KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

234
lượt xem 79
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong giới vi sinh vật, khi nhắc đến những ứng dụng của nấm men trong chế biến thực phẩm thì Saccharomyces đƣợc xem là một trong những ứng cử viên sáng giá nhất. Từ rất lâu, chúng đã đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm cho ngƣời nhƣ lên men rƣợu, bia, sản xuất men bánh mì, nƣớc giải khát có cồn… Và trong vài thập kỷ gần đây nó đã đƣợc sử dụng nhiều cho chăn nuôi nhƣ chế biến thức ăn giàu tinh bột từ các phế phụ phẩm công nông nghiệp, sản xuất sinh khối giàu...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ SINH TRƢỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: VƢƠNG THỊ HỒNG VI Thành Phố Hồ Chí Minh -09/2007-
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ SINH TRƢỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI VƢƠNG THỊ HỒNG VI Thành Phố Hồ Chí Minh -09/2007-
LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Em xin chân thành cảm ơn Ts. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Ts. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phòng. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 29, Thú Y 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Vƣơng Thị Hồng Vi
TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo, rỉ đƣờng và một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm” đƣợc tiến hành tại phòng Thực Tập Vi Sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM, thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007. Đề tài đƣợc thực hiện với mục đích tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối của nấm men Saccharomyces sp. nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm. Kết quả chúng tôi ghi nhận đƣợc: Chúng tôi phân lập đƣợc từ dịch quả nho chủng nấm men thuộc loài S. cerevisiae và từ chế phẩm sinh học chủng nấm men thuộc loài S. boulardii. Cả 2 chủng đều có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B và môi trƣờng cám gạo. Tuy nhiên, môi trƣờng cám gạo thích hợp cho sự sinh trƣởng của loài S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Thu hoạch S. boulardii vào thời điểm 60 giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều hơn ở 36 giờ và 48 giờ. Ngƣợc lại, loài S. cerevisiae sinh trƣởng trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B mạnh hơn trên môi trƣờng cám gạo. Và thời điểm thu hoạch S. cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy. Vitamin C và chất nền (cám gạo, bột mì) không ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm (sau 22 ngày sản xuất). Việc nuôi cấy chung vi khuẩn sB. subtilis không ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào nấm men S. cerevisiae.
ABSTRACT The study on the growth of Saccharomyces sp. on rice bran medium, sugar cane molasses medium and some factors influence on their vitality power for the purpose of producing probiotic. Our topic is done from March to August, 2007 at Microbiology - Infectious Diseases Department, Husbandry and Veterinary Faculty, Nong Lam University, Ho Chi Minh city. S. boulardii was isolated from probiotic and S. cerevisiae was isolated from grapes. They grew well both on rice bran medium and sugar cane molasses medium. Experimental results showed S. boulardii grew better on rice bran than on sugar cane molasses medium. The best time for harvesting S. boulardii biomass was 60 hours after culturing. But, S. cerevisiae grew better on sugar cane molasses medium and the best time for harvesting their biomass was 36 hours after culturing. The rate acid ascorbic and background substance (wheat flour or rice bran) didn’t show the influence to yeast vitality. No considerable oscillations of S. cerevisiae biomass occurred in co-culture with Bacillus subtilis.
MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Abstract v Mục lục vi Danh sách các hình ix Danh sách các bảng x Chƣơng 1. PHẦN MỞ ĐẦU .......................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích đề tài ....................................................................................................2 1.3. Yêu cầu đề tài ......................................................................................................2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN ...........................................................................................3 2.1. Đặc điểm chung của nấm men .............................................................................3 2.2. Vai trò của nấm men ............................................................................................4 2.3. Các hình thức sinh sản của nấm men ..................................................................5 2.3.1. Sinh sản vô tính .........................................................................................5 2.3.1.1. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi ..........................................5 2.3.1.2. Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào ..............................5 2.3.2. Sinh sản hữu tính .......................................................................................6 2.3.2.1. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) ...................................6 2.3.2.2. Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore) .............................6 2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men ............................................................7 2.5. Đặc điểm của giống Saccharomyces ...................................................................9 2.5.1. Saccharomyces cerevisiae .......................................................................10 2.5.2. Saccharomyces boulardii ........................................................................10 2.6. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men ........................................................11 2.6.1. Giai đoạn thích nghi ................................................................................11 2.6.2. Giai đoạn logarit ......................................................................................11 2.6.3. Giai đoạn ổn định ....................................................................................12 2.6.4. Giai đoạn thoái hóa .................................................................................12 2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào ....................................................................................12 2.7.1. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................12 2.7.2. Nhiệt độ ...................................................................................................14 2.7.3. pH của môi trƣờng ..................................................................................14
2.7.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn ..................................................................14 2.8. Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn ..............15 2.9. Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ..............................18 2.9.1. Ở nƣớc ngoài ...........................................................................................18 2.9.2. Ở trong nƣớc ...........................................................................................19 Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................21 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ..............................................................21 3.1.1. Thời gian .................................................................................................21 3.1.2. Địa điểm ..................................................................................................21 3.2. Vật liệu thí nghiệm ............................................................................................21 3.2.1. Mẫu khảo sát ...........................................................................................21 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................21 3.2.3. Hóa chất ..................................................................................................21 3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................21 3.3. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................22 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................22 3.4.1. Phân lập nấm men ...................................................................................22 3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì .........................................22 3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho .............................................................................22 3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B..........................................................................23 3.4.2.1. Mục đích...........................................................................................23 3.4.2.2. Thông số cố định ..............................................................................23 3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................23 3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm ..............................................................................23 3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces .............24 3.4.3.1. Mục đích...........................................................................................24 3.4.3.2. Thông số cố định ..............................................................................24 3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................24 3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm ..............................................................................25 3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm ..........................25 3.4.4.1. Mục đích...........................................................................................25 3.4.4.2. Thông số cố định ..............................................................................25 3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................26 3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm ...26 3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung ..................................................................................................26 3.4.6.1. Mục đích...........................................................................................26 3.4.6.2. Thông số cố định ..............................................................................26
