Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ cây thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (thunb.) trevis.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

42
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa theo 2 mục tiêu sau: Đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE và khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa; Đánh giá được tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ cây thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (thunb.) trevis.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MÔ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Hà Nội – 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MÔ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: 1. ThS. Đặng Kim Thu 2. ThS. Bùi Sơn Nhật Hà Nội – 2020
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới hai giảng viên hướng dẫn là ThS. Đặng Kim Thu và Th.S Bùi Sơn Nhật - giảng viên Bộ môn Dược lý và Dược lâm sàng, Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra những lời khuyên hữu ích, luôn lắng nghe, động viên và dẫn dắt tôi từng bước chân trên con đường thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Bùi Thanh Tùng và các thầy cô thuộc bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã chia sẻ những bài học kinh nghiệm quý báu, nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới DS. Nguyễn Thị Thu Hoài – Học viên cao học khóa 22, đại học Dược Hà Nội đã cùng ở bên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới các thầy cô của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, quan tâm và truyền dạy cho tôi những kiến thức quí báu trong suốt 5 năm học tập tại khoa cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được thực hiện trọn vẹn đề tài này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và sát cánh bên tôi vượt qua những khó khăn trong quãng thời gian còn ngồi trên ghế nhà trường. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A Độ hấp thụ (Absorbance) A Amyloid beta ACh Acetylcholin AChE Enzym Acetylcholinesterase ACTI Acetylthiocholin iodid APP Protein tiền thân amyloid (Amyloid Precursor Protein) DL-30 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cân nặng DL-60 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 60 mg/kg cân nặng FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) HFD Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet) Hup A Huperzin A IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) MDA Malondialdehyd NMDA Thụ thể N-methyl-D-aspartat LD50 Liều dùng gây chết 50% số động vật thử nghiệm OBX Chuột mất vùng khứu giác (Olfactory bulbectomized) SAM Chuột tăng tốc lão hóa SAMP Chuột tăng tốc lão hóa nhạy cảm SE Sai số chuẩn (Standard errror) UV-Vis Quang phổ tử ngoại khả kiến
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2.1. Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa .................................... 8 Bảng 2.4.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng ..................................................... 28 Bảng 3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn donepezil. .............................. 29 Bảng 3.1.2. Giá trị IC50 của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn quercetin ..................................................................................................... 30
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.2.1. Cấu trúc hóa học của Hup A ................................................................. 8 Hình 2.1.1. Cây Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis ............... 17 Hình 2.1.2. Phương pháp chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm .............................................................................................................................. 18 Hình 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ................................................................. 20 Hình 2.4.1. Phản ứng giữa các chất trong hỗn hợp phản ứng Ellman ..................... 21 Hình 2.4.2. Sơ đồ triển khai mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo .. 24 Hình 3.2.1. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến tỷ lệ chuyển tiếp giữa các cánh ...................................................................................... 31 Hình 3.2.2. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến thời gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập có bến đỗ ................................................................ 32 Hình 3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tới thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ ở bài tập không có bến đỗ ................................ 34 Hình 3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ AChE trên thể đồng nhất não chuột .................................................................. 35 Hình 3.2.5. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não ......................................................... 36
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1 - TỔNG QUAN ..................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về bệnh ................................................................................... 3 1.1.1. Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ ................................................................ 3 1.1.2. Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh .................................................. 4 1.1.3. Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ ......................................................... 6 1.2. Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa .................................................. 7 1.2.1. Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 7 1.2.2. Phân bố ...................................................................................................... 7 1.2.3. Thành phần hóa học ................................................................................... 7 1.2.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................... 9 1.2.5. Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng răng cưa...... .................................................................................................................. 9 1.3. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ .................... 11 1.3.1. Các mô hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm................. 11 1.3.2. Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo . 13 1.3.3. Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE .............................. 14 1.3.4. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa ........................... 15 Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 17 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ............................................................................... 17 2.1.2. Mẫu nghiên cứu ....................................................................................... 17 2.2. Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 18 2.2.1. Động vật thí nghiệm................................................................................. 18 1.2.2. Hóa chất, dung môi .................................................................................. 18
1.2.3. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................... 19 2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 19 2.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20 2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa in vitro . 20 2.4.2. Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin. ........... 23 2.5. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 28 Chương 3 – KẾT QUẢ ........................................................................................ 29 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa .................................. 29 3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro ........................... 29 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro .......................... 30 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin ...... 31 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê lộ Y..........................................................................................................................31 3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê lộ nước Morris..................................................................................................... 32 3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ AChE trong não .................................................................................................. 34 3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não ................................................................. 36 Chương 4 – BÀN LUẬN...................................................................................... 38 4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AchE và chống oxy hóa in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa .................................. 38 4.1.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro ...................... 38 4.1.2. Về kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro ................................ 39 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa . 40 4.2.1. Về kết quả của thử nghiệm hành vi .......................................................... 40 4.2.2. Về kết quả định lượng các marker sinh học .............................................. 42
Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
MỞ ĐẦU Xã hội ngày càng phát triển, những áp lực của cuộc sống cũng ngày càng tăng cao. Con người bị ảnh hưởng bởi môi trường và xuất hiện những vấn đề về sức khỏe. Ngoài những nhóm bệnh phổ biến như bệnh tim mạch và ung thư, sa sút trí nhớ cũng là một bệnh lý mà nhiều người mắc phải. Sa sút trí nhớ là một nhóm các rối loạn đặc trưng bởi sự suy giảm trí nhớ và nhận thức, có ảnh hưởng đến các hoạt động sống hàng ngày và hoạt động xã hội của người bệnh. Trên thế giới, số lượng người mắc sa sút trí nhớ ngày càng tăng cao với khoảng 50 triệu người mắc và có gần 10 triệu ca mắc mới mỗi năm [47]. Sa sút trí nhớ là căn bệnh có tác động rất lớn đến nền kinh tế. Chi phí dành cho chăm sóc và điều trị cho bệnh nhân sa sút trí nhớ hàng năm trên thế giới ước tính khoảng 800 tỷ USD (tương đương 1% GDP toàn cầu) và sẽ đạt tới 2000 tỷ USD vào năm 2030 [47]. Sa sút trí nhớ là bệnh lý phổ biến thường gặp ở người cao tuổi. Bệnh diễn biến từ từ tăng dần, suy giảm dần khả năng nhận thức, trí tuệ, dẫn đến mất dần khả năng sinh hoạt độc lập và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm trùng, tiết niệu. Mặc dù sa sút trí nhớ có tác động rất lớn đến sức khỏe người cao tuổi và đang có xu hướng ngày càng gia tăng nhưng việc điều trị lại gặp nhiều khó khăn do hiểu biết về bệnh còn hạn chế và việc lựa chọn thuốc điều trị bị giới hạn. Những thuốc dùng điều trị sa sút trí nhớ gồm 2 nhóm thuốc ức chế cholinesterase và thuốc đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartat (NMDA). Các thuốc kể trên cho thấy tác dụng kiểm soát triệu chứng tốt nhưng không làm thay đổi diễn tiến bệnh. Ngoài ra, giá thành tương đối cao và các tác dụng phụ không mong muốn là nhược điểm của các thuốc này. Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu tìm ra loại thuốc hiệu quả và an toàn hơn trong điều trị sa sút trí nhớ và Alzheimer là rất cần thiết. Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) là một dược liệu đã được dùng để điều trị bệnh sa sút trí nhớ tại Trung Quốc. Trong dược liệu, Huperzin A (Hup A) là hợp chất alcaloid nổi bật có tác dụng cải thiện trí nhớ [50,61]. Tuy nhiên, ở nước ta mới chỉ có một số nghiên cứu dược lý về cao chiết cồn của Thạch tùng răng cưa trong khi chưa có nghiên cứu nào thực hiện trên đối tượng nghiên cứu là cao chiết alcaloid. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa theo 2 mục tiêu sau: 1
1. Đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE và khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. 2. Đánh giá được tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa. 2
Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh 1.1.1. Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ Bệnh sa sút trí nhớ được định nghĩa bởi Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1992 như sau: Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh của não, có tính chất mạn tính và tiến triển, có sự xáo trộn nhiều chức năng của não liên quan đến trí nhớ, suy nghĩ, định hướng, học tập, ngôn ngữ và phán đoán. Song, ý thức không bị suy giảm. Sự suy giảm trong kiểm soát cảm xúc, hành vi xã hội hoặc động lực thường đi kèm, đôi khi xuất hiện trước sự suy giảm chức năng nhận thức. Hội chứng xảy ra trong bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não và trong các điều kiện nguyên phát hoặc thứ phát khác ảnh hưởng đến não [66]. Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh lý phổ biến ở người cao tuổi. Mặc dù bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến người già nhưng không phải là một phần bình thường của quá trình lão hóa. Đa số các bệnh nhân rối loạn chức năng nhận thức đều do tổn thương không hồi phục các neuron thần kinh hai bên bán cầu (đặc biệt ở vùng vỏ não phối hợp) và/hoặc các cấu trúc dưới vỏ. Bệnh diễn biến từ từ tăng dần, suy giảm dần khả năng nhận thức, trí tuệ, cuối cùng mất hết khả năng sinh hoạt độc lập, phải lệ thuộc hoàn toàn vào người khác và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm trùng, tiết niệu [1]. Theo báo cáo của hiệp hội Alzhiemer năm 2018, trên thế giới có khoảng 50 triệu người mắc sa sút trí nhớ (chiếm khoảng 5% tổng số người trên 60 tuổi của thế giới). Ước tính cứ mỗi 3 giây sẽ có thêm 1 người mắc sa sút trí nhớ và số người mắc bệnh dự kiến tăng lên đến 152 triệu người vào năm 2050 [47]. Trong đó, số ca mắc mới ở châu Á chiếm gần 50% số ca trên thế giới và tập trung chủ yếu ở các nước thu thập thấp – trung bình. Nguy cơ mắc sa sút trí nhớ tăng theo tuổi. Tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ của một người tăng gấp đôi sau mỗi 6,3 năm [49]. Việt Nam có xu hướng già hóa dân số nhanh. Số người cao tuổi (trên 65 tuổi) chiếm hơn 10% tổng dân số [10]. Tuy nhiên, số người mắc sa sút trí nhớ trong nước chưa được đánh giá trên nghiên cứu quy mô lớn. Một số nghiên cứu được thực hiện với quy mô nhỏ tại địa phương từ năm 2009 – 2015 ước tính tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ chiếm khoảng 4,5 – 5% tổng số người cao tuổi (trên 60 tuổi) [4,9,12]. 3
1.1.2. Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh Sa sút trí nhớ bao gồm nhiều thể bệnh khác nhau. Sa sút trí nhớ trong bệnh Alzheimer và trong bệnh mạch máu là hai thể bệnh thường gặp nhất: 1.1.2.1. Sa sút trí nhớ trong bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa não nguyên phát. Sự tích lũy của các mảng bám amyloid  (A) ở ngoại bào và một dạng bất thường của protein tau ở trong tế bào thần kinh là hai trong nhiều thay đổi ở não của bệnh nhân mắc Alzheimer. Nguyên nhân gây bệnh và cơ chế bệnh sinh chưa được làm sáng tỏ do sự phức tạp của các yếu tố gây bệnh. Nhiều giả thuyết được hình thành để giải thích về nguyên nhân gây bệnh cũng như cơ chế bệnh sinh, ví dụ như giả thuyết về amyloid  (A), protein Tau, cholinergic,...  Giả thuyết về cholinergic Trong não, các tế bào thần kinh hệ cholinergic có mặt nhiều ở vùng vỏ não và đồi hải mãi, chịu trách nghiệm về trí nhớ và học tập. Acetylcholin là chất dẫn truyền thần kinh quan trọng của hệ cholinergic, có vai trò hoạt hóa thụ thể nicotinic và muscarinic. Giả thuyết cholinergic là giả thuyết được đưa ra bởi hai nhà khoa học Davies và Maloney vào năm 1976 [22]. Giả thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh Alzheimer có thể do giảm số lượng acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền thần kinh. Giả thuyết là cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển thuốc hướng tăng cường hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin.  Giả thuyết về amyloid  (A ) và protein tau Hardy John và cộng sự đã đưa ra giả thuyết về A để giải thích cho cơ chế bệnh Alzheimer năm 1991 [31]. Những A là kết quả của quá trình biến đổi bất thường của APP – một protein xuyên màng chưa rõ chức năng cụ thể. APP là protein nằm trong màng, được phân cắt bởi 3 loại enzym -, - và -secretase. Một trong những sản phẩm của quá trình phân cắt APP là một loại protein không tan tự kết tụ (A 40 và A 42 ) từ đoạn cắt --. Dưới tác động của Apolipoprotein E (APOE) - protein vận chuyển giúp phân bố cholesterol trong mô não, những peptid này kết tụ với nhau hình thành các mảng amyloid. Những mảng amyloid gây suy giảm trí nhớ và nhận thức nhờ can thiệp vào sự giao tiếp của các nơ-ron tại synap. Các A kích 4
thích quá trình phosphoryl hóa protein tau và phát triển các đám rối tơ thần kinh NFT. Protein Tau là thành phần quan trọng của tế bào thần kinh có vai trò cố định và ổn định cấu trúc của vi ống ở sợi trục. Trong Alzheimer, protein tau bị phosphoryl hóa, tách ra và tích lũy thành các đám rối tơ thần kinh NFT, ngăn sự di chuyển của dưỡng chất và các phân tử thiết yếu bên trong tế bào, gây chết tế bào thần kinh. Sự tích lũy A góp phần khởi động quá trình phosphoryl hóa protein tau. Ngược lại, một nghiên cứu khác cho thấy protein tau độc có thể tăng cường sản xuất A [33]. Sự hiện diện của A và tau độc kích hoạt các tế bào miễn dịch ở não (tế bào thần kinh đệm). Các tế bào này có nhiệm vụ loại bỏ các protein độc, song cũng làm chết tế bào thần kinh. Viêm mạn tính được cho là xảy ra khi các tế bào thần kinh đệm không còn đảm nhận được nhiệm vụ của chúng. Khi viêm xảy ra, các yếu tố miễn dịch được kích hoạt kéo theo sự hình thành các gốc tự do phá hủy màng tế bào. Teo não là kết quả do chết các tế bào thần kinh. Ngoài ra, A và tau độc cũng làm giảm khả năng sử dụng glucose ở não gây suy yếu các chức năng bình thường [15].  Giả thuyết về Glutamat Glutamat là chất dẫn truyền thần kinh kích thích nhanh ở não đóng vai trò quan trọng trong học tập, trí nhớ và vận động. Glutamat hoạt hóa ba loại thụ thể chính là Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoazolepropionic acid (AMPA), N- methyl-D-aspartat (NMDA) và thụ thể hướng chuyển hóa. Trong đó, thụ thể NMDA cho phép ion Na+ và Ca2+ đi vào tế bào. Quá trình exitotoxicity xảy ra khi kích thích quá mức các thụ thể NMDA bởi glutamat hoặc các acid amin có cấu trúc tương tự, làm nồng độ các ion Ca2+ trong tế bào tăng cao, gây tổn thương và chết tế bào [24]. 1.1.2.2. Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu là thể bệnh phổ biến đứng thứ hai sau bệnh Alzheimer, chiếm 10 – 20% các trường hợp mắc bệnh. Sa sút trí nhớ do nguyên nhân mạch máu làm giảm lượng máu tới não, gây tổn thương tế bào thần kinh và ít hồi phục. Biểu hiện của bệnh thường đột ngột, nhanh (nếu bị tai biến mạch máu mới) hoặc tiến triển theo từng nấc (trong trường hợp tái phát tai biến nhiều lần) [57]. 1.1.2.3. Các thể sa sút trí nhớ khác Sa sút trí nhớ còn do các nguyên nhân hiếm gặp khác gây ra, có thể kể đến như sa sút trí nhớ thể Lewy, sa sút trí nhớ thể thái dương, sa sút trí nhớ trong bệnh Parkinson, Huntington, Creutzfeldt-Jakob (CJD), sa sút trí nhớ trong bệnh suy giảm 5
miễn dịch ở người (ví dụ HIV), các bệnh chuyển hóa và nội tiết (ví dụ suy giáp, lupus ban đỏ hệ thống, tăng calci huyết, thiếu vitamin B12) [66]. 1.1.3. Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ Hiện nay chưa có thuốc nào có thể làm chậm hoặc dừng quá trình diễn tiến của bệnh sa sút trí nhớ. Tổ chức FDA đã chấp nhận 6 thuốc trong điều trị sa sút trí nhớ bao gồm: tacrin, rivastigmin, galantamin, donepezil, memantin và memantin phối hợp donepezil [15]. 1.1.3.1. Nhóm thuốc ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE) Giả thuyết cholinergic được lấy làm trung tâm để phát triển các thuốc. Giả thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh Alzheimer có thể do giảm số lượng acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền thần kinh [17]. Nhóm thuốc có tác dụng ức chế AChE có phục hồi, tăng thời gian tồn tại các chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin từ đó cải thiện trí nhớ và nhận thức. Nhóm ức chế AChE gồm 4 thuốc đã được tổ chức FDA cấp phép sử dụng (Tacrin, Donepezil, Rivastigmin và Galantamin). Tacrin ức chế không cạnh tranh với enzym acetylcholinesterase nhưng gây độc cho gan nên hiện nay hiếm khi được sử dụng [64]. Các thuốc thế hệ sau (Donepezil, Rivastigmin và Galantamin) được sử dụng để thay thế cho Tacrin. Ngoài khả năng ức chế AChE, Rivastigmin có thể ức chế cả BuChE, trong khi galantamin có tác dụng trong việc điều biến các thụ thể nicotinic. Cả hai được sử dụng để điều trị Alzheimer mức độ nhẹ - trung bình. Donepezil chỉ ức chế chọn lọc AChE nên ít có độc tính ngoại biên hơn, được sử dụng để điều trị trong cả trường hợp nặng. Các tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hóa (mệt mỏi, buồn nôn và tiêu chảy), hệ thần kinh (lo lắng, khó chịu) và hệ tim mạch (nhịp tim chậm) [41]. 1.1.3.2. Nhóm thuốc ức chế thụ thể NMDA Thuốc duy nhất trong nhóm này được tổ chức FDA phê duyệt là Memantin. Memantin là chất ức chế thụ thể NMDA không cạnh tranh, có tác dụng bảo vệ thần kinh, ngăn cản việc mất tế bào thần kinh. Memantin dung nạp tốt hơn vào cơ thể [40]. Tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hóa (buồn nôn, tiêu chảy hoặc táo bón) và hệ thần kinh (lú lẫn và hưng phấn) [41]. Memantin phối hợp donepezil cho thấy sự cải thiện lớn về chức năng nhận thức và ghi nhớ ở bệnh nhân sa sút trí nhớ [20]. 6
Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất chống oxy hóa như vitamin E, vitamin C, các dược liệu (bạch quả, đinh lăng,...), thuốc giảm đau không steroid để hỗ trợ điều trị sa sút trí nhớ. 1.2. Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa 1.2.1. Đặc điểm thực vật Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis. hay còn được biết đến là Lycopodium serratum thuộc họ Thông đất (Lycopodiaceae). Tên khác là Thạch tùng răng hoặc Chân sói. Mô tả Cây thân thảo, thường mọc thành đám nhỏ trên đất hay trên gốc cây có nhiều rêu trong rừng rậm thường xanh, trên đất ẩm có tầng dày và nhiều mùn, ở độ cao 300 – 1800m. Thân đứng cao 15 – 40 cm, đơn hay lưỡng thân 1 – 2 lần, đường kính khoảng 2 mm, hình trụ. Lá hình bầu dục – mũi mác, dài 15mm, rộng 3mm, tương đối mỏng, gân giữa rõ, mép có răng. Túi bao tử ở nách nhánh lá giống lá thường; túi bào tử hình thận, màu vàng tươi [5,8,11]. 1.2.2. Phân bố Cây thường tìm thấy ở những nước nhiệt đới châu Á, Trung Quốc, Úc và vùng Trung Mỹ. Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa phân bố rải rác ở các tỉnh vùng trung du và vùng núi cao ở Tây Bắc, miền Trung và Tây Nguyên [5,8,11]. 1.2.3. Thành phần hóa học Thạch tùng răng cưa có thành phần chính là alcaloid thuộc Lycopodium alcaloid, được phân thành 4 nhóm theo cấu trúc bao gồm Lycodin alcaloid, Lycopodin alcaloid, Fawcettimin alcaloid và dạng hỗn hợp [35]. Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa được liệt kê trong bảng 1.2.1. Trong đó, Huperzin A (Hup A) được coi là thành phẩn hóa học nổi bật được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Theo tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự (2015), hàm lượng Hup A trong lá Thạch tùng răng cưa ở Đà Lạt vào mùa thu và mùa xuân lần lượt là 75,4 và 92,5 (g.g-1 mẫu khô) [13]. Theo tác giả Takuya Ohba và cộng sự 7
(2015), Hup A là alcaloid chính trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa với hàm lượng đạt 0,5  0,003% [45]. Hình 1.2.1 Cấu trúc hóa học của Hup A Ngoài ra, Thạch tùng răng cưa còn chứa saponin, glycosid, flavonoid, tanin, đường khử, acid amin, polysaccharid, steroid và carotenoid [5]. Bảng 1.2.1 Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa Các alcaloid Phân nhóm Tên hợp chất Clavolonin, serratidin, 4α-hydroxyserratidin, 4α,6α- dihydroxyserratidin, 6α-hydroxyserratidin, lycoposerramin K, Huperzin E,2-chlorohuperzin E, noxid huperzin E, Huperzin F, N-oxid huperzin F, Huperzin G, 12-hydroxyhuperzin, Huperzin Nhóm O, 12-deoxyhuperzin O, Lycodolin, 12-epilycodolin N-oxid, lycopodin 4α,6α-dihydroxylycopodin, 6α-hydroxylycopodin, 7- hydroxylycopodin, lycoposseramin G, lycoposseramin L, lycoposseramin M, lycoposseramin N, Serratezomin C, Lucidiolin, lycoposerramin F lycoposerramin H lycoposerramin I, lycoposerramin J, lycoposerramin O. Huperzin A, NN-Dimethylhuperzin A, 6α-Hydroxyhuperzin A, 6β-Hydroxyhuperzin A, 6β-Hydeoxyhuperzin A, Phlegmariurin Nhóm M, Huperzin U, Huperzin C, Huperzin D, Huperzinin, Isofordin, lycodin Huperzin B, N-Methylhuperzin B, De-N-methyl-βobscurin. Huperzin P, Huperzin Q, N‐oxyhuperzin Q, Lycoflexin, lycothunin, 11α-hydroxyfawcettidin, 2α,11α- Nhóm dihydroxyfawcettidin, 8α,11α-dihydroxyfawcettidin, macleanin, fawcettimin 11α-hydroxyphlegmariurin B, 7-hyroperoxyphlegmariurin B, 8
Neohuperzinin, Serratanidin, Serratezomin B, Serratinin, Serratin, 8-deoxyserratinin, 8-deoxy-13-dehydroserratinin, Huperserratinin. Nhóm các Huperzin J, Huperzin K, Huperzin L, Huperzin V, Huperzinin B, alcaloid Phlegmariurin N, Serratanin A, Serratanin B khác 1.2.4. Tác dụng dược lý Thạch tùng răng cưa được biết đến là một dược liệu quý để chữa bệnh sa sút trí nhớ. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, cao chiết của Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế chọn lọc enzym AChE và cải thiện trí nhớ trên động vật thử nghiệm [3,6,45]. Trong cây, Hup A là thành phần hóa học có tác dụng dược lý nổi trội, có khả năng ức chế AChE, bảo vệ tế bào thần kinh và ty thể thông qua thay đổi chuyển hóa của APP và giảm stress oxy hóa đồng thời ức chế biểu hiện của yếu tố gây viêm [26,62]. Cao chiết của Thạch tùng răng cưa còn cho thấy có tác dụng tiềm năng chống khối u trên các tế bào ung thư bạch cầu HL-60 [30] và ức chế sự di căn của tế bào u thần kinh đệm C6 (glicoma) [46]. Các tác dụng khác của loài cây này như kháng khuẩn [39] và chữa lành vết thương [18] cũng đã được chứng minh. Bên cạnh đó, tác dụng chống nhược cơ, giải độc organophosphat cũng được ghi nhận ở Hup A [28,38]. 1.2.5. Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng răng cưa 1.2.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới Ở Nhật Bản, tác giả Takuya Ohba và cộng sự đã xác định hàm lượng Hup A trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa là 0,5  0,003%. Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế chọn lọc AChE với IC50 là 5,96 µg/ml và không ức chế BuChE ở cùng dải nồng độ ức chế AChE. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở chuột nhắt trắng thông qua các thử nghiệm hành vi (thử nghiệm mê lộ chữ Y và mê lộ nước Morris) [45]. Hup A là hợp chất được phân lập từ cao chiết của Thạch tùng răng cưa lần đầu tiên vào năm 1986 bởi tác giả Liu JS và cộng sự [37]. Năm 1996, Cheng Dong Hang và cộng sự cho thấy Hup A là một chất ức chế chọn lọc AChE theo cơ chế đảo 9
