Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy saponin trong sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:137

Thêm vào BST

Báo xấu

48
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm cải tiến môi trường, điều kiện nuôi cấy, hệ thống nuôi cấy, kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng (môi trường hai lớp lỏng-rắn) và hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài Sâm quý này góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống loài Sâm đặc hữu của Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy saponin trong sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ELICITOR, HỆ THỐNG LED CẢI TIẾN, MÔI TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG, TẠO CỦ VÀ TÍCH LŨY SAPONIN TRONG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Kim Ngân MSSV: 1411100609 Lớp: 14DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2018
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố và hệ thống LED lên quá trình nhân nhanh sinh khối, tích lũy saponin in vitro của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Trịnh Thị Lan Anh. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong đề tài này là trung thực chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đề tài đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Kim Ngân
ii LỜI CẢM ƠN Warren Buffett cũng đã từng nói rằng: “Nếu muốn đi nhanh hãy đi một mình, nếu muốn đi xa hãy đi cùng nhau”. Câu nói ấy quả thật không sai, trong suốt quá trình hoàn thành đề tài của mình, em đã được sự quan tâm chăm sóc và dạy dỗ từ Cô TS. Trịnh Thị Lan Anh. Em xin chân thành và trân trọng cảm ơn sự ân cần dạy bảo và những yêu thương mà cô dành cho em, cũng như là các thế hệ sinh viên. Cảm ơn cô vì cô không chỉ là người giảng viên đầy tâm huyết đã cho em hành trang kiến thức vững vàng để vững bước trên con đường nghiên cứu khoa học, mà cô còn yêu thương em như người thân trong một gia đình, luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em để em sống trọn vẹn với cái tuổi đôi mươi tại giảng đường đại học. Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô, các Anh Chị nhân viên phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ cho em trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này. Có người từng nói: “Đời cho ta bao lần đôi mươi”. Tuổi đôi mươi là lứa tuổi đẹp nhất của mỗi người trong chúng ta. Tuổi đôi mươi của em thật đẹp khi là sinh viên ngành Công nghệ sinh học của Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ HUTECH. Trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại giảng đường đại học dưới sự chỉ dạy tận tình và được sự hỗ trợ nhiệt tình từ các thầy cô, em đã được học tập và cháy hết mình với lứa tuổi đôi mươi của mình trog các hoạt động tại Viện, tại Trường. Em xin chân thành cảm ơn bạn Thảo và em Hải đã hỗ trợ tận tình và giúp đỡ em như người thân trong gia đình. Và để có được thành công của ngày hôm nay, có em của ngày hôm nay thì không thể không nhắc đến tình yêu thương và sự ủng hộ từ phía gia đình. Gia đình đã là hậu phương vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn, thử thách trong cuộc sống và tiếp thêm nghị lực cho con. Con cảm ơn Ông Bà ngoại, Ba Mẹ và Cậu đã dạy dỗ, dìu dắt con từ khi chập chững bước đi cho đến khi lớn khôn thành người, luôn cho con những điều tốt nhất. Công ơn trời biển và tình yêu thương vô bờ bến của gia đình là món quà lớn nhất và quý giá nhất mà con được nhận. Con xin biết ơn gia đình vì đã luôn bên cạnh, ủng hộ và động viên con trên mỗi bước đường mà con đã chọn.