3.4.6.3. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................27 3.4.6.4. Bố trí thí nghiệm ..............................................................................27 3.4.7. Phƣơng pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu .........27 3.4.8. Phƣơng pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch) ............28 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................30 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trƣởng của các chủng đã phân lập trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B...........................................................................................30 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces ....................................33 4.2.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................33 4.2.2. Saccharomyces cerevisiae .......................................................................35 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm................................................37 4.3.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................38 4.3.2. Saccharomyces cerevisiae .......................................................................38 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm ..............................39 4.4.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................39 4.4.2. Saccharomyces cerevisiae .......................................................................42 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung ..........................................................................................................43 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................47 5.1. Kết luận ..............................................................................................................47 5.2. Đề nghị...............................................................................................................47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................49 PHỤ LỤC ..................................................................................................................51
DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levure 31 Hình 4.2: Phân lập nấm men từ dịch quả nho 31 Hình 4.3: Hình thái S. boulardii 32 Hình 4.4: Hình thái S. cerevisiae 32 Hình 7.1: Bình nuôi cấy nấm men 51 Hình 7.2: Khuẩn lạc Saccharomyces sp. trên môi trƣờng Sabouraud 51 Hình 7.3: Chế phẩm sinh học chứa nấm men Saccharomyces 51
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Thành phần hoá học của nấm men 17 Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men 17 Bảng 2.3: Thành phần khoáng của nấm men 18 Bảng 2.4: Thành phần vitamin của nấm men 18 Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 30 Bảng 4.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 33 Bảng 4.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 34 Bảng 4.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 35 Bảng 4.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 36 Bảng 4.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 38 Bảng 4.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 38 Bảng 4.8: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 41 Bảng 4.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 41 Bảng 4.10: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 43 Bảng 4.11: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 44 Bảng 7.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 48 Bảng 7.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 48 Bảng 7.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 48 Bảng 7.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 49 Bảng 7.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 49 Bảng 7.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 50 Bảng 7.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 50 Bảng 7.8: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 51 Bảng 7.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 51 Bảng ANOVA 7.1 51 Bảng ANOVA 7.2 51
Bảng ANOVA 7.3 52 Bảng ANOVA 7.4 52 Bảng ANOVA 7.5 52 Bảng ANOVA 7.6 52 Bảng ANOVA 7.7 52 Bảng ANOVA 7.8 53 Bảng ANOVA 7.9 53 Bảng ANOVA 7.10 53 Bảng ANOVA 7.11 53
1 Chƣơng 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong giới vi sinh vật, khi nhắc đến những ứng dụng của nấm men trong chế biến thực phẩm thì Saccharomyces đƣợc xem là một trong những ứng cử viên sáng giá nhất. Từ rất lâu, chúng đã đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm cho ngƣời nhƣ lên men rƣợu, bia, sản xuất men bánh mì, nƣớc giải khát có cồn… Và trong vài thập kỷ gần đây nó đã đƣợc sử dụng nhiều cho chăn nuôi nhƣ chế biến thức ăn giàu tinh bột từ các phế phụ phẩm công nông nghiệp, sản xuất sinh khối giàu protein và vitamin từ các nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền hoặc sử dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học dùng làm thức ăn bổ sung cho vật nuôi. Việc nghiên cứu sản xuất ở qui mô nhỏ và vừa các chế phẩm sinh học từ nấm men giúp phòng bệnh và kích thích sinh trƣởng cho gia súc, gia cầm phù hợp với thực tiễn nƣớc ta đã và đang đƣợc triển khai nghiên cứu ứng dụng. Với xu hƣớng đó, việc nghiên cứu khả năng sinh trƣởng và phát triển giống nấm men Saccharomyces trên các loại môi trƣờng khác nhau nhằm thu đƣợc lƣợng sinh khối cao với chi phí nuôi cấy thấp là công việc quan trọng và cần thiết. Tuy nhiên, chúng ta cũng cần quan tâm đến thời gian thu hoạch và phƣơng pháp bảo quản khả năng sống của chúng trong chế phẩm. Sở dĩ Saccharomyces đƣợc sử dụng phổ biến để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi vì chúng thuộc loại nấm đơn bào, chứa nguồn protein phong phú, hàm lƣợng vitamin cao (đặc biệt là vitamin nhóm B) mà thời gian chúng sinh sản nhanh lại dễ nuôi cấy và thu hoạch. Đƣợc sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cùng với sự hƣớng dẫn tận tình của Ts. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
2 “Khảo sát sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo, rỉ đƣờng và một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm”. 1.2. Mục đích đề tài Tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces sp. nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm. 1.3. Yêu cầu đề tài Phân lập các chủng nấm men từ 4 nguồn mẫu chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ và nho. Đánh giá khả năng sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía. Khảo sát, tìm hiểu thời gian thích hợp để thu hoạch nấm men. Đánh giá ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền (cám gạo, bột mì) lên sức sống của Saccharomyces sp. trong chế phẩm. Đánh giá ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung.
