Khóa luận tốt nghiệp đại học Kỹ thuật xét nghiệm y học: Đánh giá sự bộc lộ phức hợp miễn dịch và kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang trong chẩn đoán bệnh viêm cầu thận Lupus

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài "Đánh giá sự bộc lộ phức hợp miễn dịch và kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang trong chẩn đoán bệnh viêm cầu thận Lupus" là đánh giá sự bộc lộ phức hợp miễn dịch trên mảnh sinh thiết thận bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang trên bệnh nhân viêm cầu thận Lupus; đánh giá một số yếu tố kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang ảnh hưởng đến chẩn đoán bệnh viêm cầu thận Lupus.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học Kỹ thuật xét nghiệm y học: Đánh giá sự bộc lộ phức hợp miễn dịch và kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang trong chẩn đoán bệnh viêm cầu thận Lupus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGỌC LAN ĐÁNH GIÁ SỰ BỘC LỘ PHỨC HỢP MIỄN DỊCH VÀ KỸ THUẬT CẮT, NHUỘM MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM CẦU THẬN LUPUS KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC HÀ NỘI – 2023
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGỌC LAN ĐÁNH GIÁ SỰ BỘC LỘ PHỨC HỢP MIỄN DỊCH VÀ KỸ THUẬT CẮT, NHUỘM MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM CẦU THẬN LUPUS KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Khoá: QH.2019.Y Người hướng dẫn: TS. BS. Phạm Hoàng Ngọc Hoa ThS. Vũ Thị Thu Hảo HÀ NỘI – 2023
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo & Công tác Học sinh Sinh viên, Phòng ban bộ môn thuộc trường Đại Học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo cơ hội cho em được học tập, tu dưỡng và rèn luyện các kỹ năng chuyên môn tại trường và Bệnh viện Bạch Mai. Cùng với sự nỗ lực của bản thân, em đã hoàn thành bài khoá luận tốt nghiệp của mình. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Giải phẫu bệnh – Tế bào học cùng tập thể các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên đã giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. BS. Phạm Hoàng Ngọc Hoa và ThS. Vũ Thị Thu Hảo – người đã chỉ bảo, hướng dẫn tận tình, cho em nhiều ý kiến nhận xét cũng như truyền đạt cho em tinh thần học hỏi và làm việc nghiêm túc trong suốt quá trình thực hiện khoá luận này. Em xin cảm ơn bác sĩ Thành luôn dành thời gian giúp em trong quá trình thu thập số liệu và anh KTV Thẩm Lê Tự Cường đã hỗ trợ, giám sát và giúp đỡ em nhiệt tình trong quá trình triển khai các kỹ thuật trong đề tài. Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn tới bố mẹ, những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Do kiến thức còn hạn hẹp nên không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận những ý kiến đóng góp của các quý thầy, cô để khoá luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Lan i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT C Complement (Bổ thể) H&E Hematoxylin – Eosin Ig Immunoglobulin (Globulin miễn dịch) ISN International Society of Nephrology (Hiệp hội Thận học Quốc tế) KHVĐT Kính hiển vi điện tử KHVHQ Kính hiển vi huỳnh quang KHVQH Kính hiển vi quang học KN Kháng nguyên KT Kháng thể LBĐHT Lupus ban đỏ hệ thống MDHQ Miễn dịch huỳnh quang NSX Nhà sản xuất PAS Periodic Acid – Schiff PBS Phosphate Buffer Saline PHMD Phức hợp miễn dịch RPS Renal Pathology Society (Hiệp hội Bệnh học Thận) VCTL Viêm cầu thận Lupus ii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................ii MỤC LỤC ............................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ................................................................................. vi ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................... 3 1.1. Viêm cầu thận Lupus .................................................................................. 