Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids qua quá trình lên men của chủng Candida bombicola

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua quá trình lên men của chủng C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải; khảo sát một số hoạt tính của sophorolip. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids qua quá trình lên men của chủng Candida bombicola

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPIDS QUA QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHỦNG Candida bombicola Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực hiện : HUỲNH THỊ DIỄM TRINH MSSV: 1151110044 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài: Huỳnh Thị Diễm Trinh Sinh viên trường: Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh Khoa: Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi Trường Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 11DSH01 MSSV: 1151110044 Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh học Nhiệt đới, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoàng Dũng. Các số liệu thu thập được và kết quả phân tích trong bài là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được công bố trước đây. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu, thông tin được đăng tải trên các trang web, tác phẩm, bài báo theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo cáo này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm - Môi trường, trước ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh Ngày ….tháng….năm… Sinh viên thực hiện (ký và ghi rõ họ tên)
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình đến: Các thầy cô Bộ môn trong khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường cùng các thầy cô trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, đã trực tiếp giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi khi học ở trường. Thầy Nguyễn Hoàng Dũng, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, một người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn và luôn động viên tôi trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Chị Nguyễn Lương Hiếu Hòa, chị Lê Quỳnh Loan, bạn Trần Lê Việt Hà, bạn Lê Văn Tâm đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm cũng như những niềm vui nỗi buồn cùng tôi. Tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi nhiều điều trong suốt quá nghiên cứu. Tập thể lớp 11DSH01, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, đã sát cánh bên tôi trong suốt những năm tháng trên giảng đường đại học. Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và các em trong gia đình đã chăm sóc, lo lắng và luôn dõi theo từng bước con đi. Sẵn sàng bên cạnh động viên và khích lệ những lúc con khó khăn nhất, để con có thể vững tin và bước tiếp trên con đường đã chọn. Huỳnh Thị Diễm Trinh
MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................iv DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................vi MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................................. 1 2. Tình hình nghiên cứu ................................................................................................. 2 3. Mục đích nghiên cứu .................................................................................................. 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................................. 2 5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 3 6. Các kết quả đạt được .................................................................................................. 3 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp ...................................................................................... 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 5 1.1. Tổng quan về nấm men ........................................................................................... 5 1.1.1. Đặc điểm hình thái tế bào nấm men................................................................... 5 1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men ..................................................................................... 5 1.1.3. Sinh sản ở nấm men ........................................................................................... 5 1.1.4. Ứng dụng của nấm men ..................................................................................... 6 1.1.5. Sơ lược về nấm men Candida bombicola .......................................................... 