Kết quả phân tích gen ở 42 gia đình Việt Nam bị loạn dưỡng giác mạc di truyền

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> KẾT QUẢ PHÂN TÍCH GEN Ở 42 GIA ĐÌNH VIỆT NAM BỊ<br /> LOẠN DƢỠNG GIÁC MẠC DI TRUYỀN<br /> Nguyễn Thanh Hà*; Hoàng Minh Châu**; Kanai A***<br /> TÓM TẮT<br /> Phân tích gen ở 42 gia đình Việt Nam bị loạn dưỡng giác mạc (LDGM) di truyền. Chiết xuất chuỗi<br /> ADN từ bạch cầu, nhân bản và giải mã. Trong 13 gia đình LDGM dạng lưới, giải mã gen TGFBI tìm<br /> thấy đột biến R124C gây LDGM dạng lưới týp I (3 gia đình) và đột biến H626R gây LDGM dạng lưới<br /> týp IIIB (10 gia đình). Trong 8 gia đình LDGM dạng hạt, giải mã gen TGFBI tìm thấy đột biến R555W<br /> gây LDGM dạng hạt týp I (6 gia đình), đột biến R124H gây LDGM Avellino (1 gia đình) và đột biến<br /> D123H gây LDGM dạng hạt hình thái không điển hình (1 gia đình). Trong 19 gia đình LDGM dạng<br /> đốm, giải mã gen CHST6 tìm thấy 6 đột biến đồng hợp tử và 3 đột biến dị hợp phối hợp, trong đó<br /> R211Q hay gặp nhất (8 gia đình). Trong 2 gia đình LDGM dạng giọt gelatin, giải mã gen M1S1 tìm<br /> thấy đột biến 772 - 783del (ATCTATTACCTG) và 772insT và đột biến nt243insC dạng đồng hợp tử.<br /> Kết quả nghiên cứu khẳng định gen TGFBI gây LDGM dạng lưới và dạng hạt; gen CHST6 gây<br /> LDGM dạng đốm; gen M1S1 gây LDGM dạng giọt gelatin. Đột biến D123H gây LDGM dạng hạt hình<br /> thái không điển hình, đột biến 772 - 783 del (ATCTATTACCTG) và 772insT gây LDGM dạng giọt gelatin<br /> và nhiều đột biến gây LDGM dạng đốm lần đầu tiên được phát hiện ở người Việt Nam, chứng tỏ tính<br /> đa dạng của tổn thương gen gây bệnh. Khác biệt ở người Việt Nam so với người châu Á là LDGM<br /> dạng lưới týp IIIB hay gặp hơn so với týp I và LDGM dạng hạt týp I hay gặp hơn dạng Avellino.<br /> * Từ khóa: Loạn dưỡng giác mạc di truyền; Nhân bản; Giải mã; Đột biến.<br /> <br /> OUTCOMES OF GENE ANALYSIS FROM 42 VIETNAMESE<br /> FAMILIES WITH HEREDITARY CORNEAL DYSTROPHY<br /> SUMMARY<br /> Forty two Vietnamese families with hereditary corneal dystrophy (CD) was analysed for gen mutations.<br /> DNA was extracted from peripheral leukocytes, amplified and sequenced. In 13 families with lattice<br /> CD, sequencing of TGFBI gene which revealed R124C mutation caused lattice CD type I (3 families)<br /> and H626R mutation caused lattice CD type IIIB (10 families). In 8 families with granular CD, sequencing<br /> of TGFBI gene which revealed R555W mutation caused granular CD type I (6 families), R124H mutation<br /> caused Avellino CD (1 family) and D23H mutation caused atypical type of granular CD (1 family). In<br /> 19 families with macular CD, sequencing of CHST6 gene which revealed 6 homozygous mutations<br /> and 3 compound heterozygous mutations, among these R211Q was the most frequent (8 families).