Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:102

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định nồng độ BA và NAA thích hợp nhất lên khả năng tạo chồi lan Cattleya Hybrid White; đánh giá hoạt tính kích thích tạo chồi khi bổ sung chitosan trong môi trường nuôi cấy mô cây lan Cattleya Hybrid White. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ CHITOSAN LÊN SỰ TẠO CHỒI LAN CATTLEYA HYBRID WHITE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Gia Lộc MSSV: 1515100012 Lớp: 15HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – giảng viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Nguyễn Gia Lộc i
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và cung cấp những tư liệu quý giá cho em thực hiện tốt bài đồ án tốt nghiệp này. Cảm ơn cô đã tiếp thêm cho em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai. Qua bài đồ án này, em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em tiếp cận và học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án. giúp em nắm vững những kiến thức đã học. Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đồ án. Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đồ án. Cuối cùng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp trồng người. TP.Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện đồ án Nguyễn Gia Lộc ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ ii MỤC LỤC .............................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... viii MỞ ĐẦU ......................................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 2. Mục đích của đề tài ............................................................................................. 2 3. Nội dung của đề tài ............................................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nguyên cứu ........................................ 2 5. Kết quả đạt được của đề tài ................................................................................. 3 6. Kết cấu của đồ án ................................................................................................. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4 1.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy ................................................................. 4 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô thực vật ......................................... 4 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam............................................. 4 1.1.3. Ứng dụng của nhân giống in vitro ................................................................. 5 1.1.4. Ưu và nhược điểm của quá trình nhân giống ................................................. 6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro ............................... 7 1.2. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................... 9 iii
1.3. Sự phát sinh hình thái ........................................................................................ 10 1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các yếu tố ảnh hưởng ..................... 11 1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng về chitosan ................................................ 16 1.6. Giới thiệu về cây Cattleya ................................................................................. 18 1.6.1. Giới thiệu chung về cây phong lan ................................................................ 18 1.6.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan trên thế giới và ở Việt Nam .................................................................................................................. 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................. 32 2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ............................................................... 32 2.1.1. Địa điểm thí nghiệm ....................................................................................... 32 2.1.2. Thời gian tiến hành thí nghiệm ...................................................................... 32 2.2. Vật liệu .............................................................................................................. 32 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 32 2.2.2. Môi trường nuôi cấy ....................................................................................... 32 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm ...................................................................................... 33 2.3. Phương pháp...................................................................................................... 33 2.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... 34 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White .............................................. 34 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White ....................................................... 44 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên sự tạo chồi Cattleya Hybrid White .............................................. 35 2.5. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................ 36 2.6. Thống kê và xử lý số liệu .................................................................................. 37 iv
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 38 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. .................................... 38 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. .................................... 45 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. .................... 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................ 58 4.1.Kết luận .............................................................................................................. 58 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 59 PHỤ LỤC ...................................................................................................................1 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA 6-benzyl-aminopurine DNA deoxyribonucleic acid MS Murashige và Skoog (1962) NAA Alpha-naphtalenacetic acid TCN Trước Công Nguyên TP. HCM Thành Phố Hồ Chí Minh 2,4-D 2,4-dichlopophenoxyacetic acid vi