3 1.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 3 1.1.2. Dịch tễ học .............................................................................................. 3 1.1.3. Nguyên nhân ........................................................................................... 4 1.1.4. Cơ chế gây bệnh viêm cầu thận Lupus ................................................... 4 1.1.5. Vai trò của các globulin miễn dịch (IgA, IgG, IgM) và các bổ thể (C3, C4, C1q) trong viêm cầu thận Lupus ................................................................... 5 1.1.6. Tình hình nghiên cứu về sự bộc lộ phức hợp miễn dịch ở Việt Nam và trên thế giới .......................................................................................................... 6 1.1.7. Phân loại mô bệnh học viêm cầu thận Lupus ......................................... 7 1.1.8. Các phương pháp chẩn đoán ................................................................... 9 1.2. Kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang ........................................ 10 1.2.1. Kỹ thuật cắt lạnh ...................................................................................10 1.2.2. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang ..............................................11 1.2.3. Vai trò của kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch quang hỗ trợ chẩn đoán viêm thận Lupus .................................................................................................14 1.2.4. Ảnh hưởng của kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang trong chẩn đoán bệnh viêm cầu thận Lupus ........................................................................15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 17 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn ..............................................................................17 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ................................................................................17 2.1.3. Cỡ mẫu ..................................................................................................17 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 18 iii
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ..............................................................................18 2.2.2. Các biến số và chỉ số.............................................................................18 2.2.3. Quy trình nghiên cứu ............................................................................19 2.3. Xử lý số liệu ................................................................................................ 20 2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 21 2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu............................................................ 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ........................................................................................ 22 3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ............................................................... 22 3.2. Phân loại mô bệnh học viêm cầu thận Lupus ......................................... 24 3.3. Sự bộc lộ phức hợp miễn dịch trong viêm cầu thận Lupus .................. 25 3.4. Một số yếu tố cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang ảnh hưởng tới chẩn đoán trong viêm cầu thận Lupus ....................................................................... 28 3.4.1. Kỹ thuật cắt lạnh ...................................................................................28 3.4.2. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang ..............................................29 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 32 4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ........................................................ 