iii Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình thực tập, hoàn thiện đề tài này em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ quý thầy cô. TP. Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Kim Ngân
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN....................................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................................ ii MỤC LỤC .................................................................................................................................. iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................................... ix DANH MỤC BẢNG .................................................................................................................. xii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................................. 1 1.2. Tầm quan trọng của đề tài .................................................................................................... 1 1.3. Ý nghĩa của đề tài ................................................................................................................. 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................................... 3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................................... 3 1.4. Lý do chọn đề tài .................................................................................................................. 4 2. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................................ 4 3. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................................. 6 4. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................................ 7 5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 8 6. Các kết quả đạt được của đề tài ........................................................................................... 8 7. Kết cấu của đề tài................................................................................................................... 9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 10 1.1. Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor ........................................................................... 10 1.1.1. Khái niệm vi nhân giống ................................................................................................... 10 1.1.2. Các chất cảm ứng – Elicitor .............................................................................................. 10 1.1.2.1. Than hoạt tính ................................................................................................................. 11 1.1.2.2. Saccharose ...................................................................................................................... 12 1.1.2.3. Bạc nitrate ....................................................................................................................... 13 1.1.3. Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc ......................................................................................... 13 1.1.4. Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống .......................................................................... 15 1.1.4.1. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật......................................... 15
v 1.1.4.2. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật............... 16 1.1.4.3. Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro .............................................................. 18 1.1.4.4. Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay ........................... 19 1.1.5. Đèn LED (Light Emitting Diode) ...................................................................................... 22 1.1.5.1. Giới thiệu đèn LED ........................................................................................................ 22 1.1.5.2. Ưu, nhược điểm của đèn LED ........................................................................................ 23 1.1.5.3. Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED trong nuôi cấy in vitro .................................................................................................................. 24 1.1.5.4. Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở Việt Nam .............. 27 1.1.6. Ánh sáng đối với thực vật .................................................................................................. 28 1.1.6.1. Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật .................................... 28 1.1.6.2. Vai trò của ánh sáng đến quá trình tích lũy các chất hữu cơ đối với thực vật................ 30 1.2. Phương pháp định tính và định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 33 1.2.1. Định tính saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng phương pháp Sắc ký lớp mỏng ........................................................................................... 33 1.2.2. Định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................................ 34 1.3. Sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................. 37 1.3.1. Giới thiệu sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............. 37 1.3.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................................. 38 1.3.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển ................................................................................... 39 1.3.4. Đặc điểm phân bố .............................................................................................................. 40 1.3.5. Nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)............................. 40 1.3.5.1. Nhân giống từ hạt ........................................................................................................... 40 1.3.5.2. Nhân giống in vitro ......................................................................................................... 42 1.3.6. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 42 1.3.6.1. Thành phần hóa học........................................................................................................ 42 1.3.6.2. Tác dụng dược lý ............................................................................................................ 43
