đắng, tên khoa học là Phyllanthus amarus Schum et Thonn, Thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae). Diệp hạ châu đắng thường mọc ở vùng nhiệt đới và được tìm thấy ở nhiều nơi khắp nước ta [26]. Theo đông y Diệp hạ châu vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh can lương huyết, lợi tiểu, sát trùng, giải độc. Ngoài ra, tác dụng giải độc gan và chữa viêm gan siêu vi B cũng đã được các nhà khoa học lưu ý từ những năm 1980. Nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật bản và Ấn độ cho biết họ đã phân lập được những hợp chất trong cây Diệp hạ châu là Phyllatin, hypophyllantin và triacontanal có khả năng chữa bệnh viêm gan. Lá Diệp hạ châu đắng chứa chất đắng là phyllathin. Lá khô chứa các chất đắng hypophyllanthin (0,05%), phyllathin (0,35%). Trong cây có niranthin, nirtetralin, phylteralin. Ngoài ra trong cây còn có lignan, flavonoid, alcaloid kiểu securinin như niruroidin, isobubialin, quercetin, quercitrin, isoquercitrin, astragalin, rutin; các acid hữu cơ như acid ascorbic, geraniinic, acid amariinic và repandusinic A. Sau đó, một báo cáo trên tạp chí Lancet vào năm 1988 cũng xác đinh tác dụng này. Theo báo cáo này, 2 nhà khoa học là Thyagarajan, S. P. và cộng sự đã dùng chế phẩm bào chế từ toàn cây DHCĐ (trừ rễ) trên bệnh nhân mang virus siêu vi B, với liều 200 mg trong 30 ngày. Trong tổng số 37 trường hợp điều trị cho kết quả 22 (59%) trong số 37 người đã đạt kết quả âm tính sau 30 ngày dùng DHCĐ [61]. 1.8.2. Lá cây Hoàn ngọc (Pseuderanthemun palatiferum (Nees) Radlk.) Thành phần dược liệu quí thứ hai trong TD0024 là cây Hoàn ngọc, tên khoa học là Pseuderanthemun palatiferum (Nees) Radlk., thuộc họ Ô rô (Acanthaceae). Hoàn ngọc còn được gọi với những cái tên khác như cây Xuân hoa, nhật nguyệt, cây con khỉ … - Thành phần hóa học: Theo sách Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam của nhóm tác giả Đỗ Huy Bích... Trần Toàn - Viện Dược liệu, do NXB Khoa học kỹ thuật ấn hành năm 2006 thì, cây Hoàn ngọc chứa sterol, flavonoid, đường khử, carotenoid, acid hữu cơ, 7 chất đã được phân lập, trong đó 4 chất là Phytol, β- sitosterol, hỗn hợp đồng phân Epimer của Stigmasterol và Poriferasterol. - Tác dụng dược lý: Qua nghiên cứu, các nhà khoa học nhận thấy cây Hoàn ngọc có các tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm; có hoạt tính thủy phân protein (nên
16 trong lâm sàng đắp lá tươi Hoàn ngọc làm tiêu mủ và làm tan sẹo lồi); tác dụng ức chế Monoaminoacydase (MAO) và tác dụng bảo vệ gan. Hoàn ngọc có tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa màng tế bào và bảo vệ tế bào gan, giải nhiệt, kháng khuẩn, giải độc, tăng cường thể lực và hỗ trợ tiêu hóa. Tác dụng bảo vệ gan của hoàn ngọc được nghiên cứu qua chế phẩm dùng cao toàn phần lá đã loại bỏ chlorophyl [26]. 1.8.3. Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba Hassk.) Cỏ nhọ nồi tên khoa học Eclipta alba Hassk. (Eclipta erecta Lamk.) thuộc họ Cúc (Asteraceae). Tính vị theo tài liệu cổ: vị ngọt, chua, tính lương vào hai kinh can và thận, tác dụng bổ thận âm, chỉ huyết lỵ. Thành phần hóa học: Có ít tinh dầu, tannin, chất đắng, caroten và chất alcaloid gọi là ecliptin. Cỏ nhọ nồi cũng giống như vitamin K có tác dụng chống lại tác dụng của discumarin, chống chảy máu tử cung trên động vật thí nghiệm. Cỏ nhọ nồi không gây tăng huyết áp, không làm giãn mạch, không độc. Theo y học cổ truyền, cỏ nhọ nồi có vị ngọt, chua, tính lương (mát huyết), chỉ huyết (cầm máu) vào 2 kinh can và thận, tác dụng bổ thận âm, thanh can nhiệt, làm đen râu tóc, chỉ huyết lỵ, dùng chữa can thận âm kém, xuất huyết nội tạng (chảy máu dạ dày, tiểu tiện ra máu, thổ huyết do lao, rong