Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận nghiên cứu: Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) bằng phương pháp HPLC. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập tại một số tỉnh ở Việt Nam. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG TRITERPEN GLYCOSID TỔNG SỐ TRONG RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG TRITERPEN GLYCOSID TỔNG SỐ TRONG RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: 1. TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG 2. TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH Hà Nội - 2020
LỜI CẢM ƠN Bản luận văn được hoàn thành tại Khoa hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phương và TS. Nguyễn Thị Thanh Bình. Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Phương và TS. Nguyễn Thị Thanh Bình, PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng những người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, luôn động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dược liệu, PGS.TS. Phương Thiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu) cùng toàn thể anh chị, bạn bè, cán bộ, nhân viên Khóa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân – người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Y-Dược đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt năm năm theo học tại trường. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Ánh
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà Hóa phân AOAC Chemists tích High performance liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography High performance liquid HPLC- Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography photodiode array PDA ghép nối detector mảng iod detetion R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối TLTK Tài liệu tham khảo
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là Bảng 1.1 4 jujubogenin trong Rau đắng biển Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là Bảng 1.2 5 pseudojujubogenin trong Rau đắng biển Bảng 1.3 Cấu trúc một số hợp chất cucurbitacin 6 Một số phương pháp định lượng triterpen glycosid trong Bảng 1.4 15 Rau đắng biển Bảng 2.1 Danh sách các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập 19 Bảng 3.1 Chương trình gradient 28 Bảng 3.2 Thời gian lưu tương đối của các bacosid 29 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống 30 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của píc Bảng 3.4 32 bacosid A3 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại 32 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 33 Hàm lượng tryterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid Bảng 3.7 34 A3) trong dược liệu Rau đắng biển thu hái tại Việt Nam
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Rau đắng biển 3 Hình 1.2 Cấu trúc của Luteolin và Apigenin 7 Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC phân tích Rau đắng biển 28 Hình 3.2 Vị trí các píc bacosid trong Rau đắng biển 29 Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp 31 So sánh phổ UV của bacosid A3 trong mẫu thử và mẫu Hình 3.4 31 chuẩn
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 2 1.1. Tổng quan về cây Rau đắng biển ........................................................... 2 1.1.1. Vị trí, phân loại ............................................................................. 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật.......................................................................... 2 1.1.3. Phân bố ........................................................................................ 3 1.1.4. Bộ phận dùng ................................................................................ 3 1.1.5. Thành phần hóa học ....................................................................... 3 1.1.6. Một số tác dụng dược lý ................................................................. 7 1.2. Tổng quan về phương pháp HPLC ....................................................... 10 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động .................................................................. 10 1.2.2. Cấu tạo HPLC ............................................................................. 10 1.3. Những nghiên cứu về định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển .......................................................................................... 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 19 2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị ........................................................... 22 2.2.1. Chất chuẩn .................................................................................. 22 2.2.2. Hóa chất ..................................................................................... 22 2.2.3. Thiết bị ....................................................................................... 22 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 23
