Đồ án tốt nghiệp: Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:66

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp: Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu được thực hiện với mục tiêu nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm phòng trừ tuyến trùng hại cây hồ tiêu từ nấm Paecilomyces lilacinus và xác định hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. của chế phẩm Paecilomyces lilacinus. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NẤM PAECILOMYCES LILACINUS PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SP. GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Đinh Thành Hiếu MSSV: 1311100296 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp. HCM, ngày 26 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Đinh Thành Hiếu i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng. Bước đầu đi vào thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp. Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn ! ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................4 1.1.Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces ................................................................. 4 1.1.1. Phân loại khoa học .............................................................................. 4 1.1.2. Đặc điểm sinh thái............................................................................... 5 1.1.3. Các nghiên cứu về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng ............................................................. 7 1.1.4. Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sản xuất và bảo quản chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus .......................................... 10 1.2.Tổng quan về tuyến trùng .............................................................................................. 11 1.2.1. Đặc điểm sinh thái............................................................................. 12 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................19 2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 19 2.2.Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu .................................................................... 19 2.2.1. Thiết bị - hóa chất ............................................................................. 19 2.2.1.1. Thiết bị ..............................................................................................19 2.2.1.2. Hóa chất ............................................................................................19 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu: .......................................................................... 24 2.3.Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 24 2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse lilacinus. .................................. 24 2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005)........................ 24 2.3.3. Hoàn thiện quy trình nhân nuôi sản xuất chế phẩm từ nấm Paecilomyces lilacinus ....................................................................................... 26 2.3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu của cơ chất đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus ........................................................26 iii
2.3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm 27 2.3.4. Khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne sp của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm ......................... 28 2.3.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) .................................................................................................28 2.3.4.2. Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ......................................................................28 2.3.5. Đánh giá hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ở phạm vi đồng ruộng ............. 29 2.3.5.1. Điều tra mức độ tuyến trùng gây hại cây hồ tiêu ..............................29 2.3.5.2. Đánh giá hiệu lực phòng tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus .......................................29 2.4.Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................................. 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................35 3.1.Đặc điểm hình thái của các chủng nấm P1 phân lập được ................................... 35 3.2.Khảo sát sự ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến mực độ bào tử nấm Paecilomyces lilacinus trong quá trình nhân nuôi ......................................................... 36 3.3. .... Kết quả mật độ chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus khi bảo quản với các chất mang .................................................................................................................................. 38 3.4. ...Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. ......................................................................................................... 