Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành part 10

Chia sẻ: Afsjkja Sahfhgk | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

148
lượt xem 42
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Theo R. Cavalier-Smith thì Cổ trùng (như Giardia) bao gồm các cơ thể đơn bào nguyên thuỷ có nhân thật, có ribosom 70S, chưa có bộ máy Golgi, chưa có ty thể (mitochondria) chưa có thể diệp lục (Chloroplast), chưa có peroxisome. Sắc khuẩn bao gồm phần lớn các cơ thể quang hợp chứa thể diệp lục trong các phiến (lumen) của mạng lưới nội chất nhăn (rough endpplasmic reticulum) chứ không phải trong tế bào chất (cytoplasm), chẳng hạn như Tảo silic , Tảo nâu, Cryptomonas, Nấm noãn....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành part 10

Sw: Nư c trong ñ t (g nư c/ g ñ t khô) . Tính lư ng cacbon sinh kh i Bc,, theo công th c (3): Bc = Ec/ kEC …(3) Trong ñó: Ec= (kh i lư ng cacbon h u cơ chi t ñư c t ñ t xông hơi) – (kh i lư ng cacbon h u cơ chi t ñư c t ñ t không xông hơi) KEC= 0.38. H s kEC ñư c tính toán t m i liên quan gi a k t qu c a nh ng phương pháp - xông hơi và phương pháp chi t-xông hơi (12 lo i ñ t). 2.2.4. Xác ñ nh cacbon sinh kh i vi sinh v t b ng phân tích cacbon theo phương pháp quang ph * Nguyên t c V i s có m t c a kali persunphat (K2S2O8), cacbon h u cơ chi t ñư c c a ñ t b oxy hoá thành cacbon dioxit và lư ng cacbon dioxit ñư c ño b ng ph (IR) và (UV). - Thu c th b sung + Kali persunphat (K2S2O8.). + Axit photphoric. + Natri polyphosphat [(NaPO3)m], r t tinh khi t - Thu c th Kali persunphat: Hoà tan 20 g kali sunphat trong 90 ml nư c c t, dùng axit phosphoric ñi u ch nh pH c a dung d ch b ng 2 và sau ñó cho nư c c t v a ñ ñ n 1000ml. - Thu c th natri polyphosphat: Hoà tan 50 g natri polyphosphat trong 90 ml nư c c t, dùng axit phosphoric ñi u ch nh pH c a dung d ch trên ñ n 2 sau ñó thêm nư c c t ñ n 1000ml - Thi t b b sung + Máy phân tích cacbon t ñ ng v i b phát hi n h ng ngo i ho c v i h th ng dòng liên t c v i ñ u ño so màu. Trong tiêu chu n này vi c xác ñ nh cacbon sinh kh i vi sinh v t d a trên cơ s oxy hoá cacbon h u cơ b ng persunphat ñư c ho t hoá tia c c tím. - Cách ti n hành ð i v i phương pháp oxy hoá t ñ ng b ng persunphat – tia c c tím, tr n 5ml ph n chi t t ñ t b ng dung d ch kali sunphat v i 5 ml thu c th natri polyphosphat. B t kỳ k t t a nào c a CaSO4 ñ u ñư c hoà tan trong quá trình này. Thu c th kali persunphat ñư c ñưa m t cách t ñ ng vào bu ng oxy hoá UV, ñây s oxy hoá thành CO2 ñư c th c hi n b ng tia c c tím. CO2 ñư c t o thành ñư c ño b ng h p th h ng ngo i hay b ng quang ph UV. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………89