32 4.1.1. Đặc điểm giới .........................................................................................32 4.1.2. Đặc điểm về tuổi ....................................................................................32 4.2. Phân loại mô bệnh học viêm cầu thận Lupus ......................................... 32 4.3. Sự bộc lộ phức hợp miễn dịch trong viêm cầu thận Lupus .................. 33 4.4. Một số yếu tố kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang ảnh hưởng tới chẩn đoán trong viêm cầu thận Lupus ........................................................ 35 4.4.1. Kỹ thuật cắt lạnh ...................................................................................35 4.4.2. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang ..............................................37 4.5. Hạn chế của nghiên cứu............................................................................ 40 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 41 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HOẠ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Phân bố nhóm tuổi theo giới ............................................................... 23 Bảng 3.2. Phân loại mô bệnh học VCTL theo phân loại ISN/RPS 2003............ 24 Bảng 3.3. Phân bố cường độ lắng đọng PHMD trên KHVHQ ........................... 25 Bảng 3.4. Phân bố lắng đọng của PHMD dương tính giữa các class ................. 26 Bảng 3.5. Phân bố lắng đọng của tất cả các PHMD dương tính trong từng class ..................................................................................................................... 27 Bảng 3.6. Phân tích các lỗi của kỹ thuật cắt theo mức độ .................................. 28 Bảng 3.7. Phân tích mức độ nền của từng PHMD .............................................. 30 Bảng 4.1. So sánh với một số kết quả nghiên cứu của các tác giả khác ............ 33 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của kỹ thuật cắt đến chẩn đoán ………...……………... 35 Bảng 4.3. Nguyên nhân và cách khắc phục mốt số lỗi của kỹ thuật cắt …........36 Bảng 4.4. Một số lỗi dẫn đến mảnh cắt bị nền, nguyên nhân và cách khắc phục …...………………...……………………………………………………..38 Bảng 4.5. Một số lỗi có thể dẫn đến mảnh cắt không bắt màu/ bắt màu yếu, nguyên nhân và cách khắc phục……………...……...…………………………39 v
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Phân bố theo giới ............................................................................ 22 Biểu đồ 3.2. Phân bố theo nhóm tuổi .................................................................. 23 Biểu đồ 3.3. Phân bố của lắng đọng PHMD trên KHVHQ ................................ 25 Biểu đồ 3.4. Phân bố mức độ lỗi của kỹ thuật cắt............................................... 28 Biểu đồ 3.5. Phân bố mức độ nền của từng PHMD ............................................ 29 Biểu đồ 3.6. Phân bố mức độ không bắt màu/ bắt màu yếu của từng PHMD .... 30 vi
ĐẶT VẤN ĐỀ Lupus ban đỏ hệ thống (LBĐHT) được đặc trưng bởi rối loạn chức năng hệ thống miễn dịch và không đồng nhất về mặt lâm sàng, biểu hiện các triệu chứng về thận, da liễu, thần kinh và tim mạch [1]. Trong đó, khoảng 60% bệnh nhân Lupus sẽ phát triển viêm thận Lupus liên quan đến lâm sàng vào một thời điểm nào đó trong quá trình mắc bệnh của họ [2]. Viêm thận Lupus là nguyên nhân chính gây bệnh và thậm chí tử vong ở bệnh nhân Lupus ban đỏ hệ thống. Trong viêm thận Lupus, bệnh liên quan đến các phức hợp miễn dịch, có thể lắng đọng ở bất kỳ đâu trong nephron bao gồm tổn thương cầu thận, ống thận, mô kẽ và mạch máu [3]. Đặc biệt, tổn thương thận được đặc trưng bởi sự lắng đọng ở cầu thận phức hợp miễn dịch hình thành bởi các tự kháng thể IgG, IgM, IgA