<br /> In 2 families with gelatinous drop-like CD, sequencing of M1S1 gene revealed 2 different homozygous<br /> mutations 772-783del (ATCTATTACCTG) and 772insT and nt243insC. These results confirmed that<br /> TGFBI gene caused lattice CD and granular CD; CHST6 gene caused macular CD and M1S1 gene<br /> caused gelatinous drop-like CD. Here, D123H mutation causing atypical granular CD, 772-783 del<br /> * Bệnh viện Hữu Nghị<br /> ** Bệnh viện Mắt Trung ương<br /> *** Đại học Juntendo, Tokyo Nhật Bản<br /> Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Trần Văn Khoa<br /> PGS. TS. Nguyễn Văn Đàm<br /> <br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> (ATCTATTACCTG) and 772insT mutation causing gelatinous drop-like CD and numerous<br /> mutations causing macular CD were first time found in Vietnamese, thus indicated heterogeneity<br /> of gene alteration. The differences found in Vietnamese in comparison with other Asian nationalities<br /> were: lattice CDtype IIIB more common than type I and granular CD type I more common than Avellino.<br /> * Key words: Hereditary corneal dystrophy; Amplification; Sequencing; Mutation.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> Thực nghiệm, mô tả lâm sàng.<br /> <br /> Kết quả phân tích tìm đột biến gen gây<br /> LDGM di truyền dạng lưới, dạng hạt, dạng<br /> đốm và dạng giọt gelatin ở người Việt Nam<br /> đã được báo cáo trên các tạp chí quốc tế<br /> [2, 3, 5, 6]. Nghiên cứu này nhằm: Tổng<br /> hợp, báo cáo kết quả chẩn đoán gen ở 4<br /> loại LDGM di truyền trên, đồng thời nhận<br /> xét điểm khác biệt về hình thái lâm sàng và<br /> tổn thương gen ở người Việt Nam.<br /> <br /> * Các bước nghiên cứu: chẩn đoán lâm<br /> sàng LDGM di truyền dạng lưới, dạng hạt,<br /> dạng Avellino, dạng đốm và dạng giọt<br /> gelatin bằng khám sinh hiển vi, dựa vào tổn<br /> thương giác mạc ở 2 mắt. Ghi nhận phả hệ<br /> của từng gia đình BN. Lấy mẫu máu từ tĩnh<br /> mạch ngoại vi. Phân tách tế bào bạch cầu<br /> từ mẫu máu bằng ly tâm, sau đó chuyển<br /> sang nghiên cứu tiếp tại Đại học Juntendo,<br /> Tokyo, Nhật Bản, theo giấy phép của Bộ Y<br /> tế Việt Nam số 10887 YT/QT. Chiết xuất<br /> chuỗi ADN của bộ gen. Nhân bản đoạn ADN<br /> chứa đột biến gen bằng PCR (polymerase<br /> chain reaction) với cặp mồi đặc hiệu. Nhân<br /> bản đoạn ADN với high pure PCR Purification<br /> kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim,<br /> Đức) và giải mã bằng máy giải mã gen tự<br /> động ADN Sequencer Model 373A (Applied<br /> Biosystems). Mảnh giác mạc bệnh lấy ra<br /> khi ghép giác mạc được nghiên cứu mô<br /> bệnh học.<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Loạn dưỡng giác mạc di truyền là nhóm<br /> bệnh giác mạc, không phải do viêm nhiễm,<br /> với biểu hiện tổn thương giác mạc cân<br /> xứng ở 2 mắt, tiến triển nặng dần, di truyền<br /> trội hoặc lặn nhiễm sắc thể thường. Theo vị<br /> trí tổn thương, LDGM chia thành LDGM<br /> biểu mô (gồm cả màng Bowman), LDGM<br /> nhu mô và LDGM nội mô (gồm cả màng<br /> Descemet). Theo hình thái tổn thương, LDGM<br /> được phân chia thành LDGM dạng lưới,<br /> LDGM dạng hạt, LDGM Reis-Bücklers, LDGM<br /> nội mô Fuch, LDGM dạng đốm, LDGM dạng<br /> giọt gelatin...