Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Nghiên cứu hoạt chất Ginsenosid Rb1 trong lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:57

Thêm vào BST

Báo xấu

7
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Nghiên cứu hoạt chất Ginsenosid Rb1 trong lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)" nghiên cứu chiết xuất, phân lập thành phần saponin ginsenoside Rb1 trong mẫu cao lá sâm Việt Nam; xác định cấu trúc của thành phần saponin ginsenoside Rb1 trong mẫu cao lá sâm Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Nghiên cứu hoạt chất Ginsenosid Rb1 trong lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC ĐẶNG KIM NGÂN NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT GINSENOSID Rb1 TRONG LÁ SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2023
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC Người thực hiện: ĐẶNG KIM NGÂN NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT GINSENOSID Rb1 TRONG LÁ SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƢỢC HỌC) Khóa: QH.2018.Y Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. NGUYỄN H U T NG 2. TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH Hà Nội – 2023
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ vô cùng quý báu của Ban giám hiệu, các thầy cô giáo của Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Trường Đại học PHENIKAA cùng với gia đình và bạn bè. Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Trường Đại học PHENIKAA, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, quan tâm chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Thị Thanh Bình – Trưởng Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trao cho em cơ hội để có thể làm và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp đồng thời dành thời gian hướng dẫn, góp ý cho em trong quá trình hoàn thiện khóa luận. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai thầy TS. Vũ Văn Tuấn và TS. Nguyễn Ngọc Hiếu, Trường Đại học PHENIKAA, hai thầy đã nhiệt tình, giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn, góp ý cho em trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thiện đề tài ở trường Đại học PHENIKAA. Cảm ơn các thầy cô Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền dạy cho em những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học vừa qua. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và khích lệ trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2023 Sinh viên Ngân Đặng Kim Ngân
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CH VIẾT TẮT STT Ký hiệu, chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 BuOH n-butanol 2 CH2Cl2 Methylene chloride 3 CHCl3 Chloroform 4 EtOH Ethanol 5 H2SO4 Acid sulfuric 6 MeOH Methanol 7 MS Mass Spectroscopy 8 NMR Nuclear Magnetic Resonance 9 PV1 Ginsenosid-Rb1 10 SVN Sâm Việt Nam 11 TLC Sắc ký lớp mỏng
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang Hình 1.1. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & 1 5 Grushv) 2 Hình 1.2. Hình ảnh lá và quả của sâm Việt Nam 7 Hình 1.3. (A) Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha and Grushv). Sơ lược về nhân sâm Việt Nam và sự 3 9 phân bố tự nhiên của nhân sâm Việt Nam ở Việt Nam. (B) Bản phác thảo màu sắc của nhân sâm Việt Nam 4 Hình 1.4. Cấu trúc của 20(S)-protopanaxadