Khóa luận tốt nghiệp: Ảnh hưởng của các chất điểu hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy In Vitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium

Chia sẻ: Nguyen Hong Thang | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:90

Thêm vào BST

Báo xấu

549
lượt xem 71
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu: Sử dụng các chất kích thích sinh trưởng BA, TDZ, NAA ở các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm xác định tỉ lệ thích họp nhất để đạt được kết quả nhân giống in vitro cao trên 2 giống lan Dendrobium và Cỵmbidium.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Ảnh hưởng của các chất điểu hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy In Vitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM Bộ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỂU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CỦA HAI GIỐNG LAN DENDROBIUM YÀ CYMBIDIUM Thành Phố Hồ Chí Minh - 09 / 2005 -
LỜI CẢM TẠ Đe hoàn thành cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình, sự góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nay tôi xin đ ược bày t ỏ lòng bi ết om sâu sắc đến: > Cha và Mẹ đã suốt đời tận tụy vì con để có được ngày hôm nay. > Các Thầy - Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. > TS. TRẦN THỊ DUNG, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. > KS. NGUYỄN THỊ THU HẰNG, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. > Xin gởi lời cảm om đến toàn thể tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian qua. TÓM TÁT KHOÁ LUẬN TRẰN QUANG HOÀNG, Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005. "ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CỦA 2 GIỐNG LAN DENDROBIUM VÀ CYMBIDIUM" * Giáo viên hướng dẫn: Ts. Trần Thị Dung Đề tài được tiến hành từ ngày 15/03/2005 đến ngày 15/06/2005, tại phòng nuôi cấy mô - Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Đối tượng nghiên cứu:
- Là 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. Đây là những giống lan được trồng nhiều ở Việt Nam và đem lại lợi nhuận kinh tế cao. Mục đích nghiên cứu: - Sử dụng các chất kích thích sinh trưởng BA, TDZ, NAA ở các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm xác định tỉ lệ thích họp nhất để đạt được kết quả nhân giống in vitro cao trên 2 giống lan Dendrobium và Cỵmbidium. Phương pháp nghiên cứu: - Trên mỗi giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại. Kết quả đạt được: - Môi trường nuôi cấy có bổ sung lmg/1 TDZ và 0.5mg/l NAA cho thấy khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi cao nhất trên cả 2 giống lan. - Môi trường nuôi cấy có kết hợp giữa chất điều hoà sinh trưởng BA và NAA hoặc TDZ và NAA cho thấy kết quả hình thành phôi soma, protocorm và chồi cao hom so với sử dụng riêng lẽ chất điều hoà sinh trưởng sinh trưởng BA hoặc TDZ. MỤC LỤC Nội dung.......................................................................................................................Trang
1.5.1.1. Vai trò Bảng..............................................................................................................................Trang Bảng 4.1: Ánh hưởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thảnh chồi của cây lan Cymbidium
Biểu đồ Trang Biểu đồ 4.1: So sánh khả năng hình thảnh phôi soma, protocorm và chồi Hình.......................................................................................................................Trang Hình 4.11: Cây lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro
