Khóa luận tốt nghiệp đại học: Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp đại học này được thực hiện với mục tiêu nhằm nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu của người; điện biến nạp hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, GLIS1 vào quần thể tế bào gốc tạo máu của người; kiểm tra biểu hiện gen của các yếu tố tái lập trình trong tế bào gốc tạo máu sau khi điện biến nạp. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÙY LINH Tên đề tài: BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG CẢM ỨNG (iPSC) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: CNSH - CNTP Khóa học: 2015 – 2019 THÁI NGUYÊN, 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÙY LINH Tên đề tài: BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG CẢM ỨNG (iPSC) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: K47 – CNSH Chuyên ngành: CNSH - CNTP Khóa học: 2015 – 2019 Giảng viên hướng dẫn: 1. TS Nguyễn Xuân Hưng 2. PGS.TS Dương Văn Cường THÁI NGUYÊN, 2019
i LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Hưng – Phó viện trưởng kiêm Trưởng phòng Nghiên cứu khoa học Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec và PGS.TS Dương Văn Cường – giảng viên Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ths Trần Thị Tuyết Trinh – kỹ thuật viên Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen TS. Nguyễn Hồng Thanh, TS Đào Thị Mai Lan… đã hỗ trợ nhiệt tình cho tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô, cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thùy Linh
ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng ...................... 10 Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa .......................................... 11 Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm.......................................................... 21 Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ........................................................... 23 Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm ................................................ 24 Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry .............................................. 28 Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O ..... 29 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR ...................................................................... 35 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .................................................... 35 Bảng 3.8: Trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm ................................................... 37 Bảng 3.9. Thành phần phản ứng Real time PCR ..................................................... 37 Bảng 4.1: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid mini ........................ 39 Bảng 4.2: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid maxi ....................... 40 Bảng 4.3: Kết quả đo OD sau mỗi lần tách RNA .................................................... 50
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc .................................................................................4 Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng ........................................5 Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mô hình bệnh và khám phá thuốc ......................................................................................................9 Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4 ..............................................................12 Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2 .......................................................13 Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4 ..............................................................14 Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC ...............................................................15 Hình 2.8: Cấu trúc miền protein của LIN28 .............................................................16 Hình 2.9: Cấu trúc miền protein của GLIS1 .............................................................17 Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC ..............................................18 Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình ..................20 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài ..........................................................25 Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình ...........................................................28 Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA ......................................................................36 Hình 3.4: Chu trình nhiệt cài đặt cho máy Real-time PCR .......................................37 Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA plasmid mini ......................................................39 Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA plasmid maxi .....................................................40 Hình 4.3: Tế bào CD34+ sau khi rã đông ..................................................................41 Hình 4.4: Tế bào CD34+ sau 6 ngày nuôi tăng sinh ..................................................42 Hình 4.5: Tế bào CD34+ sau 2 ngày nuôi tăng sinh ..................................................43 Hình 4.6: Tế bào CD34+ sau 5 ngày nuôi tăng sinh ..................................................43 Hình 4.7. Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào nuôi tăng sinh ....................................................................................................................45 Hình 4.8: Tế bào sau 1 ngày xung điện.....................................................................47 Hình 4.9: Quần thể tế bào sau 2 ngày chuyển gen (A), sau 3 ngày chuyển gen (B) và sau 7 ngày chuyển gen (C) .........................................................................48
iv Hình 4.10: Tế bào sau 1 ngày xung điện .................................................................. 49 Hình 4.11: Quần thể tế bào sau 4 ngày chuyển gen (A), sau 5 ngày chuyển gen (B), sau 8 ngày chuyển gen (C). ....................................................................... 49 Hình 4.12: (A)Biểu hiện của các gen SOX2-KLF4 và LMYC- LIN28 (B) Cấu trúc vector pCEB-hSK-O và pCEB-hUL-G ..................................................... 51
v DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ BSA Bovine serum albumin cDNA complementary DNA DMSO dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli ESC Embryonic stem cell hiPSC Human induced pluripotent stem cell HMG High mobility group HSC Hematopoietic stem cell ICM Inner cell mass iPSC Induced pluripotent stem cell LB Laria Broth mESC Mouse embryonic stem cell PBMC Peripheral blood mononuclear cell PCR Polymerase chain reaction qRT-PCR Quantitative polymerase chain reaction Ref Reference RNA Ribonucleic acid RT Reverse transcription Tg Target
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ................................................................... v Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1.Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................. 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát............................................................................................ 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................................. 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................. 2 1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài .............................................................................. 2 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ............................................................................... 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 4 2.1 .Tổng quan về đối tượng nghiên cứu.................................................................... 4 2.1.1 Tế bào gốc ..........................................................................................................4 2.1.2. Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng ............................................. 4 2.1.3. Phân loại tế bào gốc ......................................................................................... 5 2.2. Các nhân tố tái lập trình .................................................................................... 12 2.2.1. OCT4 .............................................................................................................. 12 2.2.2. SOX2 .............................................................................................................. 13 2.2.3. KLF4 .............................................................................................................. 14 2.2.4. MYC ............................................................................................................... 15 2.2.5. LIN28 ............................................................................................................. 16 2.2.6. GLIS1 ............................................................................................................. 17 2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC ......................................................................... 18 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 21 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu .................................................. 21 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 21
vii 3.1.2. Địa điểm và thời gian ......................................................................................21 3.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................21 3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................21 3.3.1. Vật liệu ............................................................................................................21 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................25 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................39 4.1 Kết quả nhân plasmid lần 1 ................................................................................. 39 4.2. Kết quả nhân plasmid lần 2 ...............................................................................40 4.3 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 1 ................................................41 4.4 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2 ................................................43 4.5. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 1.........................................46 4.6. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 2.........................................48 4.7. Kết quả kiểm tra biểu hiện gen ..........................................................................50 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................53 5.1. Kết luận ..............................................................................................................53 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................53 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cell - ESC) là những tế bào vạn năng, có khả năng tự làm mới và có nguồn gốc từ khối tế bào bên trong (inner cell mass – ICM) của phôi nang đang phát triển [44]. Tế bào gốc phôi có thể được nuôi cấy vô thời hạn trong khi vẫn duy trì khả năng tạo ra bất kỳ loại tế bào nào trong cơ thể, và do đó cung cấp một công cụ mạnh mẽ để mô hình hóa bệnh ở người [8] tuy nhiên tế bào gốc phôi vướng phải nhiều tranh cãi về đạo đức khi sử dụng trực tiếp nguồn phôi người [3]. Việc Yamanaka khám phá ra rằng các tế bào trưởng thành nguyên vẹn có thể được tái lập trình để trở thành các tế bào gốc vạn năng ngay lập tức được coi là một bước đột phá lớn. Các tế bào gốc vạn năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell - iPSC) là đại diện thay thế cho nguồn tế bào gốc phôi, không gây tranh cãi về đạo đức và mang đầy đủ các đặc tính của một tế bào gốc phôi. Một lợi thế quan trọng của iPSC là khả năng tương thích miễn dịch khi sử dụng liệu pháp tế bào tự thân [30]. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng có thể được tạo ra từ nhiều loại tế bào sinh dưỡng khác nhau và có sự tương đồng cao với tế bào gốc phôi. Với các nguồn tế bào sinh dưỡng dễ tiếp cận, iPSC từ người không chỉ loại bỏ các vấn đề về đạo đức vướng phải khi sử dụng ESC mà còn cho phép tạo ra nguồn tế bào gốc vạn năng đơn giản hơn, cũng như biệt hóa thành nhiều loại tế bào chuyên biệt cho từng bệnh nhân. Tương tự như ESC, iPSC của người có khả năng tăng sinh mạnh mẽ trong ống nghiệm trong khi vẫn giữ được tiềm năng phát triển và biệt hóa thành mọi tế bào trong cơ thể. Do đó, các tế bào này có thể cung cấp một số lượng không giới hạn nguồn tế bào biệt hóa dành riêng cho bệnh nhân để tạo mô hình nghiên cứu bệnh, xét nghiệm độc tính, sàng lọc thuốc và sử dụng cho các liệu pháp cấy ghép. Việc tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng bằng cách đưa các yếu tố tái lập trình vào tế bào sinh dưỡng là một phương pháp đầy hứa hẹn cho liệu pháp tế bào trong y học tái tạo.