7 1.2. Tổng quan về chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) ................................ 8 1.2.1. Khái quát về chất hoạt động bề mặt sinh học .................................................... 8 1.2.2. Khái quát về sophorolipids (SLs) .................................................................... 10 1.2.2.1. Giới thiệu chung về SLs ........................................................................... 10 1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của SLs ......................................................................... 11 1.2.2.3. Sinh tổng hợp SLs .................................................................................... 12 1.2.2.4. Hoạt tính của SLs ..................................................................................... 13 1.2.2.5. Ứng dụng của SLs .................................................................................... 15 i
1.3. Tình hình nghiên cứu về SLs ................................................................................ 17 1.3.1. Nước ngoài ....................................................................................................... 17 1.3.2. Trong nước ....................................................................................................... 18 1.4. Thực trạng nguồn dầu thải ở Việt Nam................................................................. 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 20 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 20 2.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 20 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 20 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ........................................................................ 20 2.2.3. Hóa chất ........................................................................................................... 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 22 2.3.1. Tăng sinh và bảo quản chủng C.bombicola ATCC 22214 .............................. 23 2.3.2. Nuôi cấy và thu nhận Sophorolipids từ chủng C.bombicola ATCC 22214 .... 23 2.3.3. Định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) ...................... 25 2.3.4. Xác định thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................................................................................................ 26 2.3.5. Khảo sát một số hoạt tính của SLs thu được .................................................. 27 2.3.5.1. Khả năng nhũ hóa ..................................................................................... 27 2.3.5.2. Khả năng kháng oxy hóa .......................................................................... 28 2.3.5.3. Khả năng kháng khuẩn ............................................................................. 29 2.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................... 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 32 3.1. Kết quả thu nhận sophorolipids từ nguồn dầu thải và glucose ............................. 32 3.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi lên quá trình thu nhận Sophorolipids ...... 32 3.3. Kết quả định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) ............... 33 3.4. Kết quả khảo sát thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................................................................................................ 35 ii
3.5. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của SLs thu được ......................................... 37 3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs thu được............................... 37 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được.................................. 38 3.7.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. ............................................................................... 38 3.7.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ........................................................ 39 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 41 4.1. Kết luận ................................................................................................................. 