3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Đặc điểm chung của nấm men Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên nhƣ trong đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm…, đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt. Hình dạng và kích thƣớc nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều kiện dinh dƣỡng và nhiều yếu tố khác. Nấm men thƣờng có dạng hình trứng, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus…), hình tròn (Candida utilis), hình ống dài (Pichia), hình quả dƣa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn (Brettanomyces), hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác. Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium). Ở khuẩn ty giả, các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ nhƣ ở khuẩn ty. Khuẩn ty và khuẩn ty giả thƣờng quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon…, nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi không đƣợc cung cấp đủ oxy. Hình dạng nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh. Ví dụ, Saccharomyces thƣờng có hình bầu dục trong môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng. Trong điều kiện yếm khí thƣờng có hình tròn, trong điều kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn. Kích thƣớc tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tùy theo giống, loài và từng giai đoạn phát triển. Nhìn chung, tế bào nấm men to hơn tế bào vi khuẩn một cách
4 rõ rệt, kích thƣớc trung bình 3 – 5 * 10 – 12 µm. Kích thƣớc chiều ngang tế bào nấm men giống Torulopsis là 5 – 8 µm, ở một số loại men rƣợu là 10 – 11 µm, men bia là 6 – 8 µm, nấm men gia súc thƣờng nhỏ hơn. Để quan sát hình thái và đo kích thƣớc tế bào nấm men, ngƣời ta thƣờng sử dụng môi trƣờng mạch nha dịch thể với nồng độ đƣờng khoảng 10 – 150B (độ Baumé, đơn vị thƣờng sử dụng để tính hàm lƣợng đƣờng) hoặc môi trƣờng thạch mạch nha, thời gian nuôi cấy là 3 ngày ở 25 – 300C. Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào có màng tế bào, nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribosome, không bào, một số thể vùi (glycogen, lipit, volutin…). 2.2. Vai trò của nấm men Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất giàu protein, lipid và vitamin (đặc biệt là vitamin B). Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng để tạo thành rƣợu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng có khả năng tăng nhanh lƣợng sinh khối tế bào. Trong quá trình trao đổi chất của hầu hết giống nấm men đều không sinh ra chất độc gây hại cho sức khoẻ của ngƣời và vật nuôi nên chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm nhƣ sản xuất rƣợu, bia, nƣớc giải khát có cồn, làm men bánh mì, chế biến các thực phẩm sữa lên men kefir, johur … cho ngƣời và thức ăn gia súc. Ngƣời ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất vitamin, enzyme… và đặc biệt loài Saccharomyces cerevisiae đang đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ đắc lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của ngành công nghệ sinh học hiện đại. Tuy nhiên, cũng có một số nấm men gây bệnh cho ngƣời và gia súc nhƣ Candida albican, Cryptoccocus neoforman… và gây hƣ hỏng thực phẩm nhƣ Endomycopsis fiibuligera, Saccharomyces bisporus…
5 2.3. Các hình thức sinh sản của nấm men Nấm men sinh sản dƣới 2 hình thức sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. 2.3.1. Sinh sản vô tính 2.3.1.1. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi Ở một giai đoạn nhất định nào đó, trên tế bào mẹ xuất hiện chồi và sau đó phát triển thành tế bào con. Tế bào con lớn dần, khi đã đạt đến kích thƣớc của tế bào mẹ thì nhờ sự chuyển động của chất lỏng trong môi trƣờng, nó tách khỏi tế bào mẹ. Trƣớc lúc tách ra, giữa 2 tế bào này có mối liên kết bên trong rất khắng khít. Tế bào mẹ và tế bào con khác nhau về phẩm chất, chức năng nên tốc độ sinh sản của chúng cũng không giống nhau. Nhƣng cũng có trƣờng hợp tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau ngay cả khi chúng trƣởng thành, do đó tạo thành chuỗi tế bào, gọi là khuẩn ty giả. Hình thức nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất ở nấm men, thƣờng gặp ở giống Saccharomyces, Candida, Torulopsis. 2.3.1.2. Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào Một số loài phân đôi tế bào tạo thành 2 tế bào con bằng nhau, giống nhƣ ở đa số các vi khuẩn. Lúc đầu chất nhân chia làm 2 phần, sau đó ở phần giữa tế bào xuất hiện vách tế bào, vách này lớn dần lên và chia tế bào mẹ thành 2 tế bào con. Mỗi tế bào con chứa nửa chất nhân và dần dần 2 tế bào tách khỏi nhau thành 2 tế bào độc lập. Hình thức sinh sản này thƣờng gặp ở nấm men có dạng sợi dài nhƣ giống Schizosaccharomyces, Endomyces.