BA 6-benzylaminopurine NAA a - naphthaleneacetic acid MS Murashige và Skoog (1962) TDZ 1 - phenyl 1 - 3 - (1,2,3 - thiadiazol - 5 - yl) - urea ABA Acid Abscisic DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotìde acid GA3 Gibberellin PHẦN 1: MỞ ĐÀU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay hoa kiểng không những đóng vai trò quan tr ọng trong đ ời sống tinh th ần mà còn ảnh h ưởng sâu xa đ ến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh quan môi trường, do đó quan tâm phát tri ển hoa ki ểng là v ấn đ ề c ần thi ết. Bên cạnh đó lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hì nh dáng, màu sắc, kích thước phong phú và đa dạng nên chúng được sản xuất khá phố biến. Hiện nay nhu càu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng. Các n ước có truy ền th ống s ản xu ất hoa lan như Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, Đài Loan..., hàng năm thu đ ược hàng ch ục tri ệu đô la M ỹ t ừ ngu ồn xu ất kh ẩu hoa lan. Ở Việt Nam hoa lan là một nghề cho tỷ suất lợi nhuận cao. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đ ới gió mùa, có đ ủ đi ều ki ện thu ận l ợi cho cây lan phát tri ển như: ẩm độ, nhiệt độ, cường độ ánh sáng...., đặc biệt là thích họp đối với các nhóm lan: Dendrobium, Cymbidium, Oncidium,..........Nên vừa qua sở Nông nghiệp-Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh đã tổ ch ức h ội th ảo v ề hi ện tr ạng và h ướng phát triển hoa lan trên địa bàn, nhằm đưa cây hoa lan thành cây ch ủ l ực ừong c ơ c ấu nông nghi ệp c ủa thành ph ố (ĐCSVN,
27/6/2005). Việc sản xuất hoa lan ở nước ta hiện nay chỉ mới đáp ứng được nhu c ầu thấp chủ yếu phải nh ập t ừ các n ước khác như: Thái Lan, Đài Loan.. ..Trước tình hình trên và cũng nh ằm đ ưa ti ến b ộ c ủa k ỹ thu ật nuôi c ấy mô t ế bào vào công tác giống, góp phàn phát ừiển nghề trồng lan trên qui mô rộng, việc ứng dụng nhân giống in vitro trên cây lan là điều cần thiết hiện nay ở nước ta. Do đó chúng tôi thực hi ện đề tài: " Ảnh h ưởng c ủa các ch ất đi ều hòa sinh tr ưởng đ ến quá trình nuôi cấy in vitro của hai giống lan Dendrobium và Cỵmbidium" 1.2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp để đạt được kết quả nhân giống in vitro cao nhất trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium. 1.3. Yêu cầu Quan sát sự phát sinh phôi soma, protocorm và chồi của 2 giống lan Dendrobium và Cỵmbidium. Quan sát sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan in vitro.
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lan 2.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giói và ở Việt Nam 2.1.1.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giói Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng và đã mang lại lợi nhuận kinh tế cao: *Ở Châu Âu: - Năm 1994, Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, từ Singapore 289.000 cành lan Dendrobium. - Holland là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghi ệp trồng lan xu ất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Holland có thể xuất khẩu hoa quanh năm nh ất là Cymbidium. - Italia là quốc gia nhập khẩu hoa lan lớn nhất Châu Âu. Năm 1993, nhập 75,3 triệu cành, chủ yếu từ các nước: Thái Lan, Holland , Singapore .... - Đức và Pháp là hai quốc gia nhập khẩu lan đứng thứ 2 và thứ 3 Châu Âu. *Ở Châu Á: - Nhật là quốc gia nhập khẩu đứng đầu thế giới. Theo thống kê, tại Thái Lan, Singapore, Malaysia dành 600 ha đất trồng lan để xuất khẩu sang Nh ật, chủ y ếu là Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis,...... - Thái Lan là nước xuất khẩu lan đứng đầu thế giới, chủ yếu là lan Dendrobium, xuất khẩu horn 50 quốc gia trên thế giới với giá 1-3 USD / cành, có khi 8 - 1 0 USD / cành, những giống quý có thể lên đến hàng trăm USD. Ngày nay, bằng nhiều kỹ thuật khác nhau người ta đã tạo ra được nhiều gi ống lan mới như: Dendrobium ayaka, Dendrobium edians beauty, Dendrobium sungould (Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004). 2.1.1.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và lan nói riêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển, với nhiều chủng lo ại. Tham gia sản xuất gồm nhiều thành phần kinh tế (cá thể, tập thể, nhà nước, liên doanh hoặc 100% vốn đầu tu nước ngoài). Tuy nhiên sản xuất còn chưa được áp dụng khoa h ọc k ỹ thuật nên mặc dù đa dạng nhưng không đạt về tiêu chuẩn, số lượng và chất lượng do