40 3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm .................................................... 41 3.5. ...Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ngoài đồng ruộng ........................................................................ 44 3.5.1. Mật số tuyến trùng trong đất ............................................................. 44 3.5.2. Mức độ bị hại và sự phát triển của cây hồ tiêu sau khi xử lý nấm.... 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................51 4.1.Kết luận .............................................................................................................................. 51 4.2.Kiến nghị ............................................................................................................................ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................52 iv
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT....................................................................................................... 52 TÀI LIỆU TIẾNG ANH ....................................................................................................... 52 TÀI LIỆU INTERNET ..........................................................................................53 v
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Bảng Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. .............................................................. 15 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces lilacinus.................................................................................................... 30 Bảng 3.1. Đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất.................................................... 37 Bảng 3.2. Mật độ bào tử chế phẩm P.lilacinus sau 2 tháng tồn trữ khi được phối trộn với chất mang ........................................................................... 39 Bảng 3.3. Tỷ lệ (%) tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm Paecilomyces lilacinus ký sinh. ...................................................................................... 41 Bảng 3.4. Tỉ lệ trứng tuyến trùng cái bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh .......... 44 Bảng 3.5. Mật số tuyến trùng di động trong đất ở vùng rễ cây hồ tiêu của các ciing thức ................................................................................................. 45 Bảng 3.6. Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp của nấm Paecilomyces lilacinus............................................................................. 46 Bảng 3.7. Kết quả sử dụng nấm trừ tuyến trùng hại cây hồ tiêu tại xã Ea Nam, huyện Ea H’leo .............................................................................. 47 vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces spp.................................................................... 5 Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus ....................................... 6 Hình 1.3. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus.............................................. 7 Hình 1.4. Vòng đời của tuyến trùng hại rễ ................................................................ 14 Hình 2.1. Phòng ẩm ................................................................................................... 25 Hình 3.1. Nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường PDA .................................. 35 Hình 3.2. Sợi nấm, cành mang bào tử và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus sau khi tái nhiễm và phân lập lại............................................... 36 Hình 3.3. Nấm P.lilacinus phát triển trên cơ chất có độ ẩm 40%,80% và 60%. (A: độ ẩm 40%, B: độ ẩm 80%, C: độ ẩm 60%) ............................ 38 Hình 3.4. Chế phẩm sau khi được phối trộn với chất mang ..................................... 40 Hình 3.5. Nấm Paecilomyces lilacinus tấn công con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces lilacinus soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue). ............................................................. 42 Hình 3.6. Trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh (mẫu được soi dưới kinh hiển vi khi nhuộm với Cottonblue) .............................................................................................. 43 Hình 3.7. Sinh viên pha chế phẩm P.lilacinus tưới vào gốc cây hồ tiêu .................. 48 Hình 3.8. Trước và sau khi phun chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 15 ngày.......................................................................................................... 49 Hình 3.9. Sinh viên xem rễ và lấy mẫu đất của cây hồ tiêu để quan sát tuyến trùng ......................................................................................................... 50 Hình3.10. Quan sát trứng Tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh trong đất cây hồ tiêu được xử lí với chế phẩm .................................................................................................. 50 vii