kinh), kiết lỵ, viêm gan mạn, chấn thương sưng tấy lở loét, mẩn ngứa… 1.8.4. Đương quy (Angelica sinensis (Oliv.) Diels,) Đương quy còn có tên khác là tần quy, vân quy, có tên khoa học là Angelica sinensis (Oliv.) Diels thuộc họ Hoa tán (Apiaceae). Quy là về, vì vị thuốc này có tác dụng điều khí, nuôi huyết, làm cho huyết đang loạn xạ trở về chỗ cũ do đó có tên là đương quy. Đương quy là một loại cây nhỏ, sống lâu năm, cao chừng 40- 80cm, thân màu tím có rãnh dọc. Theo đông y đương quy có vị ngọt, cay, tính ôn. Vào 2 kinh tâm, can, tỳ có tác dụng bổ huyết, hoạt huyết, nhuận táo, hoạt trường, điều huyết, thông quy. 1.8.5. Cao đậu tương lên men Isoflavones trong cao đậu tương lên men có nguồn gốc phytoestrogen thực vật thuộc nhóm các hợp chất flavonoid. Các isoflavones trong đậu nành ở dạng liên hợp glucosid như genistin, daidzin, glycitin, là hoạt chất có cơ chế hoạt động và chức năng gần giống như nội tiết tố estrogen nên các nhà khoa học còn gọi là estrogen thảo mộc (plant estrogene). Bên cạnh đó, Isoflavones còn được biết đến với vai trò là chất chống oxy hóa, chống lại các gốc tự do của cơ thể. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng isoflavones có đặc tính chống oxy hóa mạnh,
17 tương đương với các vitamin như vitamin A, C, E. Từ đặc trưng đó, isoflavones đã trở thành hoạt chất hữu hiệu trong việc cải thiện sức khỏe con người và phòng chống nhiều bệnh nguy hiểm, kể cả ung thư. 1.8.6. Nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các vị thuốc trong TD0024 Tác giả, năm Dược liệu nghiên cứu Kết quả Diệp hạ châu Thyagarajan S. P. Nghiên cứu tác dụng điều trị của Diệp đắng và cộng sự (1988) hạ châu với bệnh nhân mắc viêm gan (Phyllanthus [61] siêu vi B. amarus Schum et Thonn) Deepa V. Nanoemulsified dịch chiết của và cộng sự Pyllanthus amarus cải thiện tình trạng (2012) [37] nhiễm độc gan do CCl4 ở chuột nhắt trắng Wistar. Hoàn ngọc Nguyễn Thị Minh Nghiên cứu độc tính cấp và khả năng Thu và cộng sự ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng (1999) [21] tế bào, có xu hướng bảo vệ gan thực nghiệm của cao lá Hoàn ngọc . Cỏ nhọ nồi Thyagarajan S. P Nghiên cứu tác dụng của cỏ nhọ nồi với (Eclipta alba và cộng sự (1982) viêm gan virus. Hassk) CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 2.1.1. Thuốc nghiên cứu: TD0024 Thành phần trong 1 viên nang cứng: + Lá cây Hoàn ngọc 1,86g + Diệp hạ châu đắng 0,93g + Cỏ nhọ nồi 0,93g + Đương quy 0,19g + Cao đậu tương lên men 0,042g + Tá dược vừa đủ 1 viên
18 Các thành phần được chế thành cao và phối hợp vào viên nang TD0024. Liều dùng trên lâm sàng: người lớn 4viên/ ngày. 2.1.2. Thuốc, dụng cụ, máy móc và hóa chất phục vụ nghiên cứu: - PAR dạng viên nén, hàm lượng 500mg - Silymarin (biệt dược Legalon) dạng viên nén, hàm lượng 70mg của Madaus (Korea) - Kít định lượng các enzym và chất chuyển hóa trong máu: AST (apartat aminotransferase), ALT (alanin aminotranferase), bilirubin toàn phần, cholesterol, albumin, creatinin của hãng DIALAB GmbH (Áo) - Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX – Diagnostics. - Các hóa chất làm tiêu bản mô bệnh học do bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại Học Y Hà Nội cung cấp. - Máy xét nghiệm huyết học Vet abc TM animal Blood Counter - Máy xét nghiệm sinh hóa máu Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy), Máy quang phổ Elisa Lx800 (Mỹ) 2.2. Động vật thực nghiệm - Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng 25,0 ± 2,0 gam (để nghiên cứu tác dụng bảo vệ, phục hồi tổn thương gan) và trọng lượng 20 ± 2,0 gam (để nghiên cứu độc tính cấp) do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. - Chuột cống trắng chủng Wistar, cân nặng 200 ± 20g (để nghiên cứu độc tính bán trường diễn) do Trung tâm cung cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng – Hà Tây cung cấp. - Động vật được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại phòng thí nghiệm từ 5-7 ngày tại Bộ môn Dược lý – Đại Học Y Hà Nội. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan [40], [59], [60] Chuột nhắt trắng, được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (đối chứng): uống nước cất, 0,2 ml/10 g - Lô 2 (mô hình): uống nước cất 0,2ml/10g + PAR 400mg/kg - Lô 3 (chứng dương): uống silymarin 140mg/kg + PAR 400mg/kg - Lô 4: uống TD0024 liều tương đương lâm sàng (hệ số ngoại suy 12 ) viên/kg/ngày + PAR
19 - Lô 5: uống TD0024 liều gấp 3 lần liều tương đương lâm sàng (hệ số ngoại suy 12) + PAR Chuột được cho uống thuốc thử hoặc nước cất liên tục vào các buổi sáng trong 8 ngày. Đến ngày thứ 8, sau khi uống thuốc thử 2h (chuột được nhịn đói 16-18h trước đó), tiến hành gây tổn thương tế bào gan bằng cách cho chuột từ lô 2 đến lô 5 uống paracetamol liều 400mg/kg. Sau 48h gây độc bằng paracetamol, lấy máu động mạch cảnh chuột để đo hoạt độ enzym AST, ALT, đồng thời lấy gan và cân trọng lượng gan, xác định hàm lượng MDA. Quan sát hình ảnh đại thể của gan ở các lô chuột và làm giải phẫu mô bệnh học gan của 30% số chuột mỗi lô. 2.3.2. Nghiên cứu tác dụng phục hồi tổn thương gan [43], [59], [60]. Chuột nhắt trắng chủng Swiss được chia ngẫu nhiên thành 10 lô, mỗi lô 10 con. * Bước 1: Gây mô hình tổn thương gan cấp bằng paracetamol Gây tổn thương gan chuột bằng cách cho chuột uống paracetamol (PAR) liều 400mg/kg với thể tích 0,2mL/10g. * Bước 2: Thử tác dụng của TD0024 Sau khi uống PAR 2 giờ, cho chuột uống dung môi hoặc thuốc tương ứng với từng lô trong 4 ngày liên tục. - Lô 1 (đối chứng): uống nước cất. - Lô 2 (mô hình): uống nước cất + PAR - Lô 3 (chứng dương): uống silymarin 140mg/kg + PAR - Lô 4: uống TD0024 liều tương đương lâm sàng (hệ số ngoại suy 12) + PAR - Lô 5: uống TD0024 liều gấp 3 liều tương đương lâm sàng (hệ số ngoại suy 12) + PAR Sau 4 ngày uống thuốc, giết chuột, lấy máu động mạch cảnh để định lượng các enzym AST, ALT, lấy gan để xác định trọng lượng, quan sát hình ảnh tổn thương đại thể. Lấy gan ở các lô để xác định nồng độ MDA. MDA được định lượng thông qua phản ứng với acid thiobarbituric: MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid. Khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức hợp màu hồng hấp thụ cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 – 3, ở nhiệt độ 90 – 100 0C trong vòng 10 – 15 phút. Sau 4 ngày uống thuốc, kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan ở 30% số chuột ở mỗi lô. 2.3.3. Xử lý số liệu Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê y sinh học theo t- test - Student và test trước sau (Avant-après). Biểu diễn ± SD. Số liệu được xử lý
20 theo thuật toán thống kê y sinh học với sự hỗ trợ của chương trình phần mềm Microsoft Office Excel 2007 Kiểm định sự khác biệt của 2 giá trị trung bình bằng test T student. */∆: p < 0,05 : độ tin cậy 95% **/∆∆: p < 0,01 : độ tin cậy 99% ***/∆∆∆: p < 0,001 : độ tin cậy 99,9% p > 0,05 : không có ý nghĩa thống kê *: so với lô mô hình ∆: so với lô chứng **: so với lô mô hình ∆∆: so với lô chứng ***: so với lô mô hình ∆∆∆: so với lô chứng CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của TD0024 3.1.1. Trọng lượng gan, hoạt độ enzym gan và chỉ số MDA trong gan chuột. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của TD0024 lên trọng lượng gan chuột Lô nghiên Mức giảm so Trọng lượng gan p so lô p so lô mô cứu lô mô hình (g/10g thể trọng) chứng hình (%) Lô 1 0,58 ± 0,08 Lô 2 0,69 ± 0,08 p0,05 p>0,05 7,2