đó tính cạnh tranh còn thấp. *Tại TP.HCM: Trong các chủng loại sản phẩm hoa kiểng, hoa lan xem là nhóm hoa có giá trị kinh tế cao, trong đó lan cắt cành đem lại lợi nhuận khá cao (có thể đạt 500 tri ệu - 1 tỉ đồng / ha / năm) nhưng vốn đầu tư ban đầu v ẫn còn cao (600 - 800 tri ệu đ ồng / ha), chủ yếu là phần vốn đầu tư cho cây giống. Trong đó nhóm Mokara và Dendrobium được hồng nhiều nhất. - Theo Trung tâm Nghiên cứu khoa học kỹ thuật và khuyến nông TP.HCM, trong thời gian qua diện tích hồng hoa lan trong thành phố tăng nhanh, t ừ 20 ha năm 2003 lên 50 ha năm 2004 và khoảng 80 ha năm 2005. - Để đưa hoa lan trở thành một trong những cây chủ lực trong cơ c ấu kinh tế nông nghiệp trong những năm tới, TP.HCM đề ra m ục tiêu phát tri ển di ện tích h ồng hoa lan lên 200 ha vào năm 2010 và một số gi ải pháp chính v ề gi ống, khoa h ọc k ỹ thuật, thị trường tiêu thụ, đào tạo nguồn nhân lực, chính sách hỗ tr ợ (ĐCSVN, 27/6/2005). *Tại Đà Lạt: - Cây lan Cymbidium đã được nuôi trồng tại Đà Lạt từ rất lâu, chủ yếu đ ể tiêu khiển. Tại đây, ngoài những loài tự nhiên, các bi ến ch ủng, còn có nhi ều gi ống nhập nội nuôi trồng. - Từ năm 1977, sau khi thành lập tổ Hoa Lan Xuất Khẩu, phong trào hồng lan đã được phát triển mạnh. - Đến năm 1985, đã xuất khẩu được trên 15.000 cành hoa Cymbidium. - Hiện nay nhu cầu hoa lan đang tăng nhanh, trong khi đó mức độ phát tri ển còn hạn chế. Đó là do chưa có những đầu tư nghiên c ứu về đối tượng này nh ư: vấn đề khoa học, chọn tạo giống và kỹ thuật nuôi trồng.. .do đó không thể hiểu rõ và đánh giá đúng đắn tiềm năng và triển vọng nguồn lợi này. - Xu hướng hiện nay đang tập trung vào các giống nhập nội, còn lại các lo ại lan nội địa ít được chú ý. Mặc dù các loài biến chửng n ội địa có giá tr ị rất cao, có th ể đáp ứng được nhu cầu xuất khẩu. Như vậy cơ sở để phát tri ển nghề tr ồng lan xu ất khẩu vẫn phải chú trọng vào cây lan nội địa, nhất là chọn tạo gi ống m ới t ừ cây lan nội (Trích Dương Ngọc Bích Quyên, 2002).
2.1.2. Giới thiệu chung về giống lan Cymbidium 2.1.2.1. Phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật của thế giới ngày nay, người ta đã x ếp riêng Cymbidium vào một chi (Otto Swartz, 1799). Trong khóa phân loại của Lindley - Bentham - Brieger năm 1983, chi Cymbidium thuộc tông phụ Cymbidinae, tông Dendreae, phân họ Orchidoideae. Theo tài liệu về thực vật ở Đông Dưomg, từ năm 1932, Henri Lecompte cho rằng chi này cỏ 120 loài. Gần đây, năm 1978 Jean Carmard sắp xếp l ại và xác đ ịnh có khoảng 60 loài. Theo những nhà phân loại học Việt Nam như Phạm Hoàng H ộ, Võ Văn Chi... đã giới thiệu ở nước ta có khoảng 12 loài: - Cymbidium aloiýolium Swartz (lan lô hội). - Cymbidium cyperiýolium (thanh lan). - Cymbidium dayanum Reichb. f (xích ngọc). - Cymbidium devonianum Paxt. (gấm ngũ hồ). - Cymbidium ebumeum Reichb (bạch lan). - Cymbidium ensi/olium Swartz (mặc lan). - Cymbidium erythrostylum Lindl. (bạch hổng). - Cymbidium giganteum Wall. (hoàng lan). - Cymbidium insigne Rolíe (hồng lan). - Cymbidium lanciýolium Hook. f. - Cymbidium polanei Gagn (tử cán). - Cymbidium munronianum King. et plant. 2.1.2.2. Đặc điểm hình thái - Lan Cymbidium là loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ. - Rễ: mọc bám trên vỏ cây, mặt đất hoặc ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn. Rễ mới thường chỉ mọc ở cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ củ rễ. - Thân (căn hành): thường ngắn, nối những c ủ lan với nhau. Các c ủ lan th ực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ, có th ể