2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ............................................................ 23 2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển ........................................................................................................... 23 2.3.3. Áp dụng trên một số mẫu dược liệu Rau đắng biển ......................... 25 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ................................................................................. 27 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích và quy trình xử lý mẫu .............................. 27 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ....................................................... 30 3.2.1. Tính thích hợp hệ thống ............................................................... 30 3.2.2. Tính chọn lọc của phương pháp .................................................... 30 3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn.................... 31 3.2.4. Độ lặp lại .................................................................................... 32 3.2.5. Độ đúng...................................................................................... 33 3.3. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển ........................................................ 34 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................. 36 4.1. Về thu thập mẫu dược liệu .................................................................. 36 4.2. Về xây dựng phương pháp định lượng ................................................. 36 4.3. Về kết quả định lượng triterpen glycosid tổng số trong các mẫu Rau đắng biển ......................................................................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là một loại thảo dược vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng [11, 13, 24, 26]. Ngày nay, ngoài việc sử dung rau đắng biển như một loại thức ăn, rau đắng biển được sử dụng như một vị thuốc trong các thang thuốc sắc, dịch ép tươi, tán bột sau phơi khô. Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam hiện nay đã có một số chế phẩm đông dược được sản xuất từ vị thuốc này như: Hoạt huyết bổ máu Đại Bắc, thông huyết Tuệ Linh, chế phẩm phối hợp Ginkgo Giloba 6000 mg và Brahmi 3000 mg, … Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy tác dụng nổi bật của rau đắng biển trên hệ thần kinh giúp cải thiện trí nhớ, tăng cường khả năng nhận thức, học hỏi là nhờ vào hoạt chất triterpen glycosid với 5 loại chính có trong rau đắng biển gồm: bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, bacopasid X và Bacopasaponin C [13, 21, 23, 26]. Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng triterpen glycosid trong rau đắng biển còn chưa được tiêu chuẩn hóa. Hơn nữa, trong dược điển Việt Nam V chưa đề cập đến dược liệu rau đắng biển cũng như các thành phần hóa học trong dược liệu này. Do đó, việc định lượng hàm lượng các triterpen glycosid trong rau đắng biển là rất cần thiết. Theo Dược điển Mỹ (USP 40), chất chuẩn bacosid A3 được sử dụng để xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng tổng các loại triterpen glycosid chính chiếm hàm lượng chủ yếu trong Rau đắng biển [41]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện công việc “Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu: - Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) bằng phương pháp HPLC. - Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập tại một số tỉnh ở Việt Nam. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Rau đắng biển 1.1.1. Vị trí, phân loại Vị trí phân loại của loài Bacopa monnieri trong hệ thống phân loại thực vật học: Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta); Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida); Bộ: Hoa Môi (Lamiales); Họ: Hoa Mõm Chó (Scrophulariaceae); Chi: Bacopa; Loài: Monnieri (L.); [45] Rau đắng biển có tên khoa học là Bacopa monnieri (L.) Pennell., thuộc họ Hoa mõm chó (Scrophulariaccae), chi Rau đắng biển (Bacopa), có tên khoa học đồng nghĩa khác là Herpestis monnieri (L.) Rothm. Ở Việt Nam, Rau đắng biển còn được gọi là rau Sam trắng, Sam trắng [1, 10]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống lâu năm, cao 10-20 cm. Thân nhẵn, phần gốc mọc bò, bén rễ ở những mấu, phần trên mọc đứng. Thân có vị đắng. Lá mọc đối, không cuống, hình trái xoan, mọng nước, dài 0,8-1,2 cm, rộng 3-5 mm, gốc thuôn, đầu tù, hai mặt nhẵn. Lá có màu xanh đậm ở trên mặt, xanh nhạt ở mặt dưới, một gân chính, gân phụ không rõ. Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá trên một cuống dài. Hoa không đều, lưỡng tính mẫu 5. Cuống hoa dài 2,6-5,6 cm, không lông, hai lá bắc con hình dải, dài 0,6 cm, ở đỉnh cuống hoa. Bao hoa: năm lá đài rời, không đều, lá đài sau to nhất, hình trứng, có năm gân chính, dài 0,8 cm, rộng 0,5 cm, hai lá đài trước hình trứng, mũi nhọn, 3 gân chính, dài 0,7 cm, rộng 0,4 cm, hai lá đài bên nhỏ nhất, hình dải, 1 gân, có lông ở bìa, dài 0,6 cm, rộng 0,1 cm. Năm lá đài không đều, cao 5-6 mm, năm cánh hoa có màu tím nhạt, dính nhau ở thành ống. Bốn nhị, bầu không lông. Quả nang hình trứng, nhẵn, có đài còn lại, hạt nhỏ, có góc cạnh. Hạt nhiều, rất nhỏ, mùa hoa tháng 4-9 [6, 8, 10]. 2
Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Rau đắng biển [42, 43] 1.1.3. Phân bố Chi Bacopa tương đối lớn, có khoảng 70 loài, phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; song tập trung nhiều ở khu vực Trung và Nam Mỹ. Ở Việt Nam chỉ có 2 loài. Loài Rau đắng biển được coi là cây liên nhiệt đới, đồng thời cũng có thể thấy vùng cận nhiệt đới. Ở châu Á, rau đắng biển phân bố rộng rãi từ vùng Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào đến các nước khác ở Đông Nam Á. Ở Việt Nam, Rau đắng biển phân bố ở khắp các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc và miền Nam. Cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, pha cát lẫn với các loại cỏ thấp ở bờ ruộng, bãi sông, bờ kênh mương,... Cây ra hoa quả nhiều năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Cây còn có khả năng mọc chồi khỏe từ kẽ lá, kể cả phần còn sót lại sau khi cắt. Do đó, Rau đắng biển cũng bị coi là loại cỏ dại ảnh hưởng tới cây trồng [10]. 1.1.4. Bộ phận dùng Dược liệu Rau đắng biển là phần trên mặt đất dùng tươi hoặc phơi khô của cây Rau đắng biển [8, 10]. 1.1.5. Thành phần hóa học Thành phần hóa học chính có tác dụng dược lý của Bacopa monnieri là các triterpen glycosid, sterol, sterol glycosid, các phenylethan glycosid, cucurbitacin, alkaloid và flavonoid [10, 15]. Trong đó thành phần quan trọng là các hợp chất thuộc nhóm saponin và các saponin trong Bacopa monnieri được xác định là các triterpen glycosid nhóm dammaran (bacosids). 3
1.1.5.1. Triterpen glycosid Thành phần hóa học chính có hoạt tính trong B.monnieri là các hợp chất triterpen glycosid có cấu trúc nhân dammaran (bacosids) với aglycon là jujubogenin và pseudojujubogenin [21]. ( Bảng 1.1 và 1.2). Cấu trúc của các saponin này khác nhau về phần đường. Những saponin quan trọng bao gồm: bacosid A1, bacosid A2, bacosid A3[24, 34, 35], các bacopasaponin A-D [18, 20, 30, 31], các bacosaponin E và F [31], bacopasaponin G [20], bacopasaponin I và II [18], bacopasaponin III-V [17, 18, 20], bacopasaponin VI-VIII [41], bacopasaid N1, bacopasid N2 và bacopasid X [21]. Trong các saponin này, các bacopasaponin A, E, F và bacopasid VIII là các jujubogenin bisdesmosid [29]. Hơn nữa, hai triterpen glycosid nhóm drammaran được acyl hóa là bacomosaponin A và bacomosaponin B cũng đã được phân lập bằng kỹ thuật quang phổ [15]. Trong những năm đầu nghiên cứu về B.monnieri, thành phần hóa học đầu tiên trong B.monnieri được xác định là 3-(α-L-arabinopyranosyl)-O-β-D-glucopyranosid- 10,20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-en thường được gọi là bacoside A đã được phân lập và được coi là thành phần có tác dụng lên hệ thần kinh giúp tăng cường trí nhớ. Sau đó, vào cùng thời điểm, người ta đã xác định bacosid B chỉ khác bacosid A ở góc quay quang học [15]. Tuy nhiên các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng bacosid A và bacosid B không phải là những hợp chất hóa học đơn lẻ, mà chúng được chứng minh là các hỗn hợp của triterpen glycosid. Nghiên cứu gần đây cho thấy bacosid A là hỗn hợp của bốn triglycosidic saponin: bacosid A3, bacosid II, 𝛼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-(β- D-glucopyranosyl-(1→3)- 𝛼-L-arabinofuranosyl] jujubogenin (còn gọi là bacopasid X) và bacopasaponin C [21] và bacosid B là một hỗn hợp của bacopasid N1, bacopasid N2, bacopasid IV và bacopasid V. Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin trong rau đắng biển [41] 4