2.2.5. Tính toán k t qu - Tính lư ng cacbon h u cơ chi t ñư c (C) theo công th c (4): C (g/g ñ t khô) = [(V x DV) – (B x DV)] x (Pk/ Dw + Sw) …(4) Trong ñó: V: C(g/ ml) c a m u B: C(g/ ml) c a m u tr ng DV: ð pha loãng c a m u b ng natri phosphat (ml) DB: ð pha loãng c a m u tr ng b ng natri phosphat (ml) PK : Kh i lư ng dung môi chi t (g) DW: Kh i lư ng ñ t khô (g) SW : Nư c trong ñ t (g nư c/ g ñ t khô) - Tính lư ng sinh kh i BC s d ng công th c: BC = Ec/kEC (5) Trong ñó: EC = (cácbon h u cơ chi t ñư c t ñ t xông hơi) – (cácbon h u cơ chi t ñư c t ñ t không xông hơi) KEC = 0,35 H s KEC ñư c tính t m i liên quan gi a k t qu c a phương pháp xông hơi và k t qu c a phương pháp chi t – xông hơi (23 lo i ñ t) Có th s d ng phương pháp chi t - xông hơi k t h p v i phương pháp nghiên c u phân hu c a các ch t h u cơ ñánh d u 14C. * Qui trình chi t sơ b v i ñ t có ch a nhi u r cây s ng Cho ñ t m (25 ñ n 50 g kh i lư ng khô) vào bình thu tinh 250 ml có ch a 100 ml dung d ch kali sunphat ñ chi t trong vòng 20 phút trên máy l c và sàng (ñ i v i ñ t canh tác kích thư c l là 2mm, còn ñ i v i ñ t ñ ng c là 3mm). R a th t s ch r cây (và h t ñá nh ) trên sàng b ng 75 ml dung d ch kali sunphat b sung thêm và s y khô, cân chúng. Ly tâm kho ng 500 g huy n phù g m ñ t và dung d ch kali sunphat trong bình thu tinh trong 15 phút. Sau ñó ch t nư c l c phía trên. Cho thêm 3 gi t cloroform vào ñ t ñ xông hơi. Qui trình như trên. N u có các r cây s ng trong ñ t thì nh t thi t ph i s d ng qui trình trên. Hơn n a, qui trình nay t o cho vi c ño nitơ sinh kh i vi sinh v t d dàng hơn b ng vi c gi m nitơ vô cơ n n có trong ñ t. Nó còn gi m nh ng khó khăn khi ño sinh kh i vi sinh v t trong ñ t khô và vì v y r t ti n l i cho vi c ño s dao ñ ng c a cacbon sinh kh i vi sinh v t ñ t và nitơ trong năm. Sinh kh i vi sinh v t ño ñư c không b chi t tách ra kh i ñ t b ng qui trình chi t sơ b này. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………90
3. Xác ñ nh sinh kh i nitơ c a vi sinh v t ñ t Sau khi xông hơi b ng cloroform, m u ñ t ñư c chi t b ng dung d ch kali sunphat. Nitơ t ng s trong d ch l c ñư c xác ñ nh và bi n ñ i sang nitơ sinh kh i (Brookes và cs, 1985). Nitơ t ng s ñư c xác ñ nh theo phương pháp Kjeldahl. 3.1. V t li u, hoá ch t và thu c th Các v t li u, hoá ch t, d ng c và thu c th chu n b như xác ñ nh cacbon sinh kh i vi sinh v t trên. 3.2. Th t c ti n hành 3.2.1. Chi t - xông hơi Xông hơi 150-200g m u ñ t m b ng cloroform trong 24h gi ng như phân tích cacbon sinh kh i trên. Sau ñó (ngư c v i k thu t chi t-xông hơi trên, cloroform không ñư c tách ra kh i m u), tr n ñ t xông hơi v i dung d ch kali sunphat theo t l 1:4, l c 30 phút và l c làm m u phân tích (3 l n l p l i). Ti n hành tương t v i m u ñ i ch ng không xông hơi (3 l n l p l i). Ti n hành phân tích lư ng nitơ t ng s trong d ch l c ngay theo phương pháp Kjeldahl. Có th c t gi d ch l c 