41 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 42 PHỤ LỤC iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CHĐBM Chất hoạt động bề mặt CHĐBMHH Chất hoạt động bề mặt hóa học CHĐBMSH Chất hoạt động bề mặt sinh học CMC Critical micelle concentration DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl HPLC High performance liquid chromatography IC Inhibitory concentration IC50 Inhibitory concentration 50% OD Optical density (mật độ quang học) LB Luria bertani MIC Minimum inhibitory concentration SLs Sophorolipids SDO Soybean dark oil TLC Thin layer chromatography YM Yeast malt medium iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại CHĐBMSH và các chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình .............. 9 Bảng 1.2. Khả năng nhũ hóa của SLs được sản xuất bởi C.bombicola với cơ chất kỵ nước. ............................................................................................................. 14 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của hỗn hợp SLs thu được. .................. 37 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch ... 39 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ............................................. 40 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào nấm men C.bombicola ......................................................................... 7 Hình 1.2. Cấu trúc của sophorolipid.............................................................................. 11 Hình 1.3. Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids .......................................................... 12 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................... 22 Hình 2.2. Quy trình thu nhận sophorolipids .................................................................. 24 Hình 2.3. Quy trình phân tích mẫu SLs trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ....... 27 Hình 2.4. Cơ chế phản ứng DPPH................................................................................. 28 Hình 3.1. Sophorolipids thu được ................................................................................. 32 Hình 3.2. Biểu đồ sản lượng SLs thu được ở những thời gian lên men lên men khác nhau............................................................................................................... 33 Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được ......................................................................... 34 Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao........ 36 Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate. ................. 36 Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu được. ............................................................................................................. 38 Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch ... 39 vi
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống hằng ngày của con người. Chúng có mặt trong hầu hết các sản phẩm thiết yếu, trong mọi ngành công nghiệp, góp phần phát triển và mang lại lợi nhuận vô cùng to lớn cho ngành công nghiệp hóa chất. Chất hoạt động bề mặt là một trong những nhóm hóa chất công nghiệp được sản xuất nhiều nhất hiện nay, với tổng sản lượng trên toàn thế giới vượt quá 15 triệu tấn/năm và đang tăng dần theo thời gian. Chất hoạt động bề mặt được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chất tẩy rửa, mỹ phẩm, dược phẩm, thưc phẩm, nông nghiệp, sản xuất giấy, tăng hiệu suất thu hồi dầu thô… Phần lớn chất hoạt động bề mặt được sản xuất bằng con đường tổng hợp hóa học và từ dầu mỏ. Việc này thường gây ảnh hưởng xấu đến môi trường bởi khả năng phân hủy sinh học của chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) kém. Vì vậy, việc tổng hợp và ứng dụng các chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học đang được quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Trong đó sophorolipids (SLs) – một dạng chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) thuộc nhóm glycolipid - được xem là rất có triển vọng bởi nhiều nguyên nhân: 1. Vi sinh vật sản xuất không phải tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm. 2. Những đặc tính ưu việt của SLs so với các chất hoạt động bề mặt hóa học như khả năng phân hủy sinh học tốt hơn, độc tính thấp, thân thiện với môi trường. 3. SLs có hoạt tính chuyên biệt trong các điều kiện khác nhau về nhiệt độ, pH và nồng độ muối cao. Hiện nay, một vấn đề đặt ra trong việc sản xuất sophorolipids bằng phương pháp sinh học là chi phí sản xuất còn khá cao không thể cạnh tranh với chất hoạt động bề mặt hóa học. Để giải quyết vấn đề trên, hướng sản xuất sophorolipds từ các nguyên 1