vi 1.3.7. Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 45 1.3.7.1. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trên thế giới .......................................................................... 45 1.3.7.2. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam ........................................................................... 46 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 50 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài .................................................................................. 50 2.1.1. Địa điểm ............................................................................................................................ 50 2.1.2. Thời gian ............................................................................................................................ 50 2.2. Vật liệu ................................................................................................................................. 50 2.2.1. Nguồn mẫu ........................................................................................................................ 50 2.2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy...................................................................................... 50 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................................ 51 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 51 2.3.1. Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn .......................................................... 53 2.3.2. Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp ................................................... 54 2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................................... 55 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ...................................... 55 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................... 55 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................... 56 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................... 57 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ- vàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................................ 58
vii 2.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ................................................................................................................. 59 2.4.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hai lớp (kiểu bổ sung các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ................................................... 60 2.5. Hình thái giải phẫu củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro......... 62 2.6. Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của quá trình nuôi cấy in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp ............... 62 2.6.1. Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ................................ 62 2.6.2. Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) ............................................................. 63 2.7. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................................... 64 2.8. Thống kê và xử lý số liệu ..................................................................................................... 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 65 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................... 65 3.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................... 68 3.3. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................................ 71 3.4. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................ 74 3.5. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................... 76 3.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .............. 80 3.7. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................................ 82
viii 3.8. Hình thái Giải phẫu củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .............................................................................................................................. 88 3.9. Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng ............................................................................. 90 3.10. Định lượng saponin trong củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................... 90 KẾT LUẠN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................... 94 PHỤ LỤC
ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC Than hoạt tính BA Benzyladenine BAP 6-Benzyl Amino Purin DNA Deoxyribonucleic Acid GA3 Acid gibberellic HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng cao áp IAA Acid b-Indolyacetic IBA Acid b-Indolybutyric IFR Cường độ ánh sáng đỏ xa IR Cường độ ánh sáng đỏ KH2PO4 Monopotassium phosphate KH&CN Khoa học công nghệ Kin Kinetin LED Light-Emmitting Diode MS Murashige và Skoog, 1962 NAA Acid a-naphtaleneacetic NaClO Sodium hypocloride SH Schenk và Hildebrandt (1972) TDZ Thidiazuron TLC Sắc ký lớp mỏng UFLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao siêu nhanh WPM Woody Plant Medium 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid
x DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet) ............................................................... 15 Hình 1.2. A. Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp; B. Sự hấp thu ánh sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn Internet) ................................................................................................................... 17 Hình 1.3. Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED. a. Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70% LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b. LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam, 2012) ........................................................................................................................ 22 Hình 1.4. Hệ thống nuôi cấy LED truyền điện không dây (Wireless power transfer – LED uni-Pack (WPT - LP)). a. Thiết bị phát; b. Thiết bị thu; c.d. Hoạt động của hệ thống (Nguyễn Bá Nam, 2012)................................................................................ 27 Hình 1.5. Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng................................................................. 34 Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC................................................ 36 Hình 1.7. Hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC ......................................................... 36 Hình 1.8. Cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (Nhut et al., 2011) ....... 37 Hình 1.9. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nguồn Internet).................. 38 Hình 2.1. Mô hình thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn a. Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ ........................... 53 Hình 2.2. Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn sau khi thiết kế và thi công. a. Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ ....... 53 Hình 2.3. Mô hình hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED kết hợp a. 100% LED đỏ (ĐC); b. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d. 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương ............................ 54 Hình 2.4. Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp sau khi thiết kế và thi công. a. Tỷ lệ chiếu sáng 100% LED đỏ (ĐC); b. Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c. Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d. Tỷ lệ 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương ....................................................................... 54 Hình 3.1 Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. A0,
xi A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 g/L ....................................................................... 67 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. B0, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 tương ứng với nồng độ saccharose lần lượt là 30; 40; 50; 60; 70; 80 g/L........................................................................... 70 Hình 3.3. Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. C0, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ AgNO 3 lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 mg/L ...................................................................... 73 Hình 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. D0, D1, D2, D3, D4 tương ứng với với nguồn sáng là đèn huỳnh quang; LED trắng; LED vàng; LED xanh dương; LED đỏ .............................................. 75 Hình 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. G0, G1, G2, G3 tương ứng với với các tỷ lệ 100% đỏ; 50% đỏ:50% vàng; 50% đỏ:50% xanh dương và 50% vàng:50% xanh dương .......................... 79 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 3 tuần nuôi cấy. L0, L1, L2 tương ứng với trạng thái nuôi cấy là rắn (agar), lỏng tĩnh, lỏng lắc ...................................................................................... 81 Hình 3.7. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ............................................................................... 83 Hình 3.8. Ảnh chụp hiển vi soi nổi hình thái cây và củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy ................................... 87 Hình 3.9. Cấu tạo củ Sâm Ngọc Linh Ngọc in vitro sau 16 tuần nuôi cấy............................ 88 Hình 3.10. Ảnh chụp hình thái giải phẫu dưới kính hiển quang học củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy; a) Lát cắt dọc chồi mọc từ củ; b) Lát cắt ngang củ; c1) Lát cắt ngang mô củ, c2) Hình thái tế bào
xii mô củ, c3) Mô củ với tế bào nhân bắt màu hồng đậm (mũi tên), c4) Hình thái bó mạch trong lát cắt dọc củ .................................................................................. 89 Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức ĐC (nuôi cấy trên môi trường agar một lớp: không than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ................................................ 91 Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức E8 (nuôi cấy trên môi trường 2 lớp lỏng-rắn: có than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ................................................ 91
xiii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật (Trần Thị Hồng Thúy, 2014) .................................................................................................. 18 Bảng 1.2. Thành phần hoá học chung của Sâm Ngọc Linh .................................................... 43 Bảng 1.3. So sánh thành phần và hàm lượng của saponin trong Sâm Ngọc Linh và các loài Sâm nhóm 1 .................................................................................................... 44 Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 55 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 56 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................... 57 Bảng 2.4. Ảnh hưởng ánh sáng LED đơn đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 58 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED cải tiến hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏ- xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 59 Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................................................................................ 60 Bảng 2.7. Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ........................................................ 61 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy .. 65 Bảng 3.2. Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy.......................................................................................................................... 68 Bảng 3.3. Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy ......... 71 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy ................................................................................................................. 74