Jujubogenin STT Tên chất R 1 Bacosid A3 β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-(𝛼-L-arabinofuranosyl (1→2))-O-(β-D-glucopyranosyl) 2 Bacopasid N1 β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl 3 Bacopasid IV β-D-glucopyranosyl-(1→3)- 𝛼-L-arabinofuranosyl 4 Bacopasid X 𝛼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-(β-D-glucopyranosyl- (Bacopasaponin (1→3)- 𝛼-L-arabinofuranosyl C isomer) Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là pseudojujubogenin trong rau đắng biển [41] Pseudojujubogenin STT Tên chất R 5 Bacopasaponin C β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-(𝛼-L-arabinofuranosyl- (1→2))-𝛼-L-arabinofuranosyl 6 Bacopasid N2 β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl 7 Bacopasid II 𝛼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- (1→3))-β-D-glucopyranosyl 8 Bacopasid V β-D-glucopyranosyl-(1→3)-𝛼-L-arabinofuranosyl 1.1.5.2. Cucurbitacin Phần trên mặt đất của B.monnieri sau khi được chiết bằng methanol 50%, cô đặc và để qua đêm. Lấy phần dịch chiết đi lọc và phân đoạn liên tiếp với Ethyl Acetat (EtOAc) và n-Butanol (n-BuOH). Chiết xuất EtOAc đã được phân tích bằng sắc ký 5
silicagel để thu được các cucurbitacin: cucurbitacin A-D, cucurbitacin E và ba phenylethanoid glycosid gồm: monnierasid I, III và plantiosid B [28]. Bảng 1.3: Cấu trúc một số hợp chất cucurbitacin [28] R=R2=H, R1=OH Bacobitacin A R=R1=H, R2=Ac Bacobitacin B R=B, R1=R2=H Bacobitacin C R=B, R1 = OH, R2 = H Bacobitacin D 1.1.5.3. Flavonoid Ngoài các thành phần đã được phân lập và xác định cấu trúc đã nêu trên, có nhiều nghiên cứu xác định được thành phần flavonoid trong rau đắng biển là luteolin và apigenin [14]. Một nghiên cứu được thực hiện bởi Anju Varshney và các cộng sự, tiến hành định lượng Luteolin trong các bộ phận khác nhau ở phần trên mặt đất của rau đắng biển thu hái ở các vùng của Ấn Độ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và thu được kết quả hàm lượng Luteolin tại thân của B. monnieri tại vùng Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/ 500g; trong khi hàm lượng Luteolin trong lá B. monnieri thu hái tại cùng Bhayander, Maharashtra là 0,01691 ± 0,0024 mg/ 500g [12]. Ngoài ra, một nghiên cứu khác cũng định lượng hàm lượng Luteolin và Apigenin ở các phần trên mặt đất trong dịch chiết Methanol (MeOH) của B. monnieri bằng sắc ký lỏng pha đảo lần lượt là 0,22% và 0,45% [11]. 6
Luteolin Apigenin Hình 1.2. Cấu trúc của Luteolin và Apigenin 1.1.5.4. Các thành phần khác: Ngoài các triterpen glycosid đã được phân lập và xác định cấu trúc, một số thành phần hóa học khác cũng được tìm thấy trong rau đắng biển. Thành phần đầu tiên được phân lập và xác định trong monnieri là alkaloid brahmi. Sau đó, các alkaloid tiếp theo cũng được xác định là nicotin, herpestin [16]. Tiếp theo, hàng loạt các báo cáo phân lập được các glycosid: asiaticosid và thanakunicid [19]. 1.1.6. Một số tác dụng dược lý Rau đắng biển là một loại thảo dược lâu năm được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền như một loại thuốc bổ thần kinh để cải thiện trí thông minh và trí nhớ, tăng cường chức năng não và giúp gia tăng tuổi thọ. Theo y thuật Ayurveda, một hệ thống y học được phát triển tại Ấn Độ cách đây hơn 3000 năm, Rau đắng biển đã được sử dụng lần đầu tiên để bảo vệ thần kinh chống lại chứng mấy trí nhớ. Trong suốt bốn thập kỉ qua, Rau đắng biển và các hợp chất được phân lập từ nó ngày càng thu hút rất nhiều các nhà nghiên cứu hóa sinh vì các tác dụng dược lý bảo vệ thần kinh đáng chú ý đã được xác định như: tác dụng chống lại chứng mất trí nhớ, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer; chống trầm cảm, lo âu; chống co giật và chống oxy hóa,... [29] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu về dược lý cũng chỉ ra rằng, B.monnieri mang nhiều tác dụng khác như tác dụng chống viêm, chống vi khuẩn Helicobacter Pylori, thuốc chống giun, chống ung thư, an thần và làm ổn định hoạt động của các tế bào mast,.. [8, 15]. 1.1.6.1. Tác dụng cải thiện trí nhớ và khả năng nhận thức, học hỏi. Những nghiên cứu trong dịch chiết cồn của các hợp chất được phân lập từ B.monnieri đã chứng minh tác dụng giúp tăng cường nhận thức và trí nhớ của nó trên 7