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White ...........................................................34 Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White .................................................................35 Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White .............................................36 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy .................................39 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy .................................46 Bảng 3.3. Ảnh hưởng chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy ...........................52 vii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hoa lan Cattleya Hybrid White ............................................................... 21 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ..... 41 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ..... 42 Hình 3.3. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ..... 48 Hình 3.4. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ..... 49 Hình 3.5. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) ...................................................................................................... 54 Hình 3.6. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) ...................................................................................................... 55 viii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ................................................................................................ 40 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ NAA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ................................................................................................ 47 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ chitosan là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) ....................................................................... 53 ix
LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của văn minh nhân loại, đời sống con người ngày càng được nâng cao, cả về mặt vật chất và tinh thần. Nhu cầu thưởng thức cái đẹp, đặc biệt cái đẹp đến từ thiên nhiên, cỏ cây hoa lá dần đi vào đời sống mỗi người dân. Từ xa xưa, chơi hoa, trồng hoa và thưởng thức hoa đã được coi là một thú vui nghệ thuật độc đáo và thú vị. Ngày nay, nghề trồng hoa và kinh doanh hoa đang ngày càng được chú tâm và phát triển bởi nó không chỉ bó hẹp trong giá trị thưởng thức mà còn mang lại giá trị kinh tế rất cao. Phong lan là một trong những loài hoa có chất lượng cao, giá trị kinh tế lớn, được nhiều người yêu thích bởi có hoa đẹp, cấu trúc hoa kiêu kỳ, phức tạp. Hơn nữa, màu sắc hoa vô cùng phong phú, hương thơm quyến rũ, thời gian chơi dài. Nhờ quá trình sưu tầm các loài lan đẹp, lạ mắt và các kỹ thuật lai tạo ra các thứ lan mới, số loài hoa lan hiện nay trên thế giới có thể đã lên đến 100 ngàn loài. Vì thế, trong thời gian gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, thú chơi lan đã trở thành thông dụng và có điều kiện hơn, không phân biệt địa vị, tuổi tác, hoàn cảnh kinh tế. Số người chơi và yêu chuộng hoa lan ngày càng tăng, hay nói cách khác, nhu cầu sử dụng các chủng loại lan đã và đang tăng. Hoa lan hiện đang được trồng và kinh doanh với 3 kiểu dáng: hoa cắt cành, cây đã thành thục trong chậu treo hay bám trên giá thể và cây lan con từ 10 – 15 cm. Được mệnh danh là “hoàng hậu” của các loài lan, Cattleya nổi bật với vẻ đẹp kiêu sa, quý phái không chỉ ở cánh hoa mà ở tất cả các bộ phận của cây, cùng với hương thơm dễ chịu làm mê đắm lòng người. Cattleya có thể sống được ở vùng nóng và vùng ôn đới, đặc biệt đây là giống rất thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam với biên độ rộng. Chính vì thế nó được trồng và phát triển mạnh ở tất cả các nơi, các tỉnh phía Nam, phía Bắc và ngay cả trên vùng Cao Nguyên, tuy nhiên mỗi nơi đều có cách trồng khác nhau. Đối với các nước có nền công nghiệp hoa lan 1
phát triển mạnh như Thái Lan, Hà Lan, Đài Loan và Trung Quốc, lan nói chung và Cattleya nói riêng đều được đầu tư đi sâu nghiên cứu để không chỉ tạo ra giò lan đẹp mà còn có giá cả cạnh tranh. Do đó việc giảm giá thành cây giống để cung cấp cho người sản xuất, mở rộng diện tích đang là vấn đề bức xúc hiện nay. Để giải quyết vấn đề này người ta áp dụng nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô vì hệ số nhân cao, có thể nhân nhanh được hàng loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt như bố mẹ chọn lọc. Từ một cây mẹ ban đầu ta có thể nhận ra hàng ngàn cây con có kích thước và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân giống được nhanh hơn. Mặt khác, cây con ổn định về di truyền, đồng thời giảm tác hại cho cây giống và đem lại hiệu quả thiết thực trong việc nâng cao chất lượng cây giống và giảm giá thành. Chính vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và chitosan lên sự tăng trƣởng và nhân chồi Cattleya Hybrid White” nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về môi trường nuôi cấy. 2. Mục đích của đề tài Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp nhất lên khả năng tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. Đánh giá hoạt tính kích thích tạo chồi khi bổ sung chitosan trong môi trường nuôi cấy mô cây lan Cattleya Hybrid White. 3. Nội dung của đề tài  Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White.  Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White.  Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nguyên cứu Ý nghĩa khoa học: - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về môi trường nuôi cấy tăng trưởng lan và lan Cattleya nói riêng. 2
- Là cơ sở cho nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy các loài lan khác nói chung. Ý nghĩa thực tiễn: - Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân nhanh giống lan Cattleya Hybrid White ở quy mô lớn, tạo cây con sạch bệnh nhằm cung cấp cho sự đa dạng giống lan tại Việt Nam. 5. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Xác định được nồng độ BA thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. - Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. - Xác định được nồng độ chitosan thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. 6. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về phƣơng pháp nuôi cấy 1.1.1. Khái niệm về phƣơng pháp nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy mô (tissue culture) là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật và các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ. Việc nuôi cấy được duy trì dưới điều kiện kiểm soát. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đường. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bật:  Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển, nhờ vậy mà một người có thể sản xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc Hồng.  Ở miền Bắc, nhân giống vô tính ở thực vật được ứng dụng ở hầu hết các loài thực vật nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương (loại gỗ tiết tinh dầu dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm), cây Đăng lấy gỗ, Chè vang (một loại chè rất khó trồng). Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống Lúa chịu hạn DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía,...  Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch đàn Eucalyptus urophylla. 4
 Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở địa phương.  Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất Phong lan lớn trong khu vực. Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.  Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và cộng sự tại Trung tâm Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm hương, Bạch đàn Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao.  Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) quý hiếm từ một số tế bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy trình chỉ mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) – loài lan duy nhất có hương thơm trên thế giới. 1.1.3. Ứng dụng của nhân giống in vitro  Nhân nhanh giống, tạo cây con đồng đều về hình thái, đồng nhất về di truyền.  Tạo cây trồng sạch bệnh.  Sản xuất cây đơn bội.  Lai xa.  Bảo quản nguồn gene. 5
1.1.4. Ƣu và nhƣợc điểm của quá trình nhân giống Ưu điểm:  Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0,1 – 10 mm. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5 – 20 cm.  Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài.  Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn cây giống sạch virus.  Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật,… theo ý muốn.  Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36 – 1012/năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.  Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu sự chi phối của điều kiện ngoại cảnh, của thời vụ.  Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro. Nhược điểm:  Mặc dù có hệ số nhân giống cao nhưng cây giống tạo ra kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn.  Cây giống in vitro được cung cấp nguồn carbohydrate nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên độ ẩm không khí thường bão 6
hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước, gây hiện tượng héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện ex vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao thường không ổn định, nghèo dinh dưỡng.  Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.  Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống: o Tính bất định về mặt di truyền. o Sự nhiễm mẫu. o Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy. o Hiện tượng thuỷ tinh thể. 1.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nhân giống in vitro  Mẫu nuôi cấy Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài Thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genome qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn Cà chua Lycopersicon esculentum Mill.  Chọn cơ quan Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt.  Tuổi và sinh lý Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều 7
nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già.  Mẫu in vitro Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al., (1991) ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng.  Sức sống của mẫu Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn những cây bệnh được nhân lên.  Điều kiện nuôi cấy o Điều kiện vô trùng Theo Nguyễn Quang Thạch nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, cồn 76o,… để khử trùng. Phương tiện khử trùng: nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cấy. 8
o Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 27oC, nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan. o Cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên, 2002). o Quang kỳ và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng: ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng. Chất lượng ánh sáng: ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro. o Các chất khí: Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây in vitro. O2, CO2 và ethylene là những chất được khảo sát nhiều. CO2 có thể bị giới hạn trong bình nuôi cấy và sử dụng nắp bình có lỗ thông khí, sử dụng bình có bổ sung CO2 và làm giàu CO2 trong phòng dưỡng cây có thể cho vi nhân giống hạ giá thành. O2 có giới hạn trong nuôi cấy mô. Ethylene xem như là chất làm giảm sinh trưởng trong nuôi cấy mô. Auxin hưởng đến sự phóng thích ethylene. Nâng cao hàm lượng ethylene làm giảm sinh trưởng mô sẹo. 1.2. Ý nghĩa của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học. Khi tiến hành các kỹ thuật chuyển gen để tạo các giống cây trồng mới, 9
chúng ta đều cần đến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vì phương pháp này có những ưu điểm đáng kể:  Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn.  Tạo ra các dòng cây con hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.  Có thể thực hiện bất kỳ địa điểm nào.  Không phụ thuộc vào thời vụ, thời tiết và không đòi hỏi phải có một diện tích lớn mà vẫn có hiệu suất cao.  Có thể phục tráng và nhân giống một số cây trồng quý bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh.  Dễ dàng học hỏi và trao đổi công nghệ với các nước tiên tiến trên thế giới.  Bảo quản giống dễ dàng bằng cách tạo ra thể phôi hoặc bảo quản lạnh. 1.3. Sự phát sinh hình thái Định nghĩa Phát sinh hình thái ở thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ những thay đổi của cơ quan, mô hay ở mức tế bào thực vật (Bùi Trang Việt, 2000), bao gồm sự phát sinh chồi bất định, phát sinh rễ bất định, tạo phôi soma,… Phát sinh hình thái là một trong những vấn đề căn bản và phức tạp nhất của sinh học. Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu trúc thực vật mà cần tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trọng các biến đổi hình thái và cấu trúc đó. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kỹ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái. Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng nhất là:  Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó. 10