2 Các dòng iPSC từ người đã bắt đầu được phát triển, quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới, tuy nhiên chủ yếu vẫn là các dòng được phát triển từ tế bào sinh dưỡng có hệ gen của người da trắng, tính đến nay chưa có dòng iPSC của người Việt Nam. Hệ gene của người Việt Nam khác với các nước trên thế giới do vị trí địa lý, khí hậu, phong tục tập quán, chính vì thế chúng tôi tiến hành tạo các dòng iPSC phù hợp với hệ gene của người Việt Nam, làm công cụ hữu ích để nghiên cứu cơ chế bệnh, khám phá và sàng lọc độc tính các loại thuốc mới và đặc biệt là trở thành một nguồn tế bào vô hạn sử dụng cho cấy ghép và y học tái tạo. Mặc dù tiến bộ nhanh chóng, nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam vẫn đang giới hạn trong việc sử dụng tế bào gốc đa năng với khả năng biệt hoá thành một số hữu hạn dòng tế bào, các nghiên cứu về iPSC mới chỉ bắt đầu ở chuột từ năm 2016. Từ các cơ sở khoa học nêu trên, tôi lựa chọn đề tài: “Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)”. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Biểu hiện thành công hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu của người. - Điện biến nạp hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, GLIS1 vào quần thể tế bào gốc tạo máu của người. - Kiểm tra biểu hiện gen của các yếu tố tái lập trình trong tế bào gốc tạo máu sau khi điện biến nạp. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Là tiền đề để tạo thành công dòng tế bào gốc vạn năng cảm ứng đầu tiên từ tế bào có hệ gen của người Việt Nam, đánh dấu một bước phát triển quan trọng trong lĩnh vực này tại Việt Nam.
3 - Tạo dòng iPSC đầu tiên của người Việt Nam để cung cấp một khối lượng lớn tế bào làm mô hình cho nghiên cứu biệt hóa, nghiên cứu sàng lọc thuốc. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Chuyển gen thành công là bước đầu quan trọng và cần thiết trong quy trình tạo dòng tế bào gốc vạn năng cảm ứng.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 .Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Tế bào gốc Tế bào gốc là một loại tế bào đặc biệt trong cơ thể. Hai đặc điểm đặc trưng của tế bào này là khả năng nhân đôi vô hạn và khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào sinh dưỡng khác [43]. Nhờ thế chúng có khả năng tái tạo, sửa chữa và thay thế các tế bào chết, tổn thương trong cơ thể. Tên gọi tế bào gốc được hình thành cũng vì khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau khiến người ta liên tưởng đến hình ảnh gốc cây phân nhánh, mỗi nhánh hình thành cành, lá, quả. Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc 2.1.2. Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng - Năm 1962, John B. Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành của ếch có lưu mọi thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình [3]. - Năm 1981, Martin Evans và Martin Kaufman, Gail Martin phân lập được tế bào gốc phôi từ phôi của chuột [3].