và các bổ thể như C3, C4, C1q được xác định bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. Trong nửa thế kỷ qua, miễn dịch huỳnh quang trên các lát cắt đông lạnh là tiêu chuẩn vàng để đánh giá hóa mô miễn dịch của các mẫu sinh thiết thận [4,5]. Cùng với các phương pháp nhuộm thường quy như Hematoxylin – Eosin (HE), Periodic Acid Schiff (PAS) hay phương pháp nhuộm đặc biệt như: 3 màu Masson, Bạc Jones Methenamine trong chẩn đoán các bệnh về thận đặc biệt là viêm cầu thận Lupus thì phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang luôn được ưu tiên hàng đầu. Viêm cầu thận Lupus có sự lưu hành, lắng đọng các phức hợp miễn dịch tại các vị trí khác nhau nên khi nhuộm sự bộc lộ đối với từng loại globulin miễn dịch hay bổ thể khi quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cũng khác nhau. Các nghiên cứu về viêm thận Lupus hay viêm cầu thận Lupus chủ yếu liên quan về mặt lâm sàng, các phương pháp điều trị,…; một số ít công trình nghiên cứu liên quan đến phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang với sự bộc lộ kháng nguyên trong viêm thận như: nghiên cứu của Saira Javeed, Sinniah R, Banfi G, Đỗ Thị Liệu, Phạm Hoàng Ngọc Hoa, Nghiêm Trung Dũng… cho thấy phần lớn các phức hợp miễn dịch có IgA, IgM, IgG và các bổ thể C3, C4, C1q hầu như đều quan sát được sau khi nhuộm miễn dịch huỳnh quang với tỉ lệ khác nhau so với các bệnh về thận khác. Trong đó, đa số tỉ lệ phức hợp miễn dịch 1
của IgG, C1q, C3 chiếm tỉ lệ lớn và tỉ lệ của bổ thể C4 nhỏ nhất và điều này có sự khác nhau không đáng kể của từng nghiên cứu. Miễn dịch huỳnh quang là một phương pháp nhuộm đặc biệt, nên không phải cơ sở nào cũng có điều kiện để thực hiện được. Việc đưa ra kết quả chẩn đoán rất quan trọng đối với tiên lượng và điều trị viêm cầu thận Lupus ở từng giai đoạn khác nhau của bệnh nên cần phải đảm bảo tốt các kỹ thuật thực hiện trước đó để có được một tiêu bản nhuộm bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang đạt tiêu chuẩn. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật chỉ cần có sai sót tại một công đoạn thì có thể dẫn tới chẩn đoán âm tính giả hoặc dương tính giả ảnh hưởng đến chất lượng điều trị và gây nguy hiểm cho bệnh nhân nếu không được tiên lượng sớm. Đồng thời, các nghiên cứu về sự bộc lộ phức hợp miễn dịch còn hạn chế vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá sự bộc lộ phức hợp miễn dịch và kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang trong chẩn đoán bệnh viêm cầu thận Lupus” với hai mục tiêu: 1. Đánh giá sự bộc lộ phức hợp miễn dịch trên mảnh sinh thiết thận bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang trên bệnh nhân viêm cầu thận Lupus. 2. Đánh giá một số yếu tố kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang ảnh hưởng đến chẩn đoán bệnh viêm cầu thận Lupus. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Thuật ngữ "Lupus" thuộc về ngôn ngữ Latinh có nghĩa là "sói", nó được đặt tên như vậy bởi vì các bệnh nhân LBĐHT có một loại phát ban cụ thể trên mặt giống như vết cắn của chó sói [6]. Sau này thuật ngữ “ban cánh bướm” hay “Lupus ban đỏ” và các hình ảnh minh hoạ đầu tiên về bệnh da được các nhà nghiên cứu công bố. Hiện nay, đa số các tác giả thống nhất sử dụng thuật ngữ bệnh Lupus ban đỏ hệ thống trong y văn và các nghiên cứu khoa học. Lupus ban đỏ hệ thống là bệnh tự miễn do sự kết hợp tự kháng thể với tự kháng nguyên trong cơ thể dẫn tới phản ứng viêm gây tổn thương thực thể hoặc chức năng của tế bào, mô, cơ quan. Phức hợp miễn dịch lắng đọng tại mô (da, khớp, tim, phổi, hệ thần kinh trung ương và thận) dẫn tới bệnh phát sinh và có sự tham gia của bổ thể. Một trong các cơ quan bị ảnh hưởng nghiêm trọng là thận và gây viêm thận Lupus hay viêm cầu thận Lupus. Thận là cơ quan phức tạp với nhiều chức năng quan trọng, một phần thiết yếu của hệ thống tiết niệu và cũng cần thiết cho sự điều hòa cân bằng nội môi của cơ thể như chất điện giải, cân bằng axit bazơ và huyết áp. Khi thận bị tổn thương do nguyên nhân nguyên phát hay thứ phát thì cũng cần được chẩn đoán kịp thời để tránh những hậu quả nghiêm trọng về sau. Chẩn đoán tổn thương thận dựa vào các đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học [7]. 