4oC cho ñ n khi phân tích. 3.2.2. Phân tích nitơ theo phương pháp kjeldahl - D ng c , hoá ch t b sung: + Bình Kjeldahl (250ml), b c t ñ m Kjeldahl + Axit sunfuric H2SO4 (p = 1.84 g/ml) + H2SO4 0,05M + H n h p xúc tác: 100g K2SO4 + 10g CuSO4 + 1g Se, nghi n nh + NaOH 32% (w/v) + Axit boric 2% (w/v) + Dung d ch ch th (ví d xanh bromcresol, ñ metyl) - Ti n hành: Cho 0,5g h n h p xúc tác và 20ml H2SO4 ñ c vào bình d ch l c, công phá cho ñ n khi thu ñư c dung d ch trong, ñ ngu i nhi t ñ phòng. Cho 10ml axit boric và vài gi t ch th vào bình h ng d ch chưng c t. Sau khi thêm xút dư ti n hành chưng c t 3-20 phút ñ chuy n hoàn toàn NH3 vào bình ch a axit boric và ch th . Xác ñ nh N-NH4 b ng chu n ñ v i H2SO4 0,05M (ñi m chu n ñ là dung d ch chuy n t xanh sang h ng. Lư ng nitơ trong m u ñư c tính theo công th c sau: (S-C).1,4.100.100 = %N A. SW.1000 Trong ñó: S: Lư ng axit H2SO4 0,05M dùng cho m u (ml) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………91
C: Lư ng axit H2SO4 0,05M dùng cho ñ i ch ng (ml) 1,4: H s chuy n ñ i (1ml H2SO4 0,05M tương ng v i 1,4 mgN) 100: Lư ng d ch tiêu th (ml) A: ư c s d ch tiêu th (ml) SW: Lư ng ñ t ban ñ u 100.1000-1: H s chuy n ñ i (%, w/w) 3.3. Tính k t qu Nitơ sinh kh i vi sinh v t ñư c tính theo phương trình: (S-C) = µg N.g-1 dm 0,54 Trong ñó: Giá tr c a m u (µg N-NH4.g-1dm) S: Giá tr ñ i ch ng (µg N-NH4.g-1dm) C: 0,54: H s KEN (m i quan h gi a nitơ sinh kh i VSV và nitơ t ng s trong ñ t). * Câu h i ôn t p: Bài s 17 1 Sinh kh i VSV có môi quan h m t thi t v i s n ph m nuôi c y và môi trư ng lên men? 2. Các phương pháp th và các lo i thu c th , các công th c tính cho t ng nhóm VSV? 2. Tính toán k t qu thí nghi m c a t ng lo i sinh kh i cho t ng nhóm VSV chuyên tính? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………92
Bài s 18 SINH TRƯ NG C A VI SINH V T M c ñích yêu c u: + Xác ñ nh các ñi u ki n nuôi c y cho m i lo i VSV: h o khí, y m khí b t bu c, y m khí không b t bu c. + Hi u rõ 3 phương pháp nuôi c y vi khu n y m khí. + Xác ñ nh 4 pha c a ñư ng cong sinh trư ng c a m t vi khu n ñi n hình. N i dung ki n t p: + Nuôi c y vi khu n y m khí. + ðo ñ ñ c sinh trư ng c a vi khu n. Gi i thích s li u sinh trư ng c a vi khu n trên ñ th . + Xác ñ nh nh hư ng c a nhi t ñ ñ n s sinh trư ng c a VSV. 1. Nguyên lý chung Vi sinh v t có nh ng yêu c u v dinh dư ng, lý h c, hoá h c và môi trư ng ph i ñư c ñáp ng ñ sinh trư ng và phát tri n. Ki n th c v các ñi u ki n c n thi t cho sinh trư ng c a VSV có th giúp d dàng nuôi c y các VSV và ñi u khi n các VSV không mong mu n. Năm 1861, Jean Baptiste Dumas ñã trình bày m t báo cáo t i vi n hàn lâm Pasteur. Trong bài báo này, ông b t ñ u: “ S t n t i c a l p trùng mao có các ñ c trưng c a các men là ñáng chú ý, nhưng m t ñ c trưng c n ñư c quan