5 - Năm 1997, Sir Ian Wilmut và cộng sự đã chuyển nhân vào tế bào sinh dưỡng để lập trình lại tế bào nhằm nhân bản cừu Dolly, loại động vật có vú đầu tiên được tạo bằng nhân bản tế bào sinh dưỡng [3]. - Năm 1998, James Thomson phân lập được tế bào gốc phôi người [3]. - Năm 2001, Tada và cộng sự đã dung hợp tế bào sinh dưỡng với tế bào gốc phôi để tạo ra các tế bào có khả năng biểu hiện gen liên quan đến các tế bào đa năng cho thấy ESC có chứa một số yếu tố có thể lập trình lại các tế bào sinh dưỡng [3]. - Năm 2006, các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ đã tạo ra tế bào gốc phôi hoàn toàn mới từ tế bào trưởng thành. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này được tạo ra nhờ chuyển bốn gen kích hoạt tái lập trình để tạo ra tế bào có đặc tính giống tế bào gốc thu nhận ở phôi [3]. Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng 2.1.3. Phân loại tế bào gốc Có thể phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa hoặc phân loại theo nguồn gốc [48]. Theo tiềm năng biệt hóa (differentiation potency) đa dạng của tế bào, các nhà nghiên cứu đã chia tế bào gốc thành 4 loại khác nhau [8]: tế bào gốc toàn năng (Totipotent), tế bào gốc vạn năng (Pluripotent), tế bào gốc đa năng (Multipotent) và tế bào gốc đơn năng (Unipotent).
6 a. Tế bào gốc toàn năng Các tế bào thuộc giai đoạn từ bốn đến tám tế bào trong quá trình phát triển của phôi sau thụ tinh được gọi là tế bào gốc toàn năng, chúng chỉ tồn tại trong giai đoạn phát triển phôi sớm. Với tế bào gốc toàn năng, mỗi tế bào ban đầu có thể hình thành một cơ thể hoàn chỉnh. Chúng có tiềm năng cao nhất và nhiều nhất để có thể trở thành tất cả các tế bào của cơ thể. Ở động vật có vú trưởng thành (bao gồm cả người), có khoảng 200 loại tế bào thuộc các nhóm như tế bào thần kinh, tế bào cơ, tế bào biểu mô, tế bào máu,…Những tế bào khác, bản chất cũng phát triển từ phôi, nhưng không hợp nhất tạo cơ thể gồm: mô ngoài phôi, nhau thai, dây rốn. Các dạng trên được tạo ra từ một tế bào toàn năng. Những tế bào ở giai đoạn phôi sớm đến giai đoạn phôi nang cũng có tính toàn năng và cũng có thể tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh [1]. b. Tế bào gốc vạn năng - Tế bào gốc phôi Cuối thập niên 20 được đánh dấu bằng sự bùng nổ của một hướng nghiên cứu non trẻ nhưng đầy tiềm năng, đó là công nghệ tế bào gốc, với khởi điểm là việc James Thomson phân lập được các tế bào gốc từ phôi người (1998) [18]. Các tế bào gốc phôi là các tế bào đa năng có thể được phân lập từ khối tế bào bên trong của tiền phôi. Tế bào gốc phôi đã nổi lên như một ứng cử viên hấp dẫn cho các liệu pháp dựa trên tế bào có khả năng phục hồi chức năng tế bào và mô bị mất. Những tế bào độc đáo này có thể tự làm mới vô thời hạn và có khả năng biệt hóa thành cả ba lớp mầm phôi (lá trong, lá giữa, lá ngoài). Ba lá mầm phôi này là nguồn gốc của tất cả các loại tế bào chuyên biệt khác nhau của cơ thể. Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên của tế bào gốc phôi để điều trị chấn thương tủy sống và thoái hóa điểm vàng trong năm 2010 đánh dấu sự khởi đầu của một kỷ nguyên mới trong y học tái tạo [40]. Tuy nhiên nghiên cứu này châm ngòi cho cuộc tranh luận về vấn đề đạo đức khi nguồn sử dụng là phôi người. Tế bào gốc phôi khi tiêm vào vị trí tổn thương có khả năng hình thành nên khối u quái (teratomas) tại vị trí tiêm. Do đó tế bào gốc cần được định hướng biệt