1.1. Viêm cầu thận Lupus 1.1.1. Khái niệm Thuật ngữ “Lupus” dùng để chỉ Lupus ban đỏ hệ thống, viêm cầu thận nghĩa là sự viêm xảy ra ở cầu thận. Viêm cầu thận Lupus (VCTL) dùng để chỉ tình trạng viêm tại cầu thận thường chủ yếu do có sự lắng đọng phức hợp miễn dịch, là bệnh thận thứ phát sau Lupus ban đỏ hệ thống. Cầu thận là vùng mao mạch có áp lực cao hơn so với ống kẽ thận nên khi bệnh nhân bị viêm thận Lupus sự tổn thương tập trung chủ yếu ở cầu thận. 1.1.2. Dịch tễ học Tỉ lệ mắc LBĐHT và cơ hội phát triển viêm thận Lupus hay viêm cầu thận Lupus khác nhau đáng kể giữa các khu vực trên thế giới, các chủng tộc và 3
dân tộc. Bệnh phổ biến hơn ở nữ giới so với nam giới ở mọi nhóm tuổi và dân số; tỉ lệ nữ giới trên nam giới cao nhất ở độ tuổi sinh sản, nằm trong khoảng từ 8:1 đến 15:1 và thấp nhất ở trẻ trước tuổi dậy thì vào khoảng 4:3 [8-10]. Nhiều nguyên cứu cho thấy tỉ lệ mắc LBĐHT ở phụ nữ cao gấp 9 lần so với nam giới [11,12]. 1.1.3. Nguyên nhân Cho đến nay căn nguyên của bệnh LBĐHT vẫn chưa hiểu biết tường tận nhưng hầu hết các tác giả đều thống nhất nguyên nhân là do sự kết hợp giữa yếu tố di truyền với các yếu tố khác như miễn dịch, hormone nữ và môi trường [10,13-15]. 1.1.3.1. Yếu tố di truyền học Căn bệnh này không liên quan đến một gen nhất định, nhưng những người mắc bệnh Lupus thường có các thành viên trong gia đình mắc các bệnh tự miễn dịch khác. Những tiến bộ trong nghiên cứu về di truyền của bệnh LBĐHT phát triển nhanh chóng trong vài năm gần đây. Nhiều nghiên cứu đã xác định được hơn 30 gen có khuynh hướng mắc bệnh LBĐHT cao như HLA – DR2, DR3,… 1.1.3.2. Yếu tố môi trường Các yếu tố môi trường có thể bao gồm: ánh sáng cực tím, thuốc khử methyl và nhiễm trùng do virus nội sinh hoặc tác nhân giống virus. 1.1.3.3. Yếu tố nội tiết tố Trong hầu hết các nghiên cứu tỉ lệ mắc bệnh ở nữ giới và trẻ gái tuổi vị thành niên có tỉ lệ mắc bệnh cao hơn nam giới (tỉ lệ 7-9/1) [16,17]. Một số chuyên gia y tế tin rằng nội tiết tố nữ estrogen có thể đóng một vai trò trong việc gây ra bệnh. Phụ nữ cũng có thể gặp phải các triệu chứng nghiêm trọng hơn khi mang thai và khi có kinh nguyệt. 1.1.4. Cơ chế gây bệnh viêm cầu thận Lupus Cơ chế gây bệnh viêm cầu thận Lupus rất phức tạp, đáng chú ý trong Lupus một số tế bào có DNA bị hư hỏng nặng, tế bào trải qua quá trình chết tế bào theo lập trình (apoptosis). Điều này tạo ra các thể apoptosis và phơi bày 4
những phần bên trong tế bào bao gồm các thành phần của nhân như: DNA, protein – histones và các protein khác với phần còn lại của cơ thể [18]. Trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống miễn dịch cho rằng các thành phần này là ngoại lai hay kháng nguyên lạ và do chúng thuộc nhân tế bào nên gọi là kháng nguyên nhân, từ đó tế bào miễn dịch sẽ cố gắng tấn công chúng. Những người bị Lupus có sự thu dọn những chất này kém hiệu quả, về cơ bản cơ thể không loại bỏ tốt các thể apoptosis và do đó có nhiều kháng nguyên nhân lắng đọng xung quanh, kết quả là tế bào lympho B bắt đầu sản xuất các kháng thể chống lại các thành phần của nhân gọi là kháng thể kháng nhân. Kháng nguyên trong trường hợp này thuộc kháng nguyên hoà tan và có kích thước nhỏ nên số lượng kháng nguyên lớn hơn rất nhiều so với kháng thể, kháng thể từ tế bào lympho B sản xuất cố gắng liên kết với một kháng nguyên hình thành phức hợp KN – KT. Phức hợp miễn dịch này có khả năng sinh miễn dịch yếu nên khó lôi kéo đại thực bào cũng như không được loại bỏ khỏi hệ tuần