tâm nhi u hơn là các ñ ng v t nh trùng mao này s ng và nhân lên vô h n trong s v ng m t c a lư ng không khí nh nh t ho c oxy t do…” Khi chúng ta nói không khí là m t yêu c u sinh trư ng, chúng ta c n xem xét lư ng oxy trong không khí. Hơn th n a, khi chúng ta nh c ñ n oxy, chúng ta thư ng mu n nói ñ n oxy phân t (O2) ñóng vai trò là m t ngu n cung c p ñi n t trong hô h p h o khí. Các ñi u ki n v t lý trong môi trư ng nh hư ng ñ n s sinh trư ng c a VSV là nhi t ñ , áp su t th m th u và pH. 2. Oxy và s sinh trư ng c a vi sinh v t S có m t hay v ng m t phân t oxy (O2) có th là vô cùng quan tr ng ñ i v i s sinh trư ng c a VSV. M t s VSV g i là VSV h o khí ñòi h i có oxy, trong khi các VSV khác g i là VSV y m khí l i không s d ng oxy. M t lý do khi n VSV y m khí b t bu c không th ch u ñư c s có m t c a oxy là chúng thi u catalaza và k t qu là s tích lu hydro peroxyt gây ch t t bào. Các loài h o khí ch u khí có th không s d ng oxy nhưng ch u ñư c nó kha t t, m c dù s sinh trư ng c a chúng có th ñư c tăng cư ng trong ñi u ki n vi h o khí h u h t các VSV này trao ñ i ch t theo ki u lên men. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………93
M t s lo i vi khu n ch u khi m t ph n sinh trư ng t t nh t trong khí quy n có n ng ñ CO2 tăng (7-10%) và n ng ñ O2 th p hơn. Chúng s sinh trư ng trong môi trư ng ñ c ñ sâu mà m t lư ng nh oxy có th t n m n vào. ð nuôi c y các VSV ch u khí m t ph n trên ñĩa petri và môi trư ng không nghèo ñi, m t bình cây n n ñư c s d ng. Các ñĩa và ng nghi m x lý ñư c ñ t trong bình l n v i m t cây n n sáng. Sau khi ñ y nút, t t n n ñi khi n ng ñ oxy gi m. Các VSV có kh năng s ng trong ñi u ki n có ho c không có oxy g i là VSV yêm khí không b t bu c. 4 gi ng vi khu n thi u catalaza là Streptococcus, Leucconostoc, Lactobacillus và Clostridium. Trong ñó Clostridium là y m khí b t bu c, còn 3 gi ng kia y m khí ch u khí. 3 loài này không có h th ng xytocrom ñ s n sinh ra hydro peroxyt, do ñó không c n catalaza. Vi c xác ñ nh s có hay không có m t catalaza là r t h u ích trong ñ nh lo i vi khu n. Khi m t vài gi t hydro peroxyt 3% ñư c cho vào khu n l c và catalaza hi n di n, phân t oxy ñư c gi i phóng ra dư i d ng b t khí. Trong phòng thí nghi m, chúng ta có th nuôi c y vi khu n y m khí b t bu c ho c không b t bu c b ng cách lo i tr oxy t do t môi trư ng ho c s d ng môi trư ng bi n ñ i. Nhi u phương pháp nuôi c y VSV y m khí gi i quy t ñư c c 2 quá trình này. T t c các phương pháp nuôi c y VSV y m khí ch hi u qu n u như m u hay các VSV nuôi c y ñư c thu th p và chuy n ñi theo cách làm gi m thi u s bi u l c a oxy. 2.1. V t li u ðĩa petri ch a môi trư ng dinh dư ng ng nghi m ch a môi trư ng Thioglycolat có ch th Bình y m khí Hydro peroxyt 3% 2.2. D ch nuôi c y Alcaligenes Clostridium Enterococus Escherichia coli 2.3. Th t c ti n hành - Không l c ng Thioglycolat. - Dán nhãn 4 ng canh thang và nhi m m i ng m t vòng que c y m t lo i vi khu n trong ñi u ki n vô trùng. - Nuôi 35oC - Ghi l i s xu t hi n sinh trư ng m i ng. - Dùng bút ñánh d u dư i ñáy chia m i ñĩa th ch thành 4 ph n. Dán nhãn 1 ñĩa hào khí và 1 ñĩa y m khí. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………94