<br /> <br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 42 gia đình người Việt Nam được chẩn<br /> đoán lâm sàng bị LDGM di truyền, bao gồm<br /> bệnh nhân (BN) và thân nhân khỏe mạnh.<br /> Đối chứng: 50 người Việt Nam khỏe mạnh,<br /> không có bệnh giác mạc, không có quan hệ<br /> huyết thống với gia đình BN.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> <br /> Nghiên cứu bao gồm 42 gia đình được<br /> chẩn đoán LDGM di truyền, đến từ các tỉnh<br /> miền Bắc và miền Trung Việt Nam. Trong<br /> đó, 3 gia đình LDGM dạng lưới, 8 gia đình<br /> LDGM dạng hạt, 19 gia đình LDGM dạng<br /> đốm và 2 gia đình LDGM dạng giọt gelatin.<br /> 1. LDGM dạng lƣới.<br /> <br /> 2<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> LDGM dạng lưới (lattice corneal dystrophy)<br /> týp I là bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể<br /> thường, khởi phát từ trẻ nhỏ, chất lắng<br /> đọng amyloid ở lớp nhu mô và dưới biểu<br /> mô vùng giác mạc trung tâm nằm thành dải<br /> mảnh, màu xám nhạt, với nhiều nhánh đan<br /> xen như hình lưới và thường gây trợt biểu<br /> mô giác mạc tái phát. LCD dạng lưới týp II<br /> (hội chứng Meretoja) là bệnh toàn thân,<br /> lắng đọng amyloid ngoài giác mạc còn thấy<br /> ở da, thận và các tổ chức khác. Tổn thương<br /> giác mạc dạng lưới ít nhưng to, dày, chủ<br /> yếu ở giác mạc chu biên. LDGM dạng lưới<br /> týp III có đặc điểm là khởi phát muộn (70 90 tuổi), tổn thương dạng lưới to, dày, từ<br /> rìa tới rìa giác mạc, di truyền lặn không giới<br /> tính. LDGM dạng lưới týp IIIA cũng khởi<br /> phát muộn, tổn thương dạng lưới to, dày, từ<br /> rìa tới rìa giác mạc nhưng di truyền trội<br /> không giới tính, thường gây trợt biểu mô<br /> giác mạc. Năm 1997, Munier và CS [9] đã<br /> tìm đột biến R124C ở gen TGFBI (human<br /> transforming growth factor beta-induced)<br /> trên nhiễm sắc thể số 5 gây LDGM dạng<br /> lưới týp I [9].<br /> Trong 13 gia đình LDGM dạng lưới (34<br /> BN, 21 thân nhân), về lâm sàng có thể nhận<br /> thấy 2 hình thái tổn thương giác mạc khác<br /> nhau. Hình thái điển hình của LDGM dạng<br /> lưới týp I với tổn thương lưới mảnh, nhỏ<br /> dưới biểu mô và trong nhu mô. Khởi phát từ<br /> nhỏ, thị lực giảm sớm, 10 - 20 tuổi do trợt<br /> biểu mô giác mạc tái phát. Giải mã gen<br /> TGFBI, nhiễm sắc thể số 5, exon (đoạn<br /> ADN mang thông tin di truyền) số 4, phát<br /> hiện codon số 124 bình thường là CGC đã<br /> biến đổi thành TGC dưới dạng dị hợp tử,<br /> làm thay đổi axít amin arginine bằng cysteine<br /> (đột biến R124C). Tìm thấy đột biến R124C<br /> trong 3 gia đình (~ 23%) LDGM dạng lưới [2].