MỞ ĐẦU Hồ tiêu là một trong những cây trồng công nghiệp xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Do giá trị xuất khẩu cao nên diện tích hồ tiêu ngày càng tăng. Tuy nhiên, hiện nay hồ tiêu bị gây hại nặng bởi nhiều loài dịch hại. Trong đó, đáng kể nhất là tuyến trùng Meloidogyne sp. Biện pháp hóa học đã và đang được áp dụng để quản lý các loài dịch hại này nhưng hiệu quả không cao và nguy cơ tồn lưu hóa chất trong sản phẩm cũng là vấn đề đáng quan tâm. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm Paecilomyces lilacinus cho hiệu quả cao trong phòng trừ tuyến trùng gây hại (Burges H. D., 1998; Butt T. M và Copping L., 2000). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài nấm có ích này vẫn còn khá hạn chế. Tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, Phùng Lê Kim Yến (2014) đã phân lập được chủng nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne gây hại hồ tiêu và bước đầu đã đánh giá được những điểm sinh học của loài tuyến trùng này (Lê Trần Quang Huy, 2015, Phan Ánh Ngân, 2016). Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề về nhân sinh khối chủng nấm này và đánh giá khả năng ký sinh của chế phẩm trên đồng ruộng vẫn chưa tiến hành được.Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên tiếp tục với đề tài “Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu”. Tính cấp thiết của đề tài Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam. Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam. Hiện nay, diện tích trồng hồ tiêu của Việt Nam đã hơn 100.000 ha (theo Hiệp hội hồ tiêu, 2016), tập trung ở các tỉnh Đắc Lắc, Gia Lai, Bình Phước, Đồng Nai và Bà Rịa, Vũng Tàu. Tuy nhiên, sản xuất hồ tiêu tại tất cả các vùng trồng tiêu chính trong cả nước đang chịu tổn thất đáng kể do bệnh vàng lá chết chậm mà một trong những nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita ( Đào Thị Lan Hoa và ctv, 2003; Trình, 2010). 1
Ngoài gây hại trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, tuyến trùng còn tạo điều kiện cho các loài nấm như Pythium, Fusảium, Phytopthora … xâm nhiễm và gây hại cho cây trồng. Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay là sử dụng các loại thuốc hóa học đặc hiệu như Marshal, Oncol, Nokaph, Tervigo và Vimoca (Đỗ Thị Kiều An và ctv, 2015). Tuy thuốc hóa học có làm mật số tuyến trùng nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu. Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để phòng trừ tuyến trùng. Đặc biệt, nấm Paecilomyces lilacinus được xem là một trong những tác nhân có khả năng phòng trừ tuyến trùng hiệu quả cao nhất (Burges H. D., 1998; Butt T. M và Copping L., 2000). Tuy nhiên ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces spp vẫn còn hạn chế. Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu” Mục đích nghiên cứu Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm phòng trừ tuyến trùng hại cây hồ tiêu từ nấm Paecilomyces lilacinus và xác định hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. của chế phẩm Paecilomyces lilacinus. 2
Nội dung đề tài Khảo sát độ ẩm thích hợp để nhân sinh khối chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. Khảo sát chất mang phối trộn phù hợp để bảo quản chế phẩm từ nấm Paecilomyces lilacinus. Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne của chế phẩm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đánh giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trên đồng ruộng. 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Loài: Paecilomyces lilacinus Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6 loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài. Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều loài trong nhóm hai này ký sinh gây bệnh côn trùng. Theo điều tra của bộ Nông nghiệp Ấn Độ, chủng nấm Paecilomyces sp. an toàn với động vật máu nóng, không gây ngộ độc qua đường hô hấp, không gây độc khi nuốt phải. 4
Paecilomyces lilacinus: Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 270C ± 20C. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). 1.1.2. Đặc điểm sinh thái Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces lilacinus có thể ở dạng thảm nhung, dạng bó sợi, có màu trắng, hồng nhạt, màu tím đinh hương (nên còn được gọi là nấm tím), màu nâu vàng, màu nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt (tùy loài). Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces spp. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) 5
Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, gốc cuống dạnh bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus (Nguồn: http://www.chungvisinh.com/paecilomyces-lilacinus-nbrc-32861.html/) Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 27oC. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). 6