6 2.3.2. Sinh sản hữu tính 2.3.2.1. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) Trong quá trình nuôi cấy nấm men chuyển đột ngột từ môi trƣờng giàu sang môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng, trong khi đó vẫn giữ nguyên độ ẩm, tích tụ các hợp chất trung gian, đủ oxy của không khí thì tế bào sẽ sinh bào tử nằm trong các túi, đƣợc gọi là bào tử túi. Bào tử túi bền với tác nhân bên ngoài nhƣ nhiệt độ cao, khô hạn, nhƣng kém bền nhiệt hơn so với bào tử vi khuẩn. Chúng thƣờng chết ở 600C, còn bào tử vi khuẩn chết ở 1200C. Bào tử túi thƣờng đƣợc sinh ra trong những cái túi nhỏ gọi là nang hay túi (ascus) mỗi túi chứa 1 – 8 bào tử túi (ascospore), thƣờng là 1 – 4. Bào tử túi có kích thƣớc và hình dạng khác nhau tùy từng loại nấm men; có thể hình bầu dục, bán cầu, hình thoi… Túi có thể đƣợc sinh ra theo 1 trong 3 phƣơng thức sau: Tiếp hợp đẳng giao (conjugation isogamic): do 2 tế bào nấm men có hình dạng và kích thƣớc giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành. Gặp ở nhiều loài trong giống Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaryomyces. Tiếp hợp dị giao (conjugation heterogamic): do 2 tế bào có hình dạng và kích thƣớc không giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành. Gặp ở 1 số loài trong giống Zygopichia, Nadsodia. Sinh sản đơn tính (pathenogenesis): đó là quá trình hình thành bào tử trực tiếp từ 1 tế bào riêng lẻ không thông qua tiếp hợp. Gặp ở nhiều loài trong giống Schiwanniomyces, Pichia. Các bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men mới. Tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi. 2.3.2.2. Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore) Là loại bào tử chỉ thấy ở các loài trong giống Brullera, Spodiobolus, Sporoliomyces, Aessaspora. Sau khi hình thành, bào tử này có thể bắn mạnh ra phía đối diện.
7 2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chúng hô hấp nhƣ một cơ thể hiếu khí bậc cao, khi môi trƣờng hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí, gọi là quá trình lên men. Khi phản ứng lên men bắt đầu phát triển, tốc độ sinh sản của tế bào nấm men bị kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu nhƣ không còn nữa. Về cơ chế sinh học, đây là một quá trình sử dụng không hết năng lƣợng những chất dinh dƣỡng của môi trƣờng. Vì quá trình phân hủy 1 phân tử gam đƣờng bằng cách lên men chỉ tiết ra khoảng 28 kcal, trong khi đó nếu oxy hóa hoàn toàn 1 phân tử gam đƣờng ta sẽ có 674 kcal. Quá trình lên men tạm gọi là quá trình phosphoryl hóa. Vì trong khi lên men, các hợp chất ATP, ADP tham gia vào 1 cách tích cực. Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đƣờng hấp thụ chọn lọc trên bề mặt của tế bào và sau đó khuếch tán vào bên trong. Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bào đóng vai trò màng bán thấm ngăn cách, điều hoà các chất dinh dƣỡng vào tế bào và thải các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài. Các chất dinh dƣỡng sau khi đƣợc hấp thụ vào trong tế bào sẽ xảy ra những phản ứng hóa học để chuyển hóa thành các hợp chất nhƣ protein, glucid, lipid… Dinh dƣỡng cacbon: Trƣớc hết phải kể đến các loại đƣờng, đƣờng glucose đƣợc tất cả các loài nấm men sử dụng. Các loài nấm men dùng sản xuất men gia súc thuộc giống Candida, Torulopsis có thể đồng hóa đƣợc đƣờng pentose. Vì vậy, các men này có thể nuôi cấy ở dịch thủy phân từ gỗ hoặc các nguồn giàu hemicellulose. Những disacarit (maltose và saccarose) trƣớc khi đƣợc nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ thành đƣờng đơn nhờ enzyme tƣơng ứng của nấm men. Nhƣ là một qui luật, trong môi trƣờng có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dƣỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trƣởng tốt sẽ đƣợc sử dụng trƣớc. Đƣờng glucose và fructose đƣợc sử dụng trƣớc hết, kế tiếp là các acid béo (phụ thuộc vào chủng loài nấm men và thành phần của acid này), những hợp chất có nhiều C trong phân tử đƣợc sử dụng sau cùng.