7 hóa thành các tế bào mong muốn trước khi được tiêm vào vị trí tổn thương. Hiện nay có một số kỹ thuật được dùng để kiểm soát sự biệt hóa tế bào gốc trên nuôi cấy thực nghiệm, ví dụ: thay đổi thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy, tác động vào bề mặt của đĩa nuôi cấy (tạo các giá thể), hay gài các gen đặc hiệu vào những tế bào này. - Tế bào gốc vạn năng cảm ứng Vào năm 1962, John B. Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành của ếch có lưu mọi thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình. Gurdon đã phát hiện rằng có thể đảo ngược sự chuyên môn hóa của các tế bào. Trong một thí nghiệm cổ điển, ông đã thay thế nhân tế bào chưa trưởng thành trong tế bào trứng của ếch bằng nhân từ tế bào ruột trưởng thành. Tế bào trứng biến đổi này phát triển thành một con nòng nọc bình thường. Kết quả thí nghiệm này chứng minh rằng DNA của tế bào trưởng thành mang thông tin cần thiết để phát triển thành tất cả các tế bào trong ếch và nguyên sinh chất của tế bào trứng chứa các tác nhân cảm ứng quá trình phát triển đảo ngược từ tế bào trưởng thành [19]. Phát hiện mang tính bước ngoặt của Gurdon ban đầu bị hoài nghi nhưng đã được chấp nhận khi các nhà khoa học khác xác nhận, dẫn tới khởi xướng nghiên cứu mạnh mẽ và kỹ thuật này đã được phát triển hơn nữa, cuối cùng dẫn đến việc nhân bản của động vật có vú. Nghiên cứu của Gurdon đã cho thấy hạt nhân của một tế bào trưởng thành, chuyên biệt có thể được đưa trở lại trạng thái đa năng, chưa trưởng thành. Nhưng thí nghiệm của ông liên quan đến việc loại bỏ nhân tế bào, sau đó là việc đưa chúng vào các tế bào khác. Liệu có thể biến một tế bào nguyên vẹn trở lại thành tế bào gốc đa năng không? Shinya Yamanaka đã trả lời câu hỏi này trong một bước đột phá khoa học 40 năm sau phát hiện của Gurdon. Năm 2006 Shinya Yamanaka đã sử dụng các vector retrovirus để biểu hiện rất nhiều yếu tố phiên mã, đơn lẻ và kết hợp, trong nguyên bào sợi (fibroblasts) của chuột trong điều kiện nuôi cấy. Đáng lưu ý là ông đã phát hiện ra rằng cả tế bào người và chuột có thể được lập trình lại về trạng thái vạn
8 năng, được gọi là tế bào gốc vạn năng cảm ứng, tương tự như tế bào gốc phôi, sau khi xâm nhiễm (transduction) bằng retrovirus chỉ mã hóa 4 yếu tố : KLF4, SOX2, OCT4, và c-MYC [13]. Ngoài ra, James Thomson báo cáo rằng tổ hợp các yếu tố khác (OCT4, SOX2, NANOG và LIN28) có khả năng tái lập trình các tế bào sinh dưỡng của con người thành iPSC [28]. Các phòng thí nghiệm trên khắp thế giới đã nhanh chóng sử dụng kỹ thuật mang tính cách mạng này và đến năm 2009, chỉ sau 3 năm khi Yamanaka tạo thành công iPSC, khoảng 300 bài báo về iPSC được xuất bản [15]. Giải Nobel về Y Sinh học năm 2012 đã vinh danh 2 nhà khoa học Gurdon và Yamanaka với công trình tạo ra iPSC. Đến năm 2007, hai nhóm nghiên cứu độc lập đã tạo ra iPSC từ nguyên bào sợi của người [28], [32]. Việc phát hiện ra công nghệ tế bào gốc vạn năng cảm ứng đã mở ra những cơ hội chưa từng có trong y học tái tạo, mô hình bệnh và khám phá thuốc [7]. Đối với mô hình bệnh, tế bào sinh dưỡng sở hữu đặc điểm của các tế bào bị bệnh từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra iPSC và được tiếp tục sử dụng để nghiên cứu các bệnh [7]. Các tế bào sinh dưỡng từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra các iPSC. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này có thể được sửa chữa bằng liệu pháp gen và tiếp tục được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng khỏe mạnh được cấy ghép cho bệnh nhân, hoặc chúng có thể được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng chưa được chỉnh sửa để mô hình hóa bệnh hoặc sàng lọc thuốc [7]. Ví dụ, vào năm 2012, các tế bào gốc thần kinh được tạo ra từ những người mắc bệnh Familial dysautonomia - một rối loạn di truyền hiếm gặp, ảnh hưởng đến các dòng tế bào thần kinh, phát triển tế bào thần kinh đã được sử dụng để sàng lọc gần 7000 phân tử nhỏ và xác định phân tử nhỏ sử dụng mô hình bệnh dựa trên iPSC có thể xác định thuốc bổ trợ để can thiệp điều trị bệnh Familial dysautonomia [9]. Các nghiên cứu phát triển thuốc trong đó gồm sàng lọc các phân tử nhỏ, kiểm tra độc tính để đánh giá sự an toàn, đã khai thác thành công dựa trên kỹ thuật iPSC [7]. Công nghệ này đã mở ra một trang sử mới đối với các liệu pháp tế bào gốc sử dụng tế bào gốc vạn năng cảm ứng trên người (human induced pluripotent stem cell- hiPSC)
9 của chính bệnh nhân do tránh được nguy cơ đào thải miễn dịch cũng như các vấn đề đạo đức đi kèm với việc sử dụng tế bào gốc phôi [45]. Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mô hình bệnh và khám phá thuốc Năm 2014, Nhật Bản lần đầu tiên sử dụng các tế bào biểu mô sắc tố võng mạc có nguồn gốc iPSC để điều trị thoái hóa điểm vàng [15]. Năm 2019, tại Nhật Bản đã thử nghiệm liệu pháp iPSC cho chấn thương tủy sống. Liệu pháp này thu tế bào đã biệt hóa từ bệnh nhân và tái lập trình chúng thành tế bào thần kinh thông qua tế bào gốc vạn năng cảm ứng, sau đó các bác sĩ lâm sàng sẽ tiêm 2 triệu tế bào vào vị trí tổn thương của mỗi bệnh nhân [53]. Hiện tại, có một nhu cầu được công nhận để đảm bảo an toàn cho bất kỳ liệu pháp có nguồn gốc iPSC nào và cần phải xác minh một cách có hệ thống các đặc điểm và sự an toàn của các dòng, bằng cách
10 kiểm tra bộ gen và biểu hiện của gen [54]. Ví dụ, nghiên cứu của Bhutani và cộng sự năm 2006 lần đầu tiên đánh giá sự an toàn của ba phương pháp tái lập trình phổ biến (retroviral vector, non-integrating Sendai virus, synthetic mRNAs). Ưu điểm quan trọng nhất của iPSC so với ESC là khả năng sử dụng tế bào sinh dưỡng trưởng thành từ những bệnh nhân mắc bệnh do di truyền xác định [23],[6]. So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng được trình bày ở bảng 1.1. Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng Tế bào gốc vạn năng Tế bào gốc phôi Tế bào gốc vạn năng cảm ứng Nguồn thu nhận Phôi thai Tế bào sinh dưỡng Vấn đề đạo đức Có Không Tốc độ tăng sinh Cao Cao Tính tiện dụng Cao Cao Khả năng tự biệt hóa Có Có Khả năng tạo dòng tế bào khác Cao Cao Khả năng gây đào thải miễn dịch Có Không c. Tế bào gốc đa năng Tế bào gốc đa năng (Multipotent) là những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của cơ thể. Các tế bào được tạo thành nằm trong một hệ tế bào có liên quan mật thiết. Ví dụ như tế bào gốc trung mô có thể biệt hóa thành tế bào xương, sụn, mỡ. Các tế bào gốc đa năng có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như mô mỡ, cuống rốn, tủy xương, tủy răng sữa,… Mặc dù có giới hạn về khả năng biệt hóa, nhưng gần đây, loại tế bào này cũng đã được y sinh học tập trung khai thác, và qua đó đã được ứng dụng rất thành công trong nhiều liệu pháp dựa vào tế bào gốc (stem cell therapy). Tế bào gốc trưởng thành có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào có chức năng khác như thế bào gan, biểu bì, xương, giác mạc. Những tế bào này có thể rất hữu ích