hệ thần kinh nhờ vào sự có mặt của bacosid A và bacosid B [15]. B.monnieri cũng được xác định là có hoạt tính kháng cholinesterase giúp tăng việc tiếp nhận thông tin và khả năng học tập của chuột bị gây mất trí nhớ bởi scopalamin, natri nitrit và BN52021 (yếu tố kích hoạt tiểu cầu, PAF,chất đối kháng thụ thể) [29]. Một nghiên cứu được thực hiện bởi Uabundit và cộng sự trên mô hình động vật mắc bệnh Alzeimer do dùng chất AF64A ( một chất độc thần kinh đặc hiệu cho tế bào thần kinh) cho thấy, chiết xuất của B.monnieri có thể giảm thiểu sự suy giảm trí nhớ và thoái hóa các tế bào thần kinh ở đồi hải mã. Chiết xuất B.monnieri giúp cải thiện thời gian thoát khỏi ra trong mô hình thử nghiệm mê cung nước Morris và giảm nhẹ sự giảm của các tế bào thần kinh và mật độ của nó. Những phát hiện này cho thấy rằng B.monnieri giúp tăng cường nhận thức và bảo vệ thần kinh chống lại bệnh Alzheimer [27]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của Viện Dược Liệu ở Việt Nam cũng tham gia nghiên cứu đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập và trí nhớ trong cao chiết cồn ở rau đắng biển trên mô hình chuột nhắt trắng bị suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ, một tròn những mô hình mất trí nhớ giống bệnh Alzheimer [5]. Bên cạnh những nghiên cứu trên mô hình động vật của Rau đắng biển, cũng có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng dược lý trên hệ thần kinh người. Một nghiên cứu được tiến hành trên 76 người có độ tuổi từ 40 đến 65 của Steven Roodentrys đánh giá chức năng của bộ nhớ và mức độ lo lắng. Kết quả của thử nghiệm đã chỉ ra rằng, rau đắng biển có ảnh hưởng đáng kể trong việc ghi nhớ các thông tin mới [33]. Một nghiên cứu khác của C.Stough và cộng sự cũng đưa ra kết quả rằng cao chiết Rau đắng biển với liều sử dụng là 300mg/ngày giúp cải thiện quá trình xử lý thông tin, học tập bằng lời nói và quá trình ghi nhớ ở người [32]. 1.1.6.2. Tác dụng đối với những rối loạn tâm thần Từ thời xa xưa rau đắng biển đã được biết đến như một loại thảo dược giúp điều trị các rối loạn tâm thần và có thể là một thuốc hướng thần tiềm năng. Với sự phát triển của khoa học hiện đại ngày nay, rất nhiều bằng chứng đã được đưa ra để chứng minh điều này. Nghiên cứu của Yun Zhon và cộng sự đã chỉ ra được tác dụng chống trầm cảm và lo lắng của cao chiết rau đắng biển và một số hoạt chất của nó bao gồm: bacosid I,II, bacopasaponin C [39]. Một nghiên cứu khác gần đây của Manavi và cộng sự (2010) cũng chứng minh rằng với liều dùng 80mg/kg của rau đắng biển có tác dụng chống lại rối loạn tâm thần bao gồm cả trầm cảm và lo lắng [22]. 8
Cao chiết Rau đắng biển (chứa 25% bacosid A) có tác dụng an thần tương đương benzodiazepin và lorazepin. Hoạt tính này tùy thuộc vào liều lượng sử dụng và đặc biệt là không gây phản ứng phụ như tạo sự lãng quên, nhầm lẫn như lorazepam và còn giúp cải thiện trí nhớ [13]. Ngoài ra, Rau đắng biển cũng được biết đến với tác dụng có lợi đối với bệnh động kinh. Gần đây, một nghiên cứu đã khẳng định về vai trò kiểm soát cơn động kinh thông qua việc giảm thụ thể GABA ở vùng thể vân và vùng hải mã trong não chuột cống trắng của loài cây này và hoạt chất bacosid A được phân lập từ nó [26]. 1.1.6.3. Tác dụng chống oxy hóa Rau đắng biển đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa dựa trên thử nghiệm não chuột thông qua việc thay đổi nồng độ của các enzym superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathion peroxidase (GPX). Khi so sánh với hoạt tính chống oxy hóa của deprenyl , rau đắng biển tác dụng vào mọi khu vực trong não bộ, trong khi đó deprenyl chỉ giới hạn tại khu vực vỏ não và khu vực trán [41]. Rau đắng biển được coi như một loại thảo dược bảo vệ não chống lại các tổn thương oxy hóa. Một nghiên cứu khác ở Việt Nam vào năm 2009 của Nguyễn Thị Thu Hương và các cộng sự về tác dụng chống oxy hóa invitro của Rau đắng biển tại trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh của 5 phân đoạn chiết từ rau đắng biển là cao toàn phần (cao RĐB); cao chiết bằng ethanol (cao EtOH); cao chiết bằng methanol (cao MeOH); saponin toàn phần chiết từ dược liệu (Sdl) và saponin toàn phần chiết từ rau đắng biển (Sc). Các kết quả chỉ ra rằng, mẫu Sdl và Sc có hoạt tính dập tắt gốc tự do tương đương nhau nhờ tác dụng ức chế hình thành MDA tỷ lệ thuận với nồng độ mẫu. Tuy nhiên Sc có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn Sdl. Mẫu cao RĐB, cao EtOH và cao MeOH cũng có hoạt tính dập tắt gốc tự do tương đương nhau. Nhìn chung, cao MeOH có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn cao RĐB và cao EtOH, còn cao RĐB và cao EtOH có hoạt tính chống oxy hóa xấp xỉ nhau [7]. 