ngược với IC50 là 82 nM và tỷ lệ ức chế BuChE/AChE là 884,57. Đồng thời, dùng Hup A liều 0,1 – 0,4 mg/kg giúp cải thiện trí nhớ của chuột gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin [21]. Năm 2011, trong thử nghiệm lâm sàng pha 2, Hup A liều 400 g thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở bệnh nhân mắc sa sút trí nhớ mức độ nhẹ đến trung bình [50]. 1.2.5.2. Các tác dụng lý được báo cáo tại Việt Nam Năm 2013, tác giả Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự báo cáo kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin. Kết quả cho thấy cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa liều 0,533 g/kg có tác dụng tăng cường trí nhớ trên chuột gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin và LD50 của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa là 5,33g/kg [3]. Năm 2016, tác giả Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự đã chứng minh cao chiết cồn và các phân đoạn của cao chiết cồn từ lá và thân của Thạch tùng răng cưa thu hái tại Sapa, Lào Cai có tác dụng ức chế AChE in vitro. Phân đoạn dịch chiết EtOAc cho thấy hoạt tính ức chế AChE mạnh nhất với IC50 = 89,96 ± 3,42 µg/ml [6]. Cũng năm 2016, tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự đã đánh giá sự có mặt của Hup A trong mẫu cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào mùa Xuân và mùa Thu bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả cho thấy, hàm lượng Hup A trong 2 mẫu lần lượt là 0,0925 mg/g mẫu khô (mẫu mùa Thu) và 0,0171 mg/g mẫu khô (mẫu mùa Xuân). Hàm lượng Hup A được nhận định có sự thay đổi giữa các thời điểm trong năm, với hàm lượng cao nhất vào giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [13]. Tại Việt Nam có rất ít tài liệu nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa và chưa có nghiên cứu trên đối tượng cao chiết giàu alcaloid từ loài cây này. Vì vậy, trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa của Việt Nam để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin. 10
1.3. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ 1.3.1. Các mô hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm 1.3.1.1. Mô hình gây sa sút trí nhớ tự phát  Mô hình lão hóa tự nhiên Suy giảm trí nhớ là đặc trưng đầu tiên và phổ biến của tuổi già. Vì vậy, những động vật già có tiềm năng được dùng như những mô hình tự phát gây suy giảm trí nhớ. Chuột là động vật thường được sử dụng trong các nghiên cứu do chi phí thấp, sẵn có, dễ thao tác và hành vi đặc trưng. Do không gây xâm lấn và không chịu tác động của chất hóa học thần kinh nên những mô hình này được coi là công cụ hữu ích để phản ánh sinh lý bệnh tự nhiên của bệnh Alzheimer.  Mô hình tăng tốc độ lão hóa Chuột tăng tốc độ lão hóa (SAM) là một mô hình lão hóa cấp tốc được hình thành thông qua việc lựa chọn kiểu hình từ chủng chuột AKP/J, bao gồm 9 chủng tăng tốc độ lão hóa nhạy cảm (SAMP) và 3 chủng tăng tốc độ lão hóa đề kháng (SAMR). Trong đó, chủng SAMP8 là mô hình gây sa sút trí nhớ đáng tin cậy cho thấy sự suy giảm khả năng học tập và trí nhớ liên quan đến lão hóa [59]. 1.3.1.2. Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng tác nhân hóa học  Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin là một trong những mô hình động vật được sử dụng nhiều nhất do quy trình đơn giản và khả năng sống sót cao. Scopolamin là một chất đối vận muscarinic có cấu trúc tương tự chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin. Do có ái lực cao, scopolamin gắn với các thụ thể muscarinic và ngăn không cho acetylcholin gắn vào. Kết quả, nồng độ những chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin tự do tăng quá mức gây tổn thương các dây thần kinh dẫn đến suy giảm khả năng học tập và trí nhớ [65].  Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng streptozotocin Streptozotocin gây tổn hại tế bào thần kinh thông qua stress oxy hóa, tăng tích lũy các A trong não, kích thích sự phosphoryl hóa protein tau. Chuột tiêm streptozotocin liều 3 mg/kg, 2 lần trong 48 giờ được báo cáo gây ra suy giảm trí nhớ giống bệnh Alzheimer [52]. Hạn chế của mô hình này là tỷ lệ tử vong cao, yêu cầu số lượng động vật thử nghiệm lớn. 11