- Ria c y 1 ñư ng ñơn các vi khu n trên m i ph n ñĩa. - ð t ngư c ñĩa h o khí nuôi 35oC. ðĩa y m khí ñư c ñ t ngư c trong bình . - Ngư i hư ng d n s ch ng minh làm th nào ñ bình tr thành y m khí. 10 ml nư c ñư c thêm vào túi ñi u ch nh khí Gas-Pak (xúc tác hydro k t h p oxy t o thành nư c, ph n ng s d ng l i khi thêm nư c vào) ñ t trong bình v i ch th xanh methylen. Khi có m t c a oxy ch th có màu xanh, chuy n thành tr ng khi oxy gi m ñi. - Nuôi bình 35oC - Sau khi nuôi c y, ghi l i s sinh trư ng c a vi khu n trên m i ñĩa. - Th c hi n ki m tra th catalaza b ng cách cho thêm vài gi t H2O2 3% vào các khu n l c khác nhau trên ñĩa th ch. Test catalaza dương tính s sinh ra b t bong bóng tr ng. Có th dùng kính hi n vi ñ xác ñ nh rõ hơn các b t bóng. Test th catalaza cũng có th ñư c th c hi n trên lam kính. Vi khu n sinh trư ng trên môi trư ng th ch máu có th s d ng phương pháp này. 3. Xác ñ nh ñư ng cong sinh trư ng c a vi khu n: nh hư ng c a ñi u ki n nhi t ñ Các pha sinh trư ng c a VSV có th ñư c xác ñ nh b ng cách ñ ñ c c a dich nuôi c y. ð ñ c không ph i là ñơn v ño lư ng tr c ti p s lư ng VSV, nhưng ñ ñ c tăng ñã ch ra s sinh trư ng c a VSV. T s hi n di n c a 1 tri u t bào/ml có th phân bi t ñ ñ c b ng m t, máy ño quang ph ñư c s d ng ñ ño xác ñ nh ñ ñ c v i lư ng VSV nh hơn. ða s VSV sinh trư ng trong m t kho ng nhi t ñ nh t ñ nh. Nhi t ñ sinh trư ng t i thi u là nhi t ñ th p nh t mà loài VSV ñó s phát tri n. Các loài VSV sinh trư ng nhanh nh t nhi t ñ sinh trư ng t i ưu c a chúng. Và nhi t ñ cao nh t mà chúng có th sinh trư ng là nhi t ñ sinh trư ng t i ña. Vi sinh v t ñư c chia thành 3 nhóm chính d a theo nhi t ñ sinh trư ng c a chúng. Nhi t ñ t i ưu c a VSV ưa l nh là 15oC, c a VSV ưa m là 25oC - 40oC. Nhi t ñ t i thích c a nhi u lo i ưa nhi t là 45-65oC, m c dù m t vài loài có kh năng sinh trư ng trên 90oC. Kho ng nhi t ñ ưa thích c a VSV do di truy n quy t ñ nh. Trong bài t p này, chúng ta s v bi u ñ ñư ng cong sinh trư ng c a m t lo i vi khu n các nhi t ñ khác nhau ñ ñưa ra kho ng nhi t ñ thích h p c a loài này. 3.1. V t li u Bình nón ch a d ch dinh dư ng + NaCl 1,5% ng nghi m ño quang ph Pipet 5 ml, 10ml vô trùng Máy ño quang ph 3.2. D ch nuôi c y Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………95