xiv Bảng 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy ................................................................................................................. 77 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 3 tuần nuôi cấy ................................................................................. 80 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường hai lớp đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy..................................................................................................... 82 Bảng 3.8. Kết quả phân tích HPLC hàm lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy khi khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy ................................................................................................................. 78
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài 1.1. Đặt vấn đề Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Chữ Panax xuất phát từ chữ Panacea trong tiếng Hy Lạp, có nghĩa là thuốc trị bá bệnh, thần dược. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một loài Sâm đặc hữu của Việt Nam được biết đến từ năm 1973. Tại hội nghị quốc tế về Sâm, loài Sâm này được xếp vào nhóm Sâm quý trên thế giới cùng với Sâm Triều Tiên (Panax ginseng), Sâm Mỹ (Panax quinquefolium),… (Phai et al., 2002). Sâm Ngọc Linh là một trong những cây dược liệu quý cần được bảo tồn, có tên trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [25]. Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin, 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng và 0,1% tinh dầu. Sâm Ngọc Linh có hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12 – 15%) và lượng saponin triterpenoidoid nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới (Le Thi Hong Van et al., 2015). Qua nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới đã thấy rằng Sâm Ngọc Linh không chỉ có các tác dụng dược lý đặc trưng của chi Nhân Sâm mà còn có những tác dụng dược lý điển hình như chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa, chống ung thư và tăng cường hệ miễn dịch (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007). Với những đặc điểm đó, Sâm Ngọc Linh không chỉ là loài Sâm quý của Việt Nam mà còn là của thế giới. 1.2. Tầm quan trọng của đề tài Sâm Ngọc Linh là một cây dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao của Việt Nam (40 – 100 triệu VNĐ/kg). Từ đầu tháng 10/2017, Ủy Ban Nhân Dân huyện Nam Trà My (Quảng Nam) đã chính thức mở phiên chợ Sâm Ngọc Linh nhằm góp phần tìm ra giải pháp duy trì, bảo tồn và phát huy giá trị Sâm Ngọc Linh theo Chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 do Thủ tướng Chính Phủ phê duyệt. Tại phiên chợ Sâm Ngọc Linh lần thứ 6 được tổ chức vào đầu tháng 3/2018, Sâm Ngọc Linh có giá bán từ 85 triệu/kg [79]. Từ khi phát hiện năm 1973 đến 1995 thì loài này đã bị khai thác cạn kiệt và đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng mất nguồn gene quý hiếm (Trần Công Luận, 2003). Đến nay, quần thể Sâm Ngọc Linh tự nhiên đang bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới nguy cơ tận diệt do nhu cầu của thị trường dược liệu ngày càng tăng cao. Ngày 12/9/2015, Phó
2 Thủ tướng Chính phủ Vũ Đức Đam đã phê duyệt Đề án bảo tồn và phát triển cây Sâm Ngọc Linh (Sâm Việt Nam) đến năm 2030 trị giá 9.500 tỷ đồng nhằm bảo vệ nguồn gene quý, kết hợp bảo vệ và phát triển nguồn nguyên liệu Sâm góp phần xóa đói giảm nghèo, phát triển kinh tế - xã hội (nguồn Internet). Hoàng Hải Anh và cộng sự (2011) đã báo cáo rằng Sâm Việt Nam nuôi cấy mô cũng có các saponin chính tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 và M-R2. Tuy hàm lượng tổng cộng các saponin chính trong Sâm Việt Nam nuôi cấy mô chưa cao (0,3% so với 12,96% trong Việt Nam thiên nhiên). Việc nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình nuôi cấy mô cây Sâm Ngọc Linh cung cấp nguồn cây Sâm giống cho trồng trọt và sử dụng để thay thế Sâm thiên nhiên, đã mở ra một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu cây Sâm Ngọc Linh: chủ động được nguồn nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc và các sản phẩm thực phẩm chức năng. Từ trước đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô ở đối tượng cây Sâm Ngọc Linh chưa nhiều vì đây là loài Sâm đặc hữu của Việt Nam. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, chuyển gene, chủ yếu là nghiên cứu tạo mô sẹo, phát sinh phôi, nuôi cấy rễ tóc, thu sinh khối trong bioreactor, các kết quả đạt được là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn. Đặc điểm của Sâm Ngọc Linh là tăng trưởng rất chậm, yêu cầu sinh thái khắt khe, việc nghiên cứu về tạo củ in vitro vẫn chưa nhiều, chưa có nghiên cứu nào báo cáo về kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp lỏng-rắn) lên sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin ở cây Sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến quá trình sinh trưởng của Sâm Ngọc Linh chỉ có một vài báo cáo được công bố, các nghiên cứu cũng đã cho thấy rằng Sâm Ngọc Linh được nuôi cấy in vitro có thành phần hóa học tương tự như Sâm Ngọc Linh tự nhiên tuy nhiên với hàm lượng thấp, thậm chí một số chất chỉ được phát hiện ở dạng vết, một số chất chưa được phát hiện trong Sâm nuôi cấy in vitro. Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng các elicitor có tác động tích cực đến sự tăng trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở thực vật. Tuy nhiên, đối với từng loại thực vật và mục đích nuôi cấy, việc lựa chọn loại và nồng độ các elicitor phải được xem xét kỹ lưỡng. Đây là một loài dược liệu vô cùng quý giá, việc hoàn