liệu rẻ tiền đang được quan tâm hiện nay. Vì lý do đó, đề tài nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua quá trình lên men chủng Candida bombicola từ nguồn dầu thải đã được thực hiện. 2. Tình hình nghiên cứu Một số công trình nghiên cứu thu nhận SLs từ quá trình lên men C.bombicola đã được công bố. Kim và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thu nhận SLs bởi chủng C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải phụ phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến dầu nành (SDO) và đạt sản lượng 90 g/l. Tương tự, Daverey và Pakshirajan (2009) công bố rằng họ thu được lượng 63,7 g/l SLs thông qua lêm men C.bombicola ATCC 22214. Hiện nay tại Việt Nam, một số công trình đề cập đến việc phân lập, nghiên cứu khả năng tạo CHĐBMSH của một số chủng vi khuẩn đã được công bố. Đa số các chủng được phân lập từ môi trường nước mặn nhằm mục đích xử lý ô nhiễm dầu. Tuy nhiên, những công trình liên quan đến việc sản xuất và ứng dụng SLs vẫn chưa được nghiên cứu thấu đáo. 3. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua quá trình lên men của chủng C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải. Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Lên men chủng C.bombicola ATCC 22214 trên môi trường chứa glucose và dầu thải. - Thu nhận sophorolipids từ dịch lên men. - Định tính và xác định thành phần sophorolipids. - Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng sophorolipids - Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids như khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, khả năng nhũ hóa. 2
5. Phƣơng pháp nghiên cứu - Thu nhận SLs thông qua nuôi cấy chủng C.bombicola ở điều kiện 300C, pH6, lắc 180 vòng/phút. - Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc ký bảng mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC). - Phân tích thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High Performance Liquid Chromatography). - Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu. - Khả năng chống oxy hóa của SLs cũng được xác định thông qua khả năng bắt các gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). - Khả năng nhũ hóa của SLs được xác định bằng phương pháp đo tỷ lệ hệ nhũ tương được tạo thành so với hệ dung dịch ban đầu. 6. Các kết quả đạt đƣợc Sản lượng SLs thu được sau quá trình lên men đạt 21,9 g/l. Thời gian lên men thu nhận SLs từ chủng C.bombicola thích hợp nhất là 7 ngày. Trong hỗn hợp SLs thu được có khoảng 10 cấu trúc SLs khác nhau. Bước đầu xác định được sự hiện diện của 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate. Khả năng kháng oxy hóa của SLs ở nồng độ 20 mg/ml là 84,32 % và IC50 cũng được xác định 4,4531 mg/ml. Nồng độ ức chế tối thiểu đối với một số vi khuẩn cũng được xác định S.aureus (1,25 mg/ml), P.aeruginosa (2,5 mg/ml), B.subtilis (0,6 mg/ml). Chỉ số nhũ hóa (E24) của SLs từ 39,39 – 65,45 % đối với các loại dầu hạt cải, dầu nành và xăng. 3
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm men 1.1.1. Đặc điểm hình thái tế bào nấm men Nấm men thường có hình cầu hoặc hình bầu dục, một số loại hình que và một số hình dạng khác. Kích thước trung bình của nấm men là 2,5 – 10 µm x 4,5 – 21 µm. Có loài nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả. Khuẩn ti giả chưa thành sợi rõ rệt mà chỉ là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài. Có loài có thể tạo thành váng khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể [1]. 1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống như tế bào thực vật. Tế bào nấm men có đầy đủ các thành phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, ribosome, nhân, không bào và các hạt dự trữ. Thành tế bào nấm men dầy khoảng 25 nm, được cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90 % là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipid và glucosamine. Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men dày khoảng 8 nm có cấu tạo tương tự như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn. Ty thể nấm men có hình bầu dục, được bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lược hợc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên. DNA của ti thể nấm men là một phân tử dạng vòng có khối lượng phân tử 50x106 Da, chiếm khoảng 15-23 % tổng lượng DNA của toàn tế bào nấm men [1]. 1.1.3. Sinh sản ở nấm men Nấm men sinh sản bằng hai hình thức: vô tính và hữu tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến và điển hình của tế bào nấm men. Khi tế bào trưởng thành, nhân sẽ dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa. Trên tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con, hoặc cùng một lúc tế bào mẹ có thể tạo ra nhiều tế bào con ở nhiều hướng khác nhau (tùy theo giống, loài). Mỗi chồi con sẽ 5