hoàn nhanh dẫn đến tồn tại lâu trong máu và gây lắng đọng ở những nơi có vùng máu chảy xoáy, vùng mao mạch có áp lực cao, đặc biệt là cầu thận. Vị trí lắng đọng thường gặp nhất là ở dưới thành mao mạch hay nội mô, sự lắng đọng cũng có thể trong khoang Bowman của nephron trong màng đáy hay gần các tế bào gian mạch. Bệnh tiếp tục lặp đi lặp lại khiến cầu thận lắng đọng một lượng lớn phức hợp miễn dịch. Những phức hợp miễn dịch này hoạt hoá bổ thể theo con đường cổ điển gây tổn thương mô dẫn đến viêm cầu thận Lupus, quá trình này thuộc phản ứng quá mẫn loại III. Mức độ của sự viêm trong thận có thể khu trú bao gồm các nephron trong một khu vực hoặc có thể lan toả liên quan đến hầu hết các nephron trong cả hai thận. 1.1.5. Vai trò của các globulin miễn dịch (IgA, IgG, IgM) và các bổ thể (C3, C4, C1q) trong viêm cầu thận Lupus Viêm cầu thận Lupus đặc trưng bởi sự lắng đọng phức hợp miễn dịch tại cầu thận và gây viêm tại chỗ với quá mẫn typ III. Quá mẫn typ III được đặc trưng bởi sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể hoà tan. Kháng thể trong cơ thể có vai trò loại bỏ tự kháng nguyên từ tế bào chết, đặc biệt là kháng nguyên nhân (ANA). Trong đó, kháng thể là loại có khả năng hoạt hoá bổ thể 5
khi kết hợp với kháng nguyên đó là IgM và IgG, đôi khi có cả IgA khi ở dạng kết tụ. Phức hợp miễn dịch gây hoạt hoá bổ thể ngay từ khi lưu hành trong máu, bổ thể đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh mạng phức hợp miễn dịch, điểu này được chứng minh bởi Michael Heidelberger vào những năm 1940 [19]. Kể từ đó, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng bổ thể thúc đẩy quá trình bất hoạt và thanh thải các phức hợp miễn dịch theo hai cơ chế chính. Một trong số đó là việc giảm kích thước của các mạng phức hợp miễn dịch [8]. Điều này đạt được nhờ sự tương tác của C1q với các phức hợp miễn dịch, cản trở các tương tác Fc–Fc giúp ổn định các phức hợp miễn dịch, và nhờ liên kết cộng hóa trị của C4b và C3b với các kháng nguyên trong các phức hợp miễn dịch. Sự gắn kết này can thiệp vào sự gắn kết của kháng nguyên với kháng thể bằng cách làm giảm hiệu quả hóa trị của kháng nguyên đối với kháng thể. Cùng với việc làm giảm kích thước của phức hợp miễn dịch, bổ thể cung cấp thêm các phối tử bên trong phức hợp miễn dịch, thúc đẩy quá trình thanh thải phức hợp miễn dịch bằng bổ thể cũng như thụ thể Fc [20]. Các globulin miễn dịch (IgA, IgG, IgM) và các bổ thể (C3, C4, C1q) đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ phức hợp miễn dịch trong viêm cầu thận Lupus. Do đó, các kháng thể và bổ thể này coi như mục tiêu trong nhuộm miễn dịch huỳnh quang để từ đó xác định tình trạng, giai đoạn tổn thương cầu thận thông qua vị trí, mức độ lắng đọng miễn dịch. 1.1.6. Tình hình nghiên cứu về sự bộc lộ phức hợp miễn dịch ở Việt Nam và trên thế giới Tại Việt Nam cũng có nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến viêm cầu thận Lupus nhưng chủ yếu các nghiên cứu tập trung vào đặc điểm lâm sàng, các phương pháp điều trị,... ít nghiên cứu liên quan đến sự bộc lộ của các phức hợp miễn dịch của globulin miễn dịch (IgA, IgG, IgM) và các bổ thể (C3, C4, C1q). Trong đó, nghiên cứu của Đỗ Thị Liệu (năm 2001) [12], Phạm Hoàng Ngọc Hoa (2015) [21], Nghiêm Trung Dũng (2018) [22] chỉ ra thành phần của các lắng đọng PHMD rất thay đổi, chủ yếu sự bộc lộ phức hợp miễn dịch của IgG, C1q và C3 chiếm tỉ lệ cao và hầu hết các globulin miễn dịch, bổ thể đều có mặt. 6
