Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:98

Thêm vào BST

Báo xấu

42
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot được thực hiện với mục tiêu nhằm sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC CHỊU NHIỆT SỬ DỤNG TRONG THỨC ĂN CHO CHĂN NUÔI HEO, GÀ QUY MÔ PILOT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Huỳnh Ninh Sinh viên thực hiện : Trần Lệ Quyên MSSV: 1311100608 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực Sinh viên thực hiện Trần Lệ Quyên
LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp tốt nghiệp ở Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Em xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những người thân trong gia đình đã nuôi em khuôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho em được học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp . Ngôi trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn năm qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống. Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, các Thầy Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để em thực hiện đề tài và làm tốt công việc sau này. TS. Phạm Huỳnh Ninh, Phó bộ môn Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh, anh Lê Quang Trí phòng Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài
MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................................................ i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... iv DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ v DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................ vii LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 1.1 Đại cương về probiotic .............................................................................................................3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic ..................................................................................................3 1.1.2 Định nghĩa probiotic .................................................................................................................4 1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp..............................................................................................4 1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic ..............................................................7 1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic................................................................................................8 1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi ...............................................................................11 1.1.7 Probiotic từ bào tử ...................................................................................................................12 1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng Probiotic trên thế giới và Việt Nam ....................13 1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus ...........................................................................................18 1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus ...........................................................................................18 1.2.2 Bào tử Bacillus .........................................................................................................................22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 25 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài……...………...…………………………...... .........25 2.2 Vật liệu ........................................................................................................................25 2.2.1 Chủng vi sinh vật:..................……………………………….……….........................………25 2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ……………………………………….…. ......................…....25 2.3 Môi trường nghiên cứu……………………………………………… .. …………26 2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)…………........... 30 2.5 Phương pháp nhuộm Gram……………………………………………… ....... …31 i
2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton......................... ............ ….32 2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc……………… .......…………32 2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang………… .....................….33 2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng………………………………........... .....................................34 2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử…………………………………….... .....................................35 2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic……………………………………… ............…...…..….35 2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày…………………………………… ........................…35 2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật…………………………………… .........................…..36 2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ….…………………… ..........................…..37 2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak……………………………………………… .......................................….40 2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử……………………………………...........................…….40 2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất…………………….......................….41 2.8.7 Sản xuất bào tử dạng pilot…………………………………………… ............................….42 2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu…………………………………………… ............................….44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………… ................................... ….45 3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic………………………… ............ ………………………..45 3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày…………………………………… ...................………………..45 3.1.2 Khả năng chịu muối mật…………………………………………............................………46 3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase)…… ..................…48 3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak………………………………………….… .................... ……51 3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn………………… .......…………..53 3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi………………………… ........................……..53 3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi……… ...................……..54 3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub…………….........……………………….54 3.3.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… .............................…...54 ii
3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng……………………………… ..........................……….56 3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi…………… .........……………………….56 3.4.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… ....................................56 3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng………………………… ..........................…………….58 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các chủng Sub và Yoi……………………………………………………………..… .....................……58 3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất………………… .......……………..59 3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot……………………………………………… .............……...61 3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot………………………….………………………………………..….....................................……61 3.7.2 Tiến hành tạo bào tử…………...……………………………….................................…..…..62 3.8 Tạo chế phẩm……………………………………………………………… ..................……..64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ……………………… …………………....65 4.1 Kết luận………………………………………………………..………...…. …….65 4.2 Kiến nghị……………………………………………………………….… ...................………65 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… ................ …66 PHỤ LỤC…………………………………………………………………….…......... 74 Phụ lục I: Bảng biểu…………………………………………… ………………….….74 Phụ lục II: Hình ảnh……………………………… ................................ ………….….85 iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT KL Khuẩn lạc MT Môi trường N Mật độ tế bào TB Tế bào TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường............................................................................................. ........... ....................17 Bảng 1.2. Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử... ............... .........23 Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn vi khuẩn trong môi trường pH thấp........................................................ .................. ......................................................45 Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật 2%........................................... ........................ ..............................................................47 Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus.......... ............... ..........49 Bảng 3.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định ...... ....51 Bảng 3.5. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi... ................... ...54 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub............................................. .......55 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi...... ................................. .............57 Bảng 3.8. Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô pilot............................................. ....................................... ...........................................63 Bảng 5.1. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường pH thấp................ ........................................ ........................................................................74 Bảng 5.2. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường muối mật 2%................................................ ....................................... ..........................75 Bảng 5.3. Số liệu đường chuẩn của chủng Sub....................................................... ......76 Bảng 5.4. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Sub................................................................................... ..............................................77 Bảng 5.5. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub.......... .................................. .....78 Bảng 5.6. Số liệu đường chuẩn chủng Yoi.............. ..................................... ................79 Bảng 5.7. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Yoi.................................... ............................................. ................................................80 Bảng 5.8. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi................. .................... ............81 v
Bảng 5.9. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào và bào tử của các chủng Sub......................................... .................................... ............82 Bảng 5.10. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào và bào tử của các chủng Yoi............................... .............................. ............................82 Bảng 5.11. Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi. ......... .83 Bảng 5.12. Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời gian khảo sát khác nhau........................ ................................................... .............................83 Bảng 5.13. Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp khác nhau .......................................................................... .............................................................84 Bảng 5.14. Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot............. .................................................................................................................. 85 Bảng 5.15. Kết quả khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot.. ............ ...86 vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật……..................... …..9 Hình 1.2. Các cấu trúc chính của bào tử B. Subtilis... ........................................ ...........23 Hình 1.3. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus...... .............. .24 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát............................................................. .....30 Hình 3.1. Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase) của các chủng Bacillus…… .............................. ……………………………........50 Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillu… ............... .52 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub .................... 53 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi ................... .53 Hình 3.5. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub . .......................... 55 Hình 3.6. Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian .................................... ..56 Hình 3.7. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi . .......................... .57 Hình 3.8. Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian… .................................. 58 Hình 3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng Sub và Yoi………………… ..................................................................... ……………………59 Hình 3.10. Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời gian của chủng Bacillus subtilis ..……………… ...................................................................... .60 Hình 3.11. Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis ..................... ..61 Hình 5.1. Máy ly tâm Avanti JXN Series .................................................................... .87 Hình 5.2. Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis… ......................................... 87 Hình 5.3. Hệ thống lên men 5 L……………… ........................................................... .88 vii
LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Khí hậu Việt Nam nóng ẩm theo mùa, thời tiết thay đổi thường xuyên, nhiệt độ không ổn định là môi trường lí tưởng để vi khuẩn gây bệnh bùng phát ở các chuồng trại chăn nuôi. Ngành chăn nuôi gặp rất nhiều vấn đề về bệnh tật xuất phát từ đường ruột và hệ tiêu hóa. Theo thống kê hằng năm, tỷ lệ gia súc và gia cầm chết do mắc bệnh đường ruột lớn nhất so với nguyên nhân gây bênh khác. Không chỉ vậy, trong chăn nuôi còn tồn tại các vấn đề khác như lạm dụng kháng sinh và chất tăng trọng gây tác hại đối với người sử dụng, lãng phí thức ăn do vật nuôi không hấp thụ hết thức ăn, dinh dưỡng. Vì vậy, để giải quyết được những vấn đề trên đồng thời có thể nâng cao năng suất hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân, Probiotic là một giải pháp hiệu quả nhất hiện nay. Các tác dụng cơ bản của probiotic là tăng cường khả năng miễn dịch, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng của vi khuẩn có hại trong hệ tiêu hóa. Một lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất hay nhập khẩu, phân phối và sử dụng trong chăn nuôi. Các chế phẩm này chủ yếu chứa các vi khuẩn sống thuộc các giống Bacillus, Lactobacillus, Enteroccocus, nấm men. Số lượng và chủng loại chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam hiện nay rất đa dạng. Tuy nhiên, không phải chế phẩm nào cũng đạt chuẩn và phù hợp với môi trường, khí hậu, điều kiện chăn nuôi Việt Nam. Một chế phẩm probiotic đạt hiệu quả ở một quốc gia nông nghiệp tiên tiến nhưng có thể hoàn toàn không hiệu quả ở một quốc gia nông nghiệp đang phát triển như Việt Nam. Nguyên nhân lớn nhất xuất phát từ hệ sinh thái vi sinh từng nơi. Hiện nay, trong công nghiệp chế biến thức ăn dạng viên thì nguyên liệu thức ăn sẽ được xử lý ở nhiệt độ từ 70 - 80oC, có khi lên đến 90oC nhằm kiểm soát nguy cơ về nhiễm khuẩn, ví dụ như Salmonella (Jones và cộng sự, 2004; Doyle và cộng sự, 2006) 1
cũng như để hồ hóa tinh bột. Quá trình xử lý nhiệt làm giảm đáng kể số lượng vi sinh vật probiotic trong chế phẩm (chứa các tế bào sinh dưỡng). Vì vậy để đảm bảo cung cấp đủ lượng vi sinh vật probiotic trong thức ăn viên thì cần phải chọn ra một chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic và có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Bào tử vi khuẩn probiotic thuộc chi Bacillus được xem là một giải pháp thích hợp cho vấn đề sử dụng trong thức ăn ép viên cho chăn nuôi gia súc và gia cầm. Bào tử Bacillus khá bền nhiệt, tính kháng axit cao hơn so với tế bào sinh dưỡng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử Bacillus nảy mầm và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật nuôi khoảng 70 - 90%. Ở Việt Nam, hiện có rất ít các nghiên cứu về việc sử dụng bào tử của các chủng Bacillus bổ sung vào thức ăn cho động vật, hoặc là chưa được quan tâm thực hiện hoặc đã thực hiện nhưng không công bố, nếu có cũng rất hạn chế về số lượng các nghiên cứu. Từ hiện trạng nghiên cứu và sản xuất probiotic như trên cho thấy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus ở quy mô pilot là một yêu cầu cấp thiết nhằm tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi an toàn và góp phần hạn chế nhập khẩu, chủ động nguồn sản phẩm và làm giảm giá thành sản phẩm. Đây là cơ sở cho việc thực hiện khóa luận “ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot”. Mục đích đề tài Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot Nhiệm vụ của đề tài  Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic tốt  Khảo sát điều kiện tạo bào tử trong điều kiện lên men lỏng  Sản xuất bào tử Bacillus dạng pilot (5 lít )  Tạo chế phẩm Probiotic 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về probiotic 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [53]. Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53]. Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [37]. Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [38]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [37]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [38]. 3
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi. 1.1.2 Định nghĩa probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” [26]. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” [26]; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”. 1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng VSV có ích. Đó là các TB sống của các chủng VSV, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất sinh học có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện MT, đồng thời cũng có tác dụng dương tính đối với sức khỏe con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [12]. Chế phẩm probiotic thường gồm các nhóm VSV sau: Các nhóm VSV cơ bản:  Nhóm VK lactic [17]: Đây là nhóm VK thân thuộc với con người từ ngàn xưa. Trong tự nhiên, chúng phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, cà 4
muối, mắm chua, sữa chua…Ngoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và dị hình, VK lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin,…Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh đường tiêu hóa cho người và vật nuôi. Các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng VK lactic sau: L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes, Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S. faecalis…[24]. Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng 1 chủng VSV như chế phẩm Antibio của Hàn Quốc (100% là L. acidophilus) hay Biosubtyl của Đà Lạt (100% là bào tử B. subtilis) hoặc kết hợp nhiều chủng VSV như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học Nông nghiệp Hà Nội (ngoài VK lactic còn có VK Bacillus, VK quang dưỡng khử H2S và nấm men..) [17]. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng: các VK lactic có một vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Nhờ khả năng sản sinh ra axit lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B, sản sinh enzyme…nên có tác dụng ức chế VSV đường ruột, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ…  Nhóm VK Bacillus Các VK Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Chúng phân bố phổ biến trong tự nhiên. Một số loài của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật. Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như protein, tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào khá mạnh như: amylase, cellulase, protease [17]. 5