Vibrio natriegenes 3.3. Th t c ti n hành - Cho 4 ml d ch dinh dư ng vô trùng vào 1 ng ño quang ph . ng này là ñ i ch ng ñ chu n hoá máy ño. - Nhi m 10ml vi khu n Vibrio vào m t bình nón ch a d ch dinh dư ng. - Xoay bình ñ tr n l n dung d ch. Chuy n 4 ml t bình vào ng ño quang ph th 2, và ño s h p ph (Abs.) trên máy quang ph . - Ghi l i các k t qu ño ñư c. - ð bình nón nhi t ñ mong mu n. - Ghi l i s h p ph sau m i 10 phút cho ñ n 60 và 90 phút. L y bình ra kh i ch u nư c cho th i gian t i thi u có th ñ l y m u. Khi l y m u, dùng pipet vô trùng hút 4 ml cho vào ng ño quang ph th 2. - V ñ th t s li u thu ñư c ñ có ñư ng cong sinh trư ng c a VSV theo nhi t ñ . * Câu h i ôn t p: Bài s 18 1 Trình bày thuy t sinh trư ng và phát tri n c a VSV? 2. Tính toán k t qu thí nghi m theo sinh kh i VSV và các ñi u ki n c n và ñ c a t ng thí nghi m? Bài s 19 THĂM QUAN KI N T P MÔN H C M c ñích và yêu c u: + Nh m trang thi t b ki n th c th c t cho sinh viên v ng d ng công ngh VSV trong nông nghi p và x lý ô nhi m môi trư ng. + Yêu c u sinh viên tham gia ñ y ñ các bu i h c ngo i khóa theo chương trình môn h c. + Sau khi h c xong sinh viên ph i vi t ti u lu n v bài h c ngo i khóa. ð a ñi m h c ngo i khóa: + Các phòng thí nghi m VSV hi n ñ i chuyên ph c v trong gi ng d y & nghiên c u v lĩnh v c nông nghi p. + Các lo i ch ph m, phân VSV ñang ñư c s n xu t và áp d ng trong nông nghi p. + Trung tâm VSV ng d ng Trư ng ð i h c Khoa h c t nhiên. + Phòng nghiên c u VSV nông nghi p Trư ng ð i h c Nông nghi p I. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………96
+ Vi n Sinh h c Vi n khoa h c Vi t Nam. + Nhà máy (phân xư ng) phân h u cơ vi sinh v t (Sông Gianh t nh Ngh An, Ti n Nông t nh Thanh Hóa, Văn ði n Hà N i, Vi t Trì t nh Phú Th …và các t nh trên toàn qu c). + Vi n chăn nuôi thú y, xư ng s n xu t th c ăn gia súc, gia c m, thu c thú y các t nh + Các trang tr i, các công ty nuôi tr ng thu , h i s n trên toàn qu c. + Xí nghi p x lý ph th i ñô th các thành ph và các t nh. N i dung: + Xem cách thi t k phòng nghiên c u và ng d ng vi sinh v t. + Quan sát và tìm hi u các quy trình s n xu t ho c x lý ô nhi m môi trư ng trên cơ s ng d ng công ngh vi sinh v t. + Ti n hành l y m u ñ ki m tra ch t lư ng s n ph m cũng như ch ph m VSV. Bài s 19 THĂM QUAN KI N T P MÔN H C * Câu h i ôn t p: Vi t thu ho ch ñ t ki n t p t i các cơ s thăm quan, ki n t p? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………97
PH L C B NG 1: PHA DUNG D CH ð M SORENSEN I VÀ DUNG D CH Na2HPO4 1/15M VÀ KH2PO4 1/15M - S LƯ NG DUNG D CH (Ml) pH Na2HPO4 1/15 KH2PO4 1/15 M M 4,53 0,00 10,00 4,48 0,10 9,90 5,29 0,25 9,75 5,59 0,50 9,50 5,91 1,00 9,00 6,24 2,00 8,00 6,47 3,00 7,00 6,64 4,00 6,00 6,81 5,00 5,00 6,98 6,00 4,00 7,17 7,00 3,00 7,38 8,00 2,00 7,73 9,00 1,00 9,50 0,50 8,04 8,34 9,75 0,25 8,67 9,90 0,10 9,18 10,00 0,00 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………98