1.1.6.4. Các tác dụng khác Ngoài những tác dụng trên, rau đắng biển cũng được chứng minh mang các tác dụng khác như: Tác dụng trên huyết áp, chống ung thư, trên hô hấp và huyết áp,.. Cao khô chiết cồn của cây rau đắng biển có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư Walker carcinosarcoma 256 khi tiêm bắp cho chuột cống trắng. Ancaloid bradmin chiết từ cây Rau đắng biển với liều 0,5 mg/kg ở mèo có tác dụng làm hạ huyết áp. 9
Tuy nhiên, liều nhỏ hơn lại gây tăng huyết áp nhẹ do co mạch và kích thích cơ tim [8]. 1.2. Tổng quan về phương pháp HPLC 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và chuyển qua bộ phận xử lý số liệu. Thời gian chất phân tích được rửa giải được ghi lại nhờ detector gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [3, 4, 23]. Pha tĩnh Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường là các hạt hình cầu có đường kính 1,5 – 10 μm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo. - Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2,...), pha động không phân cực. - Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8,...), pha động phân cực. Pha động Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi ít phân cực như hexan, isopropylether,... ngược lại trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril,... 1.2.2. Cấu tạo HPLC Nguyên tắc cấu tạo của một bộ máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau [2, 3, 4, 23]. - Hệ thống cấp pha động; - Bơm sắc ký lỏng; 10
- Bộ phận tiêm mẫu; - Cột sắc ký; - Đầu dò detector (nhận tín hiệu); - Bộ phận thu nhận và xử lý số liệu. Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [15] 1.2.2.1. Hệ thống cấp pha động Tất cả các dung môi trong pha động dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích nhằm mục đích tránh làm hỏng sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra píc tạp trong quá trình phân tích. Pha động trước khi đưa vào bình chứa pha động cần được lọc qua màng lọc 0,45μm và loại bỏ khí hòa tan trong pha động (ví dụ: N2, O2) bằng cách: rung siêu âm, sục khí trơ Heli có khả năng hòa tan thấp trong pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra: 11
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của píc thay đổi - Trong trường hợp bọt quá nhiêu, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động. Trong bất kì trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai. 1.2.2.2. Bơm sắc ký lỏng Hệ thống bơm sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn luôn chảy với một lưu lượng không đổi. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar (407atm), tốc độ dòng từ 0,1-9,999 ml/phút. Hệ thống được điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp hai chế độ vận hành của pha động bao gồm: - Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký - Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại dung môi được đặt trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình chạy sắc ký theo chương trình đã định trước (chương trình dung môi) nhờ bộ trộn. Tốc độ dòng pha động có thể thay đổi theo áp suất của bơm. 1.2.2.3. Bộ phận tiêm mẫu Mẫu được tiêm thẳng vào pha động ở ngay đầu cột với áp suất cao nhờ sự điều chỉnh dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu cho phép thể tích tiêm từ 5 μL - 100μL. Có hai cách tiêm mẫu vào cột là tiêm mẫu bắng tay hoặc tiêm mẫu tự động. Khi tiêm bằng tay có thể gây sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ. 1.2.2.4. Cột sắc ký Một máy HPLC bình thường có hai cột : cột phân tích và cột bảo vệ - Cột phân tích Hiện nay, cột pha tĩnh thường được làm bằng thép không gỉ, ngoài ra còn có cột bằng thủy tinh hoặc chất dẻo. Chiều dài cột khoảng 10-30 cm, đường kính trong cột 1-10 mm, hạt nhồi cột cỡ 5-10 μm,.. Ngoài ra còn một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt. Lò cột giúp đảm bảo nhiệt độ ổn định cho cột. Chất nhồi cột: đường kính 1,8-5 μm có thể dùng cột ngắn 3-10 cm và nhỏ (đường kính trong 1 – 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. Chất nhồi cột tùy 12