nhận một phần chất nhân và chất nguyên sinh từ tế bào mẹ. Khi chồi con trưởng thành, nó sẽ hình thành một vách ngăn để tách khỏi tế bào mẹ và sống độc lập. Có trường hợp, tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy chồi tạo một tập hợp tế bào nấm men có dạng xương rồng hay còn gọi là khuẩn ty giả. Ngoài ra, nấm men còn sinh sản vô tính bằng hình thức phân cắt như ở vi khuẩn, chỉ thấy ở chi nấm men Schizosaccharomyces và sinh sản bằng bào tử như: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử bắn ở chi Sporobolomyces; bào tử áo ở nấm Candida albicans [1]. Sinh sản hữu tính ở nấm men là do sự tiếp hợp giữa hai tế bào nấm men với nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử túi nằm trong nang (túi), nang chín sẽ vỡ bào tử được phát tán ra bên ngoài, gặp điều thuận lợi phát triển thành một tế bào nấm men mới [1]. 1.1.4. Ứng dụng của nấm men Nấm men đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người, một số ứng dụng của nấm men như: Tế bào nấm men cũng như những sản phẩm mà chúng sản sinh ra giàu protein, vitamin, các acid amin cần thiết, chất khoáng… Nên nấm men được sử dụng trong thực phẩm bổ sung chất dinh dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm… Sản phẩm của nấm men còn được sử dụng như chất điều vị trong công nghệ thực phẩm. Trong nông nghiệp: dịch chiết của nấm men có khả năng giúp thực vật chống lại một số bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra. Trong chăn nuôi: nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men bổ sung vào thức ăn của vật nuôi sẽ tăng cường hệ vi sinh vật đường ruột, giúp vật nuôi kháng lại các bệnh đường ruột. Ngoài ra các nghiên cứu cũng nhận thấy sự tăng trọng, tăng sản lượng trứng, sữa… khi bổ sung nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men vào thức ăn của vật nuôi. Bên cạnh đó cao nấm men giàu nitrogen, vitamin, chất khoáng và các hợp chất kích thích tăng trưởng nên được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vât. 6
1.1.5. Sơ lược về nấm men Candida bombicola  Phân loại nấm men Candida bombicola Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Ngành phụ: Saccharomycotina Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetes Họ: Incertae sedis Giống: Candida Loài: Candida bombicola Chủng: Candida bombicola ATCC 22214 Nấm men Candida bombicola, trước đây được gọi là Torulopsis bombicola, được phân lập từ mật của loài ong nghệ (bumble-bees) thuộc chi Bombus sp [47] . Candida bombicola cùng với một số nấm men như Candida magnolia, Candida apicola, Candida bororiensis, Wickerhamiella domericqiae và Rhodotorula bogoriensis được biết đến với khả năng sản xuất SLs – một glycolipid ngoại bào [12][19][20] [23][47] [48]. Hình 1.1. Tế bào nấm men C.bombicola Nguồn: Kurtzman và Fell, (2001). 7
Tế bào nấm men Candida bombicola có dạng hình oval đến hình thon dài, thường tồn tại riêng rẽ hoặc dính thành cặp, với kích thước tế bào là1,5 – 2,5 µm x 3 – 5 µm (Hình 1.1) [28]. Khi nuôi cấy đĩa trên môi trường bột bắp agar sau 7 ngày ở 250C, tế bào nấm men Candida bombicola không xuất hiện khuẩn ty giả hoặc tế bào bao gồm rất nhiều các chuỗi ngắn phân nhánh dày đặc. Phát triển trong điều kiện hiếu khí thì khuẩn lạc có màu kem đến màu xám tro, trơn, bóng, lồi và ria mép khuẩn lạc có dạng răng cưa [28]. Nấm men Candida bombicola có thể lên men glucose, sucrose và có khả năng đồng hóa glucose, galactose, sucrose, ethanol, glycerol, D – Mannitol, D – Glucitol. Chúng có thể phát triền ở nồng độ đường cao 100 g/L hoặc cao hơn [49]. Ngày nay, Candida bombicola thường được gọi là Starmerella bombicola C.A Rosa & Lachance [14]. 1.2. Tổng quan về chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) 1.2.1. Khái quát về chất hoạt động bề mặt sinh học Chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) là những hợp chất có cấu trúc đa dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật. Tất cả CHĐBMSH là hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo). Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa hai chất (có thể là chất lỏng - chất lỏng, chất lỏng - chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng và không khí) và giảm sức căng giữa 2 chất (chất lỏng - chất lỏng và chất lỏng - chất rắn)[30][33] . Không giống như chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) thường phân loại theo bản chất các nhóm phân cực, CHĐBMSH được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra. Nhìn chung, CHĐBMSH được chia làm các nhóm chính: glycolipid; lipopeptid và lipoprotein; phospholipid và acid béo; CHĐBM trùng hợp và CHĐBM dạng hạt (Bảng 1.1) [6]. 8