Ngoài các enzyme trên, các VK này còn có khả năng sinh bacterioxin-chất có hoạt tính kháng sinh có khả năng ức chế một số VSV gây bệnh đường ruột đặc biệt là E. coli, đồng thời giúp kích thích tiêu hóa và tăng trọng ở vật nuôi. Trong chế phẩm probiotic, người ta thường sử dụng các chủng thuộc giống Bacillus sau: B. subtilis, B. mesentericus, B. megathericum, B. licheniformis, B. clausii,…[8, 17]. Các chủng này rất có ích, không gây bệnh cho người và vật nuôi.  Nấm men Saccharomyces: Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong nghề làm bánh mì, nấu rượu, làm bia, ủ rượu vang…Trong thành phần của TB nấm men rất giàu protein, vitamin nhóm B và khoáng chất nên thường được bổ sung vào chế phẩm probiotic để làm giàu sinh khối TB [17]. Chúng còn hấp thu và bài thải độc tố ra ngoài, tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản [14, 20]. Ngoài ra, TB nấm men có trong chế phẩm còn tạo mùi thơm, giúp cải thiện mùi cho MT và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi. Để sản xuất probiotic, người ta thường dùng các chủng sau: S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. vini hoặc S. pombe [13], đặc biệt là S. boulardii. S. boulardii có tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori [10].  Nấm mốc: Điển hình là Asp. oryzae, Asp. niger. Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai trò sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase,…nhằm tăng cường khả năng tiêu hóa thức ăn của con người và vật nuôi, đồng thời cũng có thể được bổ sung vào chế phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do thức ăn thừa hay phân do vật nuôi bài tiết ra [17]. Ngoài ra, còn một số nhóm VSV khác cũng được bổ sung vào chế phẩm probiotic giúp cải thiện MT nước nuôi trồng thủy sản, tăng khả năng làm sạch ao hồ, 6
giảm hoặc mất mùi hôi thối do H2S… như: VK nitrat (Nitrobacter và Nitrosomonas), VK quang dưỡng khử H2S, VK tía có lưu huỳnh và VK tía không chứa lưu huỳnh (Rhodobacter sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas palustris…) [17] 1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa vật chủ. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau: - Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chịu được áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được sử dụng làm probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ. Vì vậy, đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic [10]. - Khả năng chịu muối mật: Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, khi thức ăn cùng với VSV probiotic từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây, chúng sẽ chịu tác động của muối mật. Khả năng sống sót của các chủng VSV sau tác dụng của muối mật là một trong những đặc tính quan trọng của VSV được sử dụng làm probiotic [10, 21, 23]. Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1 – 3 % [50]. Để tồn tại 7
và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2% - Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu hoá như: amylase, cenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ - Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Staphylococcus aureus. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như: + Sản sinh ra các chất Bacteriocin. + Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic. + Tạo ra H2O2. + Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau. + Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt. + Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh. - Khả năng sinh enzyme ngoại bào: 1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được nhiều nhà khoa học chấp nhận [9, 24, 26]. Cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau [9, 27] 8
Cải thiện sức khỏe và năng suất Cải thiện sự cân bằng Giảm thiểu sự sản sinh hệ VK dạ dày – ruột nhóm amin độc hại Tăng độ hữu dụng của chất dinh dưỡng Cải thiện sự hấp thu Phân giải các chất dinh dưỡng như protein,… Cạnh tranh với Tổng hợp Vi sinh vật có lợi VK gây bệnh vitamin đường ruột Sản xuất axit hữu cơ Sản xuất kháng Ức chế sự phát sinh triển của VK gây Làm giảm pH bệnh Kích thích miễn dịch Trung hòa các độc tố đường ruột Hình 1.1 Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật - Probiotic giúp duy trì hệ VSV có lợi trong đường ruột bằng hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh [28]. Đối kháng là hiện tượng một loài VSV bằng cách này hay cách khác ức chế hoặc tiêu diệt sự ST và phát triển của một loài VSV khác. Một số nhà khoa học cho 9
rằng, cơ chế tác động đối kháng xảy ra khi nguồn thức ăn cạn kiệt do sự phát triển nhanh chóng của một vài loại VSV và tạo điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VSV khác Hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh bao gồm:  Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành chất dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra. Khi VSV gây bệnh bị cạnh tranh, thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được. Từ đó có thể ức chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Phương pháp sử dụng probiotic để loại trừ các VK có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn nhiều so với phương pháp sử dụng kháng sinh [24]  Ngoài khả năng gia tăng về số lượng để cạnh tranh vị trí bám với VSV gây bệnh, VSV probiotic còn có thể tác động nhờ khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như: kháng sinh, bacterioxin, axit hữu cơ, H2O2, ethanol,… Những chất này được sinh ra trong quá trình sống của VSV, có khả năng tiêu diệt có chọn lọc các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột [17, 20]. - Gia tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: probiotic kích thích tính thèm ăn, làm tăng tích lũy mỡ, nitrogen, Ca, P, Cu, Mn, tiết các enzyme tiêu hóa như amylase, cellulase, lipase, protease…giúp phân giải các chất dinh dưỡng phức tạp thành chất đơn giản dễ hấp thụ. - Tổng hợp vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, B12, làm giảm hoạt tính urease trong ruột non, ngăn chặn tổng hợp những amin độc, giảm nồng độ NH3 trong phân gia súc, gia cầm, do đó có ảnh hưởng tốt đối với MT [17]. - Kích thích hệ thống miễn dịch: yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của vách TB vi khuẩn (peptidoglycan). Sự phân hủy peptidoglycan tạo ra chất muramyl peptid có tác dụng kích thích hoạt động của đại thực bào (Tannock, 1997). Saarela và cộng sự (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo nên sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống 10