mọc ra đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con. Do đó ng ười ta x ếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân (sympodial). - Củ lan (giả hành): thường có dạng con quay hay dạng hột xoài, đường kính từ 1 cm đến 15 cm, củ thường tươi và được bọc trong các bẹ lá. - Lá: thường có hai dạng: dạng vảy đính theo một đo ạn căn hành và d ạng thực đính trên giả hành. - Chồi hoa: thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già, đâm ra bên ngoài. Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. - Cọng phát hoa: không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Chiều dài của phát hoa từ 10 đến hơn 100 cm. Cành hoa mang từ vài đến vài ch ục búp hoa x ếp luôn phiên theo đường xoắn ốc. - Hoa Cỵmbidium lưỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ gọi là trục họp nhụy, hình bán trụ hơi cong về phía trước. Nhị ở trên cùng, mang 2 khối phấn màu vàng, có gót dính như keo. Khối phấn được đậy b ởi m ột n ắp màu trắng ngà dễ mở rời, cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên do hoa Cymbidium chỉ thụ phấn được nhờ côn trùng. - Sau khi thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn phình lên tạo thành quả. Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt. Khi chín, quả mở theo 3 đường góc và gieo vào không khí những hạt như bụi ph ấn màu vàng lụa. Khi rơi vào nơi cỏ điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích h ọp và có n ấm c ộng sinh tham gia, hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới. 2.I.2.3. Điều kiện sinh thái Cymbidium có những tính chất rất đặc biệt: thời gian ra hoa dài (trưng bình 12 tháng), khả năng phát triển rất mạnh, có hình dáng, màu sắc, kích th ước phong phú và đa dạng. Các loài Cymbidium sống trong môi trường mát cây cần nhiều ánh sáng trong suốt thời gian trong năm, nhưng cây không chịu được ánh sáng tr ực x ạ nên ph ải che bóng để giữ độ chiếu sáng thích họp. Cymbidium cần nhiều nước trong mùa sinh trưởng, cần tưới nước nhẹ nhàng và thường xuyên bón phân đầy đủ, từ lúc cây phát tri ển cũng nh ư lúc ra hoa và phân
chia các khóm giả hành. về nhiệt độ: loài lan này sống trong môi trường lạnh nên có chế độ nhiệt rất đặc biệt: 15°c vào mùa đông và 20°c vào mùa hè, biên độ ngày và đêm t ừ 6 - 7°c c ần cho ra hoa. Khi các giả hành phát triển, nhiệt độ về đêm phải từ 6 - 12°c liên tục từ 3- 4 tuần. về ẩm độ: bộ rễ của Cymbidium khác xa bộ rễ của các loài lan ký sinh (epiphyte). Chúng đòi hỏi rễ luôn luôn ẩm nên phải tưới trong mọi thời gian trong năm, chỉ cho giá thể vừa kịp khô giữa hai lần tưới. Ẩm độ thích h ọp t ừ 60-70% (Trích Phan Thị Tuyết Hằng, 2005). 2.1.3. Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium 2.1.3.1. Phân loại Phong lan có vùng phân bố rộng lớn, trải dài từ đường xích đạo cho đ ến B ắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết. Họ phong lan ( Orchidaceae) với 750 chi và hom 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc ( Asteraceae) trong ngành hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm. Việc phân loại phong lan khá phức tạp. Theo truyền thống c ổ điển các nhà khoa học trước đây phân loại Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epiden droideae, phân họ Orchidaceae (Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004). Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) phân loại lan Dendrobium như sau: - Dendrobium crassinode (Hoàng thảo u lồi). - Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng). - Dendrobiưmýarmeri (Hoàng thảo thủy tiên). - Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế). - Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng). - Dendrobium (Hoàng thảo dẹt). - Dendrobium parciýlorum (Hoàng thảo xương cá). - Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng). - Dendrobium parìshii (Hoàng thảo hạc vĩ). - Dendrobiưm primulim (Hoàng thảo long tu). - Dendrobium pumilum (Hoàng thảo phù dung). 2.1.3.2. Đặc điểm hình thái - Rễ: thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô
xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn ch ặn ánh sáng m ặt tr ời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc ỉạp không bị ngăn b ởi mô xốp nên cỏ thể giúp cây quang hợp. - Thân: lan Dendrobium thuộc loài đa thân cố giả hành rất dài, hình trụ, hình múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân. Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ xuống. - Lá: xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoang và các gân lá chính chạy song song các khe lõm xuống, lá lan có thể sống dai hay dễ rụng. - Các cụm hoa: mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ổc, các hoa đơn liền cành nhờ cu ống. Cu ống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành b ởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và 1 trụ hoa). Cột nhị nhụy ngắn. 2.I.3.3. Điều kiện sinh thái Cây lan Dendrobium có biên độ nhiệt độ rất rộng, người ta chia làm 2 hai nhóm chính: - Nhóm ưa lạnh: nhiệt độ lý tưởng là 15°c sống chủ yếu ở vùng cao nguyên trên lOOOm. Những loài lan này có thể ra hoa ở nhiệt độ cao. - Nhóm lan ưa nóng: nhiệt độ thích hợp nhát là 25°c. Ngoài ra còn có giống lan thích hợp ờ nhiệt độ 20°c có thể ra hoa ở vùng nóng và vùng lạnh. - Ầm độ: thích hợp ở ẩm độ 50 - 70% - Ánh sảng: có thể nói Dendrobỉum là loài ưa sáng (60 - 70%), cỗ những loài yêu càu ánh sáng tới 80 - 90%. LA N DENDROBIUM LAN CYMB1L1UM Hình 2.1: Hai giống lan Cymbidỉum và Dendrobium thực hỉện trong đề tài.
Deti. Masakủ KotaishiHidenlíi Den. MemoĩiaPriíicess Diana DetidrobiutnThai Matee Hình 2.2: Một số loại hoa lan Dendrobium.
pv* Ịí I Cỵm longibraữteatuĩii "Kyomai" pym. geotingii 'Eiishakomachi' ^ytt'L. gũsmgu kủí&iđeĩi Hình 2.3: Một số loại hoa lan Cymbidium.
2.2. Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan 2.2.1. Giao phấn Như đã nói, giao phấn trong tự nhiên là hi ện tượng thông th ường, gần nh ư b ắt buộc đối với hầu hết các loài lan. Đó là nguyên nhân vì sao h ọ lan có s ố l ượng ch ủng loại rất phong phú. Đó cũng là phưomg thức tồn tại, phát tri ển và ti ến hoá ưu th ế hon cả của họ thực vật này trong hướng thụ phấn nhờ côn trùng. Việc giao phấn đều tạo ra những giống mới, qua chọn lọc, có những đặc tính hon hẳn cây bố mẹ. 2.2.2 Phương pháp chiết tách - Phưong pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng th ời làm tăng số lượng cây mới. Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tàn và ch ỉ tách khi đã tr ồng đ ược từ 2 - 3 năm. Giả hành già được ưcm lại ừên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ m ới, đ ủ sức phát tri ển m ới tách lần thứ hai. Từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1-2 cây con. - Phưong pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây b ố m ẹ nhung lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung c ấp m ột số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn. 2.2.3. Kỹ thuật nhân giống in vừro 2.2.3.1. Lịch sử - Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức Schleiden và Schvvann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhi ều đon v ị nh ỏ, các tế bào họp thành. Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truy ền có trong t ế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là nh ững đon v ị đ ộc l ập, t ừ đó có th ể xây dụng lại toàn bộ cơ thể. - Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schvvann vào thực nghiệm. Tuy ông đã gặp thất bại trong nuôi c ấy các t ế bào đã phân hoá tách từ lá một số cây một lá mầm: Erythronium, Omithogalum, Tradescantia (do cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hon nữa ông dùng các t ế bào m ất khả năng tái sinh).