Hình 1.3. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus 1.1.3. Các nghiên cứu về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng Nấm gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trong việc khống chế tuyến trùng và tuyến trùng gây hại. Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do tuyến trùng gây hại của các chủng nấm ký sinh được trình bày rất rõ trong nhiều công trình của các tác giả trên thế giới: V.P. Paspelop (1932- 1940), Dusky S.R. (1959), Tanada I. (1959 -1964), Hall I. M. (1964) (dẫn theo Nguyễn Ngọc Tú, 1997). Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thống quản lý sâu hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS., 1986). Trên thế giới, việc sử dụng nấm ký sinh gây bệnh để phòng trừ sinh học đối với các loài tuyến trùng và tuyến trùng đã được quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ 19. Nhiều loài nấm có khả năng nhiễm và tiêu diệt trứng tuyến trùng. Hầu hết các loài nấm này có cơ chế hoạt động là hoại sinh và xâm nhập vào trứng gây chết. Các loài nấm ký sinh trứng tuyến trùng bao gồm Paecilomyces, Pochonia và Verticilium. Paecilomyces lilacinus và Pochonia chlamydosporiaare cho hiệu quả 7
ký sinh trứng tuyến trùng tốt nhất. Paecilomyces lilacinus được chứng minh kiểm soát thành công tuyến trùng sần rễ, M. javanica và M. incognita trên cà chua, cà tím và các loài rau khác (Cayrol et al, 1989; Verdejo – Lucas et al, 2003; Goswami và Mittal, 2004; Van Damme et al, 2005; Goswami et al., 2006; Haseeb và Kumar, 2006). Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq (2016) thực hiện nghiên cứu sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên cây cà tím. Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện nhà lưới vào 7 ngày đã chứng minh được rằng, Paecilomyces lilacinus có khả năng làm giảm số lượng lớn tuyến trùng và có khả năng thay thế cho các loài thuốc hóa học phòng trừ tuyến trùng. Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôi cấy các nấm ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng hại đã được phát triển rất mạnh mẽ nhưng chủ yếu là nấm Metarhizium và Beauveria. Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu của Muller Cogler E. (1961), Hall I. M. (1963- 1964), Camera J. W., Mac Bain (1963 - 1967), Madelin M. F. (1965 - 1966), Ignoffo C. M. (1977), H.D Burges và CS. (1982), N. K. Maniania và CS. (1984) (theo Nguyễn Ngọc Tú và CS.,1997), Ferron P. (1978). Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất tỉ mỉ về phương pháp để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôi cấy, phương pháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phẩm sinh học và sử dụng chúng để phòng trừ sâu hại và tuyến trùng trên đồng ruộng. Trong những năm gần đây, một số các công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh tuyến trùng. Các chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâu hại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS., 2002). Alamgir Khan, Kleith L. Williams, Helena K.M. Nevalainen (2004) thực hiện nghiên cứu về ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase từ nấm Paecilomyces 8
lilacinus trên cấu trúc vỏ và sự nở của tuyến trùng Meloidogyne javanica. Một serine protease và một enzyme được chuẩn bị từ 6 chitinase, được tách chiết và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy lỏng chủng nấm Paecilomyces lilacinus 251, tấn công vào các trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để nghiên cứu hiệu quả của các loại enzyme đến cấu trúc vỏ trứng. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử chứng minh rằng enzyme protease và chitinase đã làm thay đổi lớn cấu trúc của vỏ trứng khi chúng tấn công riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau. Dưới tác động protease lên vỏ trứng, lớp lipid biến mất và lớp chitin mỏng hơn. Khi sử dụng chitinase có lớp không bào lớn, lớp viteline bị chia ra và mất đi tính toàn vẹn của nó. Những thay đổi lớn trên lớp vỏ trứng xảy ra do ảnh hưởng khi kết hợp enzyme protease và chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. Lớp chitin bị thủy phân và lớp vitelline mất đi tính vẹn toàn. Hiệu lực của enzyme chitinase và protease từ nấm Paecilomyces lilacinus khi sử dụng riêng rẻ hoặc kết hợp cũng cho kết quả làm giảm sự nở của con cái tuyến trùng M. javanica. Nghiên cứu chỉ ra rằng một số tuyến trùng đã nở khi được tiếp xúc với enzyme của nấm sẽ có sự hiện diện của enzyme chitinase từ nấm Paecilomyces lilacinus giữ lại hoạt động của chúng dưới sự hiện diện của protease nội sinh. Mendoza A.R.,R.A.Sikora,vàS.Kiewnick. (2007) đã thực hiện nghiên cứu về sự ảnh hưởng của Paecilomyces lilacinus chủng 251 lên kiểm soát sinh học tuyến trùng Radopholus similis ở cây chuối. Khả năng nâng cao hiệu quả diệt tuyến trùng của chủng nấm đã được chứng minh. Sự tương quan đáng kể giữa liều dùng và nồng độ để kiềm hãm R. similis đã được xác định. Ở nồng độ 6 × 106 cfu/g đất khô được xem là liều dùng tối ưu của P. lilacinus. Tác giả chứng minh rằng P. lilacinus là tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại R. similis và cũng là nhân tố quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng trên cây chuối. Năm 2006, M. Nasr Esfahani và B. Ansari Pour nghiên cứu hiệu quả của nấm Paecilomyceslilacinus trong kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne javanica và ảnh hưởng của nấm đến sự phát triển của cây cà chua trong điều kiện nhà kính. Kết quả chứng minh rằng P. lilacinus cải thiện sự phát triển cây trồng và làm giảm đáng kể 9