8 Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trƣởng nấm men. Chúng có thể là nguồn dinh dƣỡng cacbon và năng lƣợng duy nhất. Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn cacbon nuôi cấy nấm men rất đƣợc quan tâm trong vài thập kỷ gần đây. Trong đó, parafin có thể là nguồn cacbon dinh dƣỡng dễ dàng đối với một số chủng của giống Candida và Torulopsis. Dinh dƣỡng nitơ: Nấm men có khả năng tổng hợp đƣợc tất cả các acid amin, thành phần protein trực tiếp từ các hợp chất đạm vô cơ và cacbon hữu cơ. Đa số nấm men không đồng hóa đƣợc nitrate (trừ giống Hasenula và Pichia). Nguồn nitơ vô cơ đƣợc nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng nhƣ hữu cơ. Đó là amoni sulfate, phosphate rồi đến các muối acetate, lactate, malate… Trong môi trƣờng có muối amoni, đặc biệt là sulfate, thì nấm men sử dụng gốc amoni trƣớc, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng và sẽ làm môi trƣờng acid hóa, giảm pH. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các acid amin, peptit, nucleotit… Trong thực tế, ngƣời ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân đậu tƣơng làm nguồn nitơ hữu cơ. nấm men tiêu hóa rất tốt các acid amin, còn peptone kém hơn và hoàn toàn không sử dụng đƣợc protein. Các muối amon đƣợc nấm men sử dụng tốt hơn các acid amin. Trong quá trình nuôi cấy nấm men, các acid amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dƣỡng. Tuy nhiên, nấm men chỉ sử dụng đƣợc acid amin ở dạng L-acid amin. Để thu sinh khối Saccharomyces đƣợc tốt, trong môi trƣờng nuôi cấy nên có mặt cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Dinh dƣỡng các nguyên tố vô cơ: Trong các nguyên tố vô cơ sử dụng nuôi cấy nấm men, phospho đƣợc quan tâm trƣớc hết, sau đó là kali, magiê, lƣu huỳnh… Phospho tham gia vào thành phần quan trọng của tế bào (nucleoproteit, acid nucleic, phospholipit…). Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các
9 phản ứng sinh hóa, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và vận chuyển năng lƣợng. Trong phòng thí nghiệm vi sinh, ngƣời ta thƣờng dùng muối KH 2PO4 và K2HPO4 làm nguồn P và K. còn trong sản xuất, thƣờng dùng dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P. Dinh dƣỡng các chất kích thích sinh trƣởng: Để cho nấm men phát triển và lên men đƣợc bình thƣờng cần phải có các vitamin làm cofacto trong nhiều enzyme của tế bào nấm men. Nấm men có thể tổng hợp đƣợc tất cả các vitamin trong chừng mực nào đó, ngoại trừ biotin. Vì vậy, trong môi trƣờng nuôi cấy cần phải bổ sung vitamin này. Những nhân tố sinh trƣởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (vit B8), biotin (vit B7), acid pantotenic (vit B3), tiamin (vit B1), pyridoxyn (vit B6), acid nicotinic (vit B5). Trong công nghiệp, thƣờng dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nƣớc chiết cám, dịch thủy phân đậu tƣơng, rỉ đƣờng. Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở qui mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, rau cải, cà chua, cà rốt, khoai tây… làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trƣờng. 2.5. Đặc điểm của giống Saccharomyces Một số loài nấm men có khả năng lên men rƣợu và bia lần đầu tiên đã đƣợc Meyen gộp thành 1 giống gọi là Saccharomyces vào năm 1939. Đây là giống có bào tử túi, thƣờng có 1 – 4 bào tử, có khi đến 8 bào tử. Tế bào của chúng có hình cầu, dài, elip..., nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, không tạo bào tử bắn, không tạo váng, khuẩn lạc có dạng bột nhão, hơi bóng. Đây là một trong số những giống nấm men đƣợc ứng dụng rộng rãi, phổ biến nhất.