- Năm 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ rễ của m ột cây hoà thảo trong môi trường lỏng chứa muối khoáng và glucose. Tuy nhiên s ự sinh trưởng chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù tác gi ả chuyển qua môi trường mới. - Năm 1934, White J.p thông báo nuôi cấy thành công trong m ột thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối khoáng và glucose và nước chiết nấm men. Sau đó cũng chính White chứng minh có th ể thay thế nước chiết nấm men bằng hổn hcrp loại vitamin B: Thiamin (Bl), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid. Đồng thời trong thời gian này, R.J. Gautheret (ở Pháp) đã ti ến hành nuôi cấy môi tượng tầng một số cây gỗ (cây liễu) khi đưa auxin vào môi trường nuôi c ấy. Tuy nhiên sự sinh sản các tế bào đầu tiên không vượt quá 8 tháng. - Năm 1939, Gautheret thông báo kết quả đầu tiên của ông với Viện Hàn Lâm Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy các mô vô hạn của cây cà rốt (Daucus carote ). Sau thế chiến thứ hai, lĩnh vực này đặc biệt phát triển nhanh và nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp đươc công bố. 2.2.3.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro *Nhân giống bằng chồi nách Chồi nách nhô từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng phụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính. Khi các mẫu cấy là ch ồi đ ược gi ảm ưu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay ở cả nách lá. Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp cytokinin, chồi nách thường xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậc ba.......Khi các cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyền trong môi tr ường mới. Nói chung kỹ thuật tăng sinh bằng chồi nách được áp dụng cho b ất kỳ cây cây trồng sản xuất chồi nách bình thường và phản ứng với cytokinin như: BAP, Zip & Zeatin (Mantell, Mathew & Mackee). *Nhân giống bằng chồi đỉnh Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu c ấy sử d ụng và việc áp dụng kích thích tố riêng biệt. Kích thước đỉnh chồi nhỏ (0.1 mm - 0.5 mm)
thường khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhưng nó lại quan tr ọng trong vi ệc phát tri ển nguyên liệu gốc sạch bệnh. Những kích thước đỉnh chồi từ 0.5 mm - 2 mm thì thông dụng hon và thích họp trong việc nhân giống (Hartmann & Kester, 1983). Thường nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trường có chứa auxin kết họp với cytokinin, nồng độ cytokinin sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền . *Nhân giống bằng chồi bất định Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô cây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thường. Một số các nguyên li ệu nuôi c ấy g ồm: lá, vẩy, cuống lá........ Mặc khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từ callus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy. Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus và không liên h ệ tr ực ti ếp t ới mô mạch của mẫu cấy. Tuy nhiên chồi bất định có thể làm tăng tỉ lệ cây bị biến dị. *Nhân giống qua nuôi cấy calỉus Nuôi cấy mô hay tế bào sẽ sinh ra mô sẹo (qua sự cảm ứng phát sinh c ơ quan hay phôi) là phương pháp nhân giống in vitro có khuynh hướng cho giá trị thấp. Nuôi cấy callus và tế bào đơn cho tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh. *\hân giống bằng các đoạn giả hành Chọn những cây lan in vitro từ 5-6 tháng tuổi, sau đó cắt giả hành thành những đoạn có chiều dài khoảng 5mm và đem nuôi cấy trên những môi trường có b ổ sung các chất điều hoà sinh trưởng. *Nuôi cấy hạt lai: Khi đã dự đoán kết quả của một phép lai, người ta mạnh dạn nhân gi ống hỗn họp giữa vô tính và hữu tính để rút ngắn thời gian và tạo một số lượng cây giống lớn. *Dung họp tế bào trần: Việc tạo giống vô tính theo các phương pháp lai tế bào đã được ti ến hành ở một số phòng thí nghiệm, còn gọi là phương pháp dung họp tế bào tràn. Một hướng khác là gây đột biến trong ống nghi ệm bằng các tác nhân v ật lý và hóa học. Đây cũng là một hướng tạo giống hiện đại và tốn kém. Đom giản hom, người ta có thể tạo ra những gi ống mới nh ờ vi ệc nhân c ấy đỉnh sinh trưởng và tạo ra những điều ki ện để gây ra những thay đ ổi đ ặc đi ểm di truyền của các tế bào cơ thể bình thường (đột biến soma) như: các d ạng đ ột bi ến sinh lý, đa bội.