số lượng tuyến trùng và trứng tuyến trùng khi bị nhiễm M. Javanica như tác nhân gây bệnh làm rễ sần to. Nấm sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi nấm và tuyến trùng được nhiễm đồng thời hoặc nấm được nhiễm trước và tuyến trùng nhiễm sau. Tuyến trùng đã trưởng thành bị tấn công hoặc bị chết đều có sự hiện diện của sợi nấm trên cơ thể chúng. Cheu Guan Pau và cộng sự (2012) đã phân lập được 10 chủng nấm Paecilomyces lilacinus từ đất vườn trồng 2 loại tiêu đen ở Sarawark có thể phòng trừ tuyến trùng gây sần rễ. Sau quá trình nghiên cứu, thí nghiệm đã chỉ ra rằng cả 10 chủng nấm nêu trên đều có khả năng phòng trừ tuyến trùng với mật độ bào tử 105 bào tử / ml. Hiện nay, có rất nhiều nơi trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ nấm Paecilomyces vào trong thực tiễn đời sống. Một số sản phẩm phòng trừ tuyến trùng đã được thương mại hóa như nemaxxion biol do công ty Greencorp,2014 sản xuất lên men lỏng, bao gồm các loại vi khuẩn và nấm (Bacillus subtilis, Trichoderma spp. và Paecilomyces spp.) hay REM G cũng là một sản phẩm phòng trừ tuyến trùng bao gồm các chủng nấm Arthrobotrys spp., Mycorrhia (Glomus spp.), Dactyllela spp., Paecilomyces lilacinus, và các loại vi khuẩn (B. spp) và (Pseudomonas spp.), sản phẩm được bổ sung enzyme chitinolytic, protease và enzyme lipolytic nhằm phá vỏ thành tế bào của tuyến trùng. Các sản phẩm này có hiệu lực cao trên cây cà chua ở vùng Souss – Massa Draa ở Morocco. 1.1.4. Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sản xuất và bảo quản chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ cao (Trần Văn Mão, 2002). Ẩm độ cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độ thấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34% hơn là khi ẩm độ 75%. Theo M. Nagesh và cộng sự (2007), thí nghiệm về sự tương quan giữa lượng nước bổ sung vào khối lượng hạt lúa mì (cơ chất rắn ban đầu) với tỉ lệ 1,0 :1,0 ; 10
1,5 :1,0 ; 2,0 :1,0 (v/w) ảnh hưởng đến phát triển sợi nấm và sản xuất bào tử của nấm kí sinh tuyến trùng Paecilomyces lilacinus PDBC PL55 và Pochonia chlamydosporia PDBC PC57. Sự bổ sung nước vào cơ chất sẽ làm tăng độ ẩm cơ chất, sẽ gây ảnh hưởng đến thời gian hình thành sợi nấm và số lượng bào tử thu hoạch được trong 1 chu kỳ sản xuất. Độ ẩm cơ chất ban đầu càng cao ( 74-76%) sẽ khiến cho thời gian để sấy khô cơ chất kéo dài tới 8-9 ngày để hạn chế sự nhiễm khuẩn tới độ ẩm thích hợp (15-18%). Lượng nước tối ưu bổ sung vào cơ chất ban đầu cho sự sản xuất bào tử cho 2 chủng nấm P.lilacinus và P.chlamydosporia là 1:1. 1.2. Tổng quan về tuyến trùng Tuyến trùng ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman và et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40%- 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Tuyến trùng hại rễ là một loài sống ký sinh thực vật, thuộc chi Meloidogyne. Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp. gây tổn hại 20% - 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972). Chúng tồn tại trong đất ở những vùng có khí hậu nóng bức hay có mùa đông ngắn. Có khoảng 2000 loài thực vật có thể bị nhiễm tuyến trùng hại rễ và chúng gây mất mát 5% sản lượng thực vật trên toàn cầu mỗi năm. Ấu trùng của chúng xâm nhiễm vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, đồng thời chúng làm mất khoáng chất của cây và khả năng quang hợp. Khi chúng 11
xâm nhiễm vào cây con thì kết quả chắc rằng cây đó sẽ chết, còn nếu nhiễm vào cây đã trường thành thì chỉ làm giảm năng suất của cây đó. 1.2.1. Đặc điểm sinh thái Meloidogyne thuộc nhóm động vật kí sinh cây trồng, chúng phân bố khắp thế giới và gần như kí sinh ở tất cả thực vật bậc cao. Chúng sống và sinh sản trong các tế bào sống bị biến đổi của rễ thực vật. Vì tạo nên những vết sưng trên rễ nên người ta gọi chúng là tuyến trùng sần rễ. Chúng có khả năng sinh sản và phát triển rất nhanh làm cho cây trồng bị thiệt hại nặng nề. Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne spp. có các đặc điểm như sau: Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn hay quả lê, màu trắng, ít vận động, không có giai đoạn u nang. Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 - 15 µm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoảng giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chấ đặc sệt để bảo quản trứng và đẻ trứng ra ngoài. Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Có kim chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18 – 25µm. Tuyến hầu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 – 33µm, ống dẫn dài từ 7 – 11µm. Có một tinh hoàn. Ấu trùng: Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọc gelatine (gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt hay bên trong của nốt sần rễ. Tuyến ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40% - 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt 12