3 thiện quy trình nhân giống và gia tăng hàm lượng dược chất quý hiếm là điều mà nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và được Chính phủ chú trọng phát triển nguồn cây trồng quốc gia. Trong đó, nghiên cứu tạo củ in vitro, kích thích tăng trưởng, rút ngắn thời gian nhân giống, tăng sức sống của cây con nhằm tạo được số lượng lớn cây giống khỏe mạnh, tăng tỷ lệ sống sót khi chuyển ra vườn ươm là điều vô cùng cấp thiết. 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài sẽ giúp hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sẽ cung cấp những cơ sở khoa học cho công tác nhân giống in vitro cây trồng nói chung và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nói riêng. Cung cấp cơ sở khoa học cho bảo vệ nguồn gen cây Sâm Ngọc Linh là một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay. Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống LED cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của đèn LED đến nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh in vitro. Đề tài sẽ cung cấp những tài liệu khoa học về Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), thuộc chi Panax. Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu khoa học về loài Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng quy trình nhân nhanh Sâm Ngọc Linh thông qua khảo sát các chất yếu tố ảnh hưởng đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm nhân nhanh với số lượng lớn, hạ giá thành cây giống, góp phần bảo tồn nguồn gene cây thuốc quý. Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED đến sự sinh trưởng của cây Sâm Ngọc Linh là cơ sở đánh giá khả năng ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro cây trồng nói chung và Sâm Ngọc Linh nói riêng, hướng tới tìm nguồn ánh sáng thích hợp thay thế đèn huỳnh quang và các loại đèn đang dùng trong nuôi cấy Sâm Ngọc Linh hiện nay, là cơ sở
4 giúp hạ giá thành sản phẩm cây Sâm Ngọc Linh giống. Hoặc định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng của đèn LED đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.4. Lý do chọn đề tài Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là loài Sâm đặc hữu của Việt Nam đã được nghiên cứu về thực vật học, dược tính, thành phần hóa học. Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy đây là loài dược liệu quý giá và được xem là một trong những phát hiện quan trọng bậc nhất trong lĩnh vực y dược. Việc nhân giống Sâm Ngọc Linh còn gặp nhiều khó khăn do đây là loài đặc hữu của Việt Nam, yêu cầu sinh thái rất khắt khe, tăng trưởng rất chậm và chỉ trồng được ở các khu vực quanh đỉnh núi Ngọc Linh (thuộc địa phận hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam). Thời gian trồng trọt phải kéo dài từ 6 đến 7 năm mới có thể thu hoạch (do củ cần nhiều thời gian để tích lũy các hợp chất sinh học quý giá). Các nghiên cứu về loài Sâm này chưa nhiều, chưa có một quy trình nhân giống hoàn chỉnh phổ biến được chuyển giao công nghệ. Đây là loài dược liệu đắt tiền bậc nhất, nhu cầu thị trường rất cao, khai thác cạn kiệt và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng. Đang được Chính phủ quan tâm và chú trọng đầu tư phát triển. Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh nhằm mục đích cải tiến môi trường, điều kiện nuôi cấy, hệ thống nuôi cấy, kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng (môi trường hai lớp lỏng-rắn) và hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài Sâm quý này góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống loài Sâm đặc hữu của Việt Nam. 2. Tình hình nghiên cứu Hiện nay, cây Sâm Ngọc Linh là đối tượng đang rất được quan tâm và chú ý nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình nhân giống nhanh, rút ngắn được thời gian sinh trưởng so với cây Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên mà vẫn đảm bảo được hàm lượng các dược chất quý giá vốn có như saponin triterpenoid, ginsenoside để đảm bảo được nhu cầu tiêu dùng của thị trường. Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu như Hoàng Văn Cương
5 (2012) đã chứng minh ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy saponin thông qua quá trình nuôi cấy mô sẹo và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro. Nguyễn Thị Liễu và cộng sự (2011) đã tạo được rễ bất định của Sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Hà Thị Loan (2014) đã sử dụng Agrotobacterium rizogenes chứa gene rol cảm ứng tạo rễ tóc. Kết quả cho thấy rễ tóc được nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc sinh trưởng tốt và có sự hiện diện của 3 hoại chất saponin đặc trưng trong Sâm Ngọc Linh. Nuôi cấy rễ tóc với những ưu điểm vượt bậc đã được khẳng định là sinh trưởng mạnh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, bền vững về mặt di truyền và có khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng cây mẹ giúp giảm được những ảnh hưởng không mong muốn đến sức khỏe người tiêu dùng và nâng cao tính an toàn của sản phẩm, mở ra giải pháp mới cho sản xuất saponin ở quy mô công nghiệp. Mai Trường và cộng sự (2014) đã thành công trong việc tạo và nhân phôi soma Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng. Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu quá trình cứu hình thái của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Trước nhu cầu rất lớn về Sâm Ngọc Linh dùng để làm thuốc, thực phẩm chức năng của các công ty dược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã chuyển hướng nghiên cứu nhân nhanh giống Sâm Ngọc Linh in vitro. Trong nhân giống in vitro thực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của thực vật. Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự sinh trưởng và năng suất của cây. Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến trong nhân giống in vitro hiện nay là đèn huỳnh quang. Mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang đều tỏa nhiệt, lại phải tiêu tốn thêm một phần điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đèn này gây ra. Theo Dương Tấn Nhựt (2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho thắp sáng trong phòng nuôi cây và khoảng 25% để làm mát phòng nuôi. Do đó, sự phát triển