Trong việc nhân giống vô tính, nhược điểm lớn nhất là cây mẹ có thể bị nhiễm các dạng bệnh virus. Nếu không được tuyển chọn và ki ểm tra k ỹ l ưỡng s ẽ cho ra đời hàng loạt cây con có chứa mầm bệnh. 2.2.3.3. Tiến trình nhân giống in vừro Gồm các giai đoạn sau: *Giai đoạn 1: Thiết lập sự nuôi cấy vô trùng Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần, mẫu cấy mọc thành cây con cao khoảng lcm. *Giai đoạn 2: Nhân giống vô tính in vừro Mau cấy được cắt chia ra và cây mầm được cấy chuyền vào môi trường m ới. Sự nhân giống này tuỳ thuộc vào việc tiếp tục sản xuất chồi nách ho ặc từ những khối giống như callus ở gốc chồi. *Giai đoạn 3: Chuyển cây ra vườn ưtfm Cây con được tái sinh hoàn chỉnh chuẩn bị cho việc cấy trồng và môi tr ường bên ngoài được thiết lập để thuần hoá cây in vitro. *Giai đoạn 4: trồng cây in vừro ngoài đồng ruộng Cây con được tiếp tục nhân giống trên luống ươm và được cấy vào bàu đất rồi chuyển ra ừồng trên đồng ruộng. 2.2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vừro *Sự lựa chọn mẫu cấy Mẩu cấy phải cạnh tranh sinh lý để sống sót trong môi tr ường nuôi c ấy s ơ khởi và tạo phản ứng thích họp. Mẩu cấy còn non sẽ tái sinh tốt hơn mẫu già. Mầu thích họp nhất cho nuôi cấy mô phải có tỉ lệ mô phân sinh hi ện di ện hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng. *Môi trường nuôi cấy Thông thường là môi trường Murashige & Skoog là thích họp cho ph ần l ớn các trường họp. Để hình thành chồi nách yêu cầu nồng độ thấp của auxin và cytokinin, để phát khởi chồi bất định cần nồng độ cao c ủa cytokinin và thêm m ột l ượng auxin cân bằng. Để sản xuất callus cần nồng độ cao của auxin kết họp với nồng đ ộ th ấp cytokinin. Ngoài ra đối với vài loại cây trồng còn bổ sung GA3 ngoại sinh o.lmg/l cho
sự phát triển bình thường và nhân giống in vitro. Sự lựa chọn môi trường agar hay môi trường lỏng là càn thi ết, agar làm giá đ ỡ cho cây nhưng cây trồng khó hấp thu tốt các dưỡng chất. *Điều kiện nuôi cấy Ánh sáng Mẩu cấy được đặt trên môi trường nuôi cấy là đường, đường đi vào quang tổng họp cho cây ừồng. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng h ấp thu đóng vai trò trong quá trình tạo hình cây nuôi cấy mô. Thường nuôi cấy ở 2000-3000 lux là tốt nhất. Nhiệt độ Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trường khác có ảnh hưởng rõ ràng là nhi ệt đ ộ. Hầu hết nuôi cấy thích họp ở nhiệt độ 20- 25°c. Môi trường in vừro Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi c ấy có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển hình thái của cây. Một số vấn đ ề thường gặp trong môi trường in vitro như: mức độ quang hợp thấp, không cân bằng CO2, mức độ hấp thu và vận chuyển các chất dinh dưỡng thấp. Vì vậy cây con in vitro chậm phát triển. *Chất kích thích sinh trưởng - Auxin - Cytokinin - Gibberellins - ABA - Ethylen 2.2.3.5. ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô Nhân giống các loại cây cảnh là ứng dụng phổ bi ến nhất trong k ỹ thu ật nuôi cấy mô. Hiện nay tất cả lan thưomg mại đều sản xuất bằng cách này. Ngoài ra còn có: Dương Xỉ, Cẩm Chướng (Sone, 1968), Cúc (Ever&Holt, 1974), Petunia (Stone, 1968) và Hồng (Hasegana, 1979). Theo Bajai (1968) một số cây trồng sản xuất qua nuôi cấy mô đã được tiêu thụ