Trên thế giới, có sự tương đồng với kết quả nghiên cứu trong nước với IgG chiếm tỉ cao, tiếp đến là C3 và C1q tại nghiên cứu của R Sinniah, PH Phong (năm 1976) [23], cũng tương tự như nghiên cứu của Banfi G, Mazzucco G (năm 1985) [24]. Một nghiên cứu khác của Saira Javeed, Saima Batool (năm 2022) [25] mức độ dương tính tối đa của C1q đã được quan sát với kết quả dương tính cao nhất, tiếp đến là mức độ dương tính của IgG, IgM và C3, các phức hợp miễn dịch khác đều được biểu lộ với tỉ lệ thấp hơn; trường hợp này lại có sự thay đổi về tỉ lệ bộc lộ phức hợp miễn dịch của bổ thể và kháng thể. 1.1.7. Phân loại mô bệnh học viêm cầu thận Lupus 1.1.7.1. Một số khái niệm tổn thương cơ bản trong viêm cầu thận Lupus - Tổn thương lan toả (Diffuse): tổn thương liên quan đến tất cả hoặc gần như tất cả số cầu thận (tổn thương ≥ 50% số cầu thận được quan sát). - Tổn thương dạng ổ (Focal): tổn thương liên quan đến một số cầu thận (tổn thương ≤ 50% số cầu thận được quan sát). - Tổn thương toàn bộ (Global): tổn thương liên quan đến ≥ 50% của một cầu thận. - Tổn thương cục bộ (Segmental): tổn thương liên quan đến ≤ 50% của một cầu thận. 1.1.7.2. Phân loại tổn thương viêm cầu thận Lupus theo ISN/RPS năm 2003 Tổn thương thận qua sinh thiết thận ở giai đoạn sớm của LBĐHT gặp ở khoảng 60-70% bệnh nhân. Theo Phân loại của Hiệp hội Thận học Quốc tế (ISN) và Hiệp hội Bệnh học Thận (RPS) năm 2003 [9] tổn thương thận được chia thành 6 class: Class I. Viêm cầu thận Lupus có gian mạch tối thiểu: - Là dạng tổn thương sớm và nhẹ nhất của viêm cầu thận Lupus. - Cầu thận bình thường trên KHVQH nhưng có lắng đọng PHMD trên KHVHQ. Lắng đọng tại gian mạch thường nhỏ và có thể phân bố cục bộ hoặc toàn bộ. Class II. Viêm cầu thận Lupus có tăng sinh gian mạch: 7
- Tăng sinh tế bào gian mạch mọi mức độ trên KHVQH. - Có thể có vài lắng đọng PHMD đơn độc dưới biểu mô hay dưới nội mô trên KHVHQ hay KHVĐT, nhưng không thấy trên KHVQH. Class III. Viêm cầu thận Lupus có ổ cục bộ: - Viêm cầu thận ổ cục bộ bao gồm tổn thương tăng sinh nội hoặc ngoài mao mạch toàn bộ hoặc cục bộ chiếm ít hơn
Cách chia loại ở trên cho thấy, dù ở giai đoạn nào thì ở bệnh viêm cầu thận Lupus cũng sẽ xuất hiện phức hợp miễn dịch, do đó dựa vào mức độ phân bố, vị trí lắng đọng các loại globulin miễn dịch, bổ thể và kết hợp với hình thái mô bệnh học trên KHVQH để xác định đúng giai đoạn bệnh. 1.1.8. Các phương pháp chẩn đoán Có rất nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh viêm cầu thận Lupus trên cơ sở bệnh nhân bị Lupus bao gồm: xét nghiệm nước tiểu dựa vào dấu ấn quan trọng trong chẩn đoán đợt cấp của viêm cầu thận Lupus (protein niệu tăng,…), soi tế bào cặn nước tiểu có hồng cầu niệu, trụ niệu và đặc biệt là phương pháp sinh thiết thận. Sinh thiết thận là một thủ thuật xâm lấn mà kết quả phụ thuộc chủ quan vào người đọc kết quả. Các tổn thương được chẩn đoán theo đợt hoạt động của viêm cầu thận Lupus. Thay đổi trên sinh thiết thận qua nhuộm quá chậm cho việc chẩn đoán đợt kịch phát của viêm cầu thận Lupus. Do vậy cần có phương pháp can thiệp kịp thời trong sinh thiết để điều trị phù hợp với sự phát triển của bệnh. Người ta đã kết luận rằng việc kiểm tra kết hợp các mảnh sinh thiết thận bằng KHVQH và KHVHQ cũng như KHVĐT và phân loại nghiêm ngặt các tổn thương hỗ trợ cho chẩn đoán và tiên lượng có giá trị [26]. - Trên kính hiển vi quang học: Mảnh thận đã sinh thiết thận từ bệnh nhân được xử lý và đem nhuộm với các phương pháp nhuộm khác nhau để chẩn đoán: + Hematoxylin - Eosin (H&E) và PAS (Periodic acid- Schiff): cho cái nhìn tổng quát về thành phần, cấu trúc của mảnh sinh thiết. + Nhuộm 3 màu Masson: nhuộm mô liên kết. + Nhuộm Bạc Jones Methenamine: phát hiện tổn thương tại màng đáy cầu thận. - Trên kính hiển vi huỳnh quang: nhuộm trên mảnh cắt lạnh các kháng thể để phát hiện các kháng nguyên như globulin miễn dịch (IgG, IgA, IgM) và 9