<br /> Đa số gia đình LDGM dạng lưới có một<br /> hình thái lâm sàng khác với LDGM dạng<br /> <br /> lưới týp I: tổn thương dạng lưới ít hơn,<br /> nhưng to hơn, sâu hơn, xâm lấn đến gần<br /> rìa giác mạc hơn và thường không cân<br /> xứng ở 2 mắt. Khởi phát bệnh cũng muộn<br /> hơn. Trợt biểu mô giác mạc muộn hơn, gặp<br /> chủ yếu ở những BN trên 50 tuổi. Nghiên<br /> cứu mô bệnh học cho thấy: chất lắng đọng<br /> amyloid bắt màu với Congo đỏ ở lớp nhu<br /> mô giữa, nhu mô trước, ở cả trên và dưới<br /> màng Bowman. Giải mã gen TGFBI, nhiễm<br /> sắc thể số 5, exon số 14 thấy codon số 626<br /> bình thường là CAT đã bị biến đổi thành<br /> CGT dưới dạng dị hợp tử, làm thay đổi axít<br /> amin histidine bằng arginine (đột biến<br /> H626R). Đột biến H626R tìm thấy trong 10<br /> gia đình LDGM dạng lưới (~ 77%) đã gây<br /> LDGM dạng lưới týp IIIB [2].<br /> <br /> ¶nh 1: LDGM d¹ng l-íi týp IIIB.<br /> <br /> Hình 1: Giải mã gen TGFBI,<br /> codon số 626 (CATCGT, dị hợp tử).<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Bảng 1: Đột biến gen TGFBI trong 13 gia<br /> đình LDGM dạng lưới.<br /> (đột biến)<br /> <br /> Týp I<br /> Týp<br /> IIIB<br /> <br /> CGCTGC<br /> <br /> CATCGT<br /> <br /> Dị<br /> hợp<br /> tử<br /> <br /> ArginineCysteine<br /> (R124C)<br /> <br /> 3<br /> <br /> Dị<br /> hợp<br /> tử<br /> <br /> HistidineArginine<br /> <br /> 10<br /> <br /> (H626R)<br /> <br /> Kết quả giải mã gen TGFBI cho thấy: đột<br /> biến R124C ở BN LDGM dạng lưới týp I và<br /> đột biến H626R ở BN LDGM dạng lưới týp<br /> IIIB dạng dị hợp tử, không tìm thấy ở thân<br /> nhân cũng như ở nhóm đối chứng, phù hợp<br /> với kiểu hình của bệnh. Như vậy, đã gây<br /> LDGM dạng lưới ở người Việt Nam. Đột<br /> biến R124C cũng được phát hiện trong<br /> LDGM dạng lưới týp I ở người châu Á<br /> (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc) và<br /> người châu Âu. Hình thái LDGM dạng lưới<br /> týp IIIB có đột biến H626R chưa phát hiện<br /> thấy ở người Nhật và người Hàn Quốc,<br /> nhưng đã được phát hiện ở người Trung<br /> Quốc [4, 7, 10] và người châu Âu. Thực tế,<br /> LDGM dạng lưới týp IIIB gây ra do đột biến<br /> H626R, là dạng trung gian giữa týp I và týp<br /> IIIA (gần với týp III hơn), là dạng hay gặp ở<br /> người Việt Nam [2].<br /> 2. LDGM dạng hạt.<br /> LDGM dạng hạt (granular corneal dystrophy)<br /> týp I là bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể,<br /> khởi phát sớm, tổn thương giác mạc dạng<br /> hạt nhỏ, bờ rõ, màu trắng xám ở lớp nhu<br /> mô nông, tăng dần theo tuổi. Mặc dù chưa<br /> rõ bản chất nhưng chất lắng đọng ở giác<br /> mạc trong LDGM dạng hạt nhuộm màu đỏ<br /> tươi với Masson trichrome. Hình thái LDGM<br /> phối hợp tổn thương dạng hạt với dạng lưới<br /> ở cùng 1 mắt gọi là LDGM dạng Avellino.<br /> <br /> Đột biến R555W và R124H ở gen TGFBI,<br /> trên nhiễm sắc thể số 5 đã được xác định<br /> gây LDGM dạng hạt týp I và Avellino [9].<br /> Trong 8 gia đình LDGM dạng hạt (20 BN,<br /> 24 thân nhân), khám sinh hiển vi thấy: tổn<br /> thương giác mạc điển hình của týp I,<br /> Avellino và hình thái không điển hình. Giải<br /> mã gen TGFBI, exon 12 phát hiện codon số<br /> 555 bình thường là CGG đã biến đổi thành<br /> TGG, làm thay đổi axít amin arginine bằng<br /> tryptophan (đột biến R555W) trong 6 gia<br /> đình LDGM dạng hạt týp I (75%). Giải mã<br /> gen TGFBI, exon 4 phát hiện codon số 124<br /> bình thường là CGC đã biến đổi thành<br /> CAC, làm thay đổi axít amin arginine bằng<br /> histidine (đột biến R124H) trong 1 gia đình<br /> LDGM Avellino (12,5%). Trong gia đình<br /> LDGM Avellino, đột biến R124H ở trạng thái<br /> dị hợp tử ở cả cha lẫn mẹ và đồng hợp tử ở<br /> con trai, nên tổn thương giác mạc ở con trai<br /> rất nặng.