Bảng 1.1. Phân loại CHĐBMSH và các chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình CHĐBMSH Vi sinh vật sản xuất Pseudomonas aeruginosa Rhamnolipids Pseudomonas sp. Candida bombicola Sophorolipids Candida apicola Glycolipids Candida petrophilum Rhodococcus erythropolis Trehalolipids Mycobacterium tuberculosis Arthrobacter sp. Lipopeptides và Surfactin Bacillus subtilis lipoproteins Lichenysin Bacillus licheniformis Phospholipids, Acid béo Corynebacterium lepus acid béo và Lipid trung tính Nocardia erythropolis lipid trung tính Phospholipids Thiobacillus thiooxidans Alasan Acinetobacter radioresistents KA-53 CHĐBMSH Biodispersan Acinetobacter calcoaceticus A2 dạng trùng hợp Emulsan Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 (polymer) Liposan Candida lipolytica Mannoprotein Saccharomyces cerevisiae CHĐBMSH Vesicles và fimbriae Acinetobacter calcoaceticus dạng hạt Whole cells Nhiều loại vi khuẩn Nguồn: Desai và Banat, (1997) Các CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào (extracellular) như các chất glycolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic – lipoprotein, hay chính bản thân bề mặt tế bào vi sinh vật. Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt nó còn có 9
đặc tính kháng sinh như chất gramicidin S hay polymicin. Các CHHBMSH được tạo ra cả ở trên các cơ chất không tan trong nước lẫn tan trong nước. Nó được tạo ra do phản ứng thích nghi với môi trường không thuận lợi, độc hại và có xu hướng tạo ra nhiều trên các cơ chất không tan trong nước [6]. Trên thị trường chất hoạt động bề mặt hiện nay, CHĐBMSH được quan tâm nhiều hơn bởi một số đặc tính ưu việc như: độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học cao, thân thiện với môi trường hơn, tính chọn lọc cao và khả năng hoạt động cao trong môi trường có nhiệt độ, pH và nồng độ muối khắc nghiệt [27]. 1.2.2. Khái quát về sophorolipids (SLs) 1.2.2.1. Giới thiệu chung về SLs SLs được xem như là chất hoạt động bề mặt ngoại bào, là sản phẩm được tiết ra bởi nấm men Candida sp và Wickerhamiella domercqiae. SLs là một dạng CHĐBMSH thuộc nhóm glycolipids có trọng lượng phân tử thấp, đang được quan tâm nhiều hiện nay cho mục đích thương mại [42]. SLs được mô tả lần đầu tiên vào đầu những năm 60 như là một glycolipid ngoại bào được tổng hợp bởi nấm men Torulopsis magnolia [20]. Sau đó vào năm 1968, Tulloch và Spencer đã báo cáo rằng chủng sản xuất SLs thực tế là Torulopsis apicola, hiện nay được gọi là Candida apicola. Một nghiên cứu khác của Spencer và cộng sự (1970) cho thấy rằng SLs cũng được sản xuất bởi nấm men Candida bombicola. Trong đó, nấm men Candida bombicola ATCC 22214 được chú ý và nghiên cứu nhiều hơn cả do nó có khả năng sản xuất với sản lượng cao SLs (400 g/l) và không phải là tác nhân gây bệnh [49]. Không những thế C.bombicola ATCC 22214 còn có khả năng sử dụng dầu thải nhà hàng như là nguồn lipid cho quá trình tổng hợp SLs [17] SLs được xem là một CHĐBMSH có triển vọng bởi vì vi sinh vật sản xuất không phải là tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm, có năng suất và chuyển hóa cơ chất cao [38]. 10
1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của SLs Về cấu trúc hóa học, SLs gồm phần ưa nước là disaccharide sophoroses (2-O-β- D-glucopyranosyl-D-glucopyranose) liên kết với gốc hydroxyl của carbon kế cuối hoặc cuối trong chuỗi acid béo C16-C18 (phần kỵ nước) bằng liên kết β-glucosidic ở vị trí C1’ (Hình 1.2) [25]. Trong phân tử SLs, nhóm carboxyl của chuỗi acid béo hoặc ở trạng thái tự do (cấu trúc SLs dạng mở hay dạng acid) hoặc là phản ứng este hóa nội sinh với nhóm hydroxyl ở vị trí C 4” của phần sophorose (cấu trúc SLs dạng vòng hay dạng lacton) [41]. Đây là hai dạng cấu trúc chính trong thành phần cấu tạo của SLs. Các cấu trúc này có sự khác biệt về mức độ acetyl hóa (ở vị trí 6’ và 6”) của phần sophorose và thành phần acid béo (chiều dài chuỗi, mức độ bão hòa, vị trí của nhóm hydroxyl) phụ thuộc vào chủng sản xuất, điều kiện sinh trưởng và nguồn carbon kỵ nước [29]. Các phân tử SLs có cấu trúc khác nhau sẽ dẫn đến một vài sự khác nhau trong các đặc tính sinh học và hóa lý của chúng và có thể được ứng dụng chuyên biệt trong các lĩnh vực khác nhau [29]. Các sophorolipid lacton có hiệu quả hơn trong việc làm giảm sức căng bề mặt và khả năng kháng khuẩn tốt hơn, trong khi sophorolipid acidic tạo bọt và hòa tan tốt hơn. Hình 1.2. Cấu trúc của sophorolipid Nguồn: Van Bogaert và cộng sự (2011) 11