các thành phần bổ thể (C3, C4 và C1q) lắng đọng ở cầu thận cũng như mạch máu và ống thận. - Trên kính hiển vi điện tử: kết hợp với KHVHQ và KHVQH để phát hiện các tổn thương liên quan đến lắng đọng PHMD, những biến đổi bất thường của cầu thận và các thành phần khác của thận. 1.2. Kỹ thuật cắt, nhuộm miễn dịch huỳnh quang Mảnh sinh thiết thận sau khi đã được bác sĩ lấy từ bệnh nhân được cố định trong dung dịch Natriclorua 0,9% và được xử lý qua kỹ thuật cắt lạnh và kỹ thuật nhuộm MDHQ. 1.2.1. Kỹ thuật cắt lạnh 1.2.1.1. Nguyên tắc Kỹ thuật cắt lạnh là phương pháp xét nghiệm mô bệnh học nhanh, thường được áp dụng trong phẫu thuật. Khi mẫu mô được làm lạnh, nước ở trong mô chuyển thành đá và đóng vai trò như chất trung gian giữ hình dạng (khung) của mô, vì thế mô trở nên cứng và có thể cắt mỏng được [27]. 1.2.1.2. Các bước tiến hành Bệnh phẩm sinh thiết từ thận đã được ngâm trong nước muối sinh lý sẽ được chuyển đến phòng cắt lạnh để thực hiện kỹ thuật. - Chuẩn bị trang thiết bị, vật tư: + Thiết bị: Máy cắt lạnh hãng LEICA CM 1950 ở nhiệt độ -22°C + Hoá chất: Gel cắt lạnh (OCT) – chất để vùi bệnh phẩm trước cắt lạnh + Dụng cụ:  Dao: dao cắt phá, dao cắt lát  Gá đúc, khối Head tracter  Lam kính tích điện dương  Giá đựng tiêu bản  Chổi lông (que tãi) 10
 Bút chì  Găng tay - Quy trình cắt lạnh: + Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc (block) lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh trong buồng lạnh của máy. Phủ gel cắt lạnh (nếu bệnh phẩm bé cần lót trước một lớp gel) và phủ gel kín bệnh phẩm. Xoay khối Head tracter đặt lên trên khuôn đúc chứa bệnh phẩm rồi đóng kín cửa kính phía trên buồng máy chờ cho đến khi gel chuyển sang màu trắng đục là được (khoảng 30 giây – 3 phút). + Lắp block vào vị trí cắt, cắt phá lấy mặt phẳng cắt, chuyển sang dao cắt và cắt thực sự với độ dày 4-6μm. + Sử dụng chổi mềm (que tãi) và lam kính sạch để lấy bệnh phẩm lấy mảnh cắt theo thứ tự của 6 tiêu bản: IgG, IgA, IgM, C3, C4 và C1q (lặp lại 1 lần nữa sao cho có 2 mảnh cắt/lam kính). + Để khô và tiến hành nhuộm các phương pháp nhuộm: H&E, PAS, Masson, MDHQ, Bạc Jones Methenamine,… + Xử lý bệnh phẩm sau cắt lạnh: Sau khi đã lấy đủ bệnh phẩm cắt lạnh, cố định phần bệnh phẩm còn lại sau cắt lạnh (để xử lý, cắt, nhuộm thường quy – đối chiếu với chẩn đoán cắt lạnh và nhuộm đặc biệt nếu cần). + Vệ sinh máy, dụng cụ. - Kết quả: Mảnh cắt mỏng, phẳng, không bị nhăn hay gấp. Lưu ý: Đối với kỹ thuật cắt lạnh: thao tác nhanh và cẩn thận, để lâu bệnh phẩm sẽ bị hoại tử dẫn đến khó hoặc không đánh giá được mảnh cắt sau nhuộm. 1.2.2. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang 1.2.2.1. Khái niệm và nguyên lý - Khái niệm: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang là một kỹ thuật hoá mô miễn dịch với sự với kết hợp giữa kỹ thuật mô bệnh học với kỹ thuật miễn dịch học, phương 11
pháp sử dụng kháng thể để tìm kháng nguyên trên mô dựa trên nguyên lý miễn dịch. Trong miễn dịch huỳnh quang, chất đánh dấu là các kháng thể được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) có đặc tính phát quang dưới kích thích của nguồn sáng là tia cực tím [27]. - Nguyên lý: Nguyên lý miễn dịch là sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó: + Kháng thể gắn đặc hiệu với protein hoặc kháng nguyên trên mảnh mô. + Kháng thể có thể gắn chất phát huỳnh quang mà không bị biến tính. + Khi được chiếu tia có bước sóng phù hợp chất huỳnh quang phát sáng. Cách xác định phức hợp miễn dịch bao gồm: phương pháp nhuộm MDHQ trực tiếp và MDHQ gián tiếp. Ở đây tôi chỉ tiến hành với phương pháp nhuộm MDHQ trực tiếp. Trong phương pháp nhuộm MDHQ trực tiếp, muốn phát hiện mỗi kháng nguyên lại cần có một kháng thể gắn chất phát huỳnh quang tương ứng. - Sự thành công của phương pháp nhuộm MDHQ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: + Sự bảo quản kháng thể và kháng nguyên (mô). + Đủ kháng thể để kết hợp. + Hệ thống kính hiển vi huỳnh quang chất lượng tốt. + Nhuộm cẩn thận và phương thức ủ đúng. 1.2.2.2. Các bước tiến hành - Chuẩn bị trang thiết bị, vật tư: + Thiết bị:  Tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8 ºC.  Kính hiển vi huỳnh quang NIKON E600. + Hoá chất: 12