<br /> <br /> Ảnh 2: LDGM dạng hạt, týp I.<br /> <br /> Ảnh 3: LDGM Avellino, đồng hợp tử.<br /> <br /> 4<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Trong gia đình còn lại, BN nam 42 tuổi,<br /> khám sinh hiển vi thấy tổn thương giác mạc<br /> dạng chấm mờ đục, nhỏ, nằm rải rác ở lớp<br /> nhu mô nông và nhu mô giữa, không thấy<br /> tổn thương dạng lưới, không thấy dấu hiệu<br /> trợt biểu mô giác mạc. Giải mã gen TGFBI,<br /> không thấy biến đổi ở codon 124 (exon 4)<br /> <br /> Ảnh 4: LDGM dạng hạt<br /> không điển hình.<br /> <br /> cũng như codon 555 (exon 12), nhưng lại<br /> phát hiện codon số 123 bình thường là<br /> GAC đã biến đổi thành CAC, làm thay đổi<br /> axít amin asparagine bằng histidine (đột<br /> biến D123H). Đột biến D123H phát hiện ở<br /> 3/5 thân nhân khỏe mạnh, nhưng không tìm<br /> thấy ở nhóm đối chứng.<br /> <br /> Hình 2: Giải mã gen TGFBI,<br /> codon 123 (GACCAC, dị hợp tử).<br /> <br /> Bảng 2: Đột biến gen TGFBI trong 8 gia đình LDGM dạng hạt.<br /> KIỂU<br /> ĐỘT BIẾN<br /> <br /> KIỂU GEN<br /> <br /> BIẾN ĐỔI AXÍT AMIN<br /> (đột biến)<br /> <br /> SỐ<br /> GIA ĐÌNH<br /> <br /> Týp I<br /> <br /> CGGTGG<br /> <br /> Dị hợp tử<br /> <br /> Arginine  Triptophan (R555W)<br /> <br /> 6<br /> <br /> Avellino<br /> <br /> CGCCAC<br /> <br /> Dị hợp tử<br /> <br /> Arginine  Histidine (R124H)<br /> <br /> 1<br /> <br /> Không điển hình<br /> <br /> GACCAC<br /> <br /> Dị hợp tử<br /> <br /> Asparagine  Histidine (D123H)<br /> <br /> 1<br /> <br /> LOẠI LDGM<br /> DẠNG HẠT<br /> <br /> Kết quả giải mã gen TGFBI cho thấy đột<br /> biến R555W ở BN LDGM dạng hạt týp I và<br /> R124H ở BN LDGM Avellino ở dạng dị hợp<br /> tử, không tìm thấy ở thân nhân cũng như ở<br /> nhóm đối chứng, phù hợp với kiểu hình của<br /> bệnh. Như vậy, đã gây LDGM dạng hạt týp<br /> I và Avellino ở người Việt Nam. Đột biến<br /> R555W và R124H cũng đã phát hiện trong<br /> LDGM dạng hạt týp I và Avellino ở người<br /> châu Á (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc)<br /> và người châu Âu. Tuy với số lượng còn<br /> hạn chế, nhưng ở Việt Nam, LDGM dạng<br /> <br /> hạt týp I với đột biến R555W hay gặp hơn<br /> so với LDGM Avellino. Ở người châu Âu,<br /> LDGM dạng hạt týp I với đột biến R555W<br /> cũng hay gặp hơn, trong khi đó ở người<br /> Nhật Bản và Hàn Quốc, LDGM Avellino với<br /> đột biến R124H lại gặp nhiều hơn [3, 4, 7, 10].<br /> Đột biến D123H dạng dị hợp tử, lần đầu<br /> tiên được phát hiện ở người Việt Nam bị<br /> LDGM dạng hạt, hình thái không điển hình,<br /> không tìm thấy ở nhóm đối chứng, nhưng<br /> lại tìm thấy ở 3/5 thân nhân khỏe mạnh,<br /> chứng tỏ D123H có thể gây LDGM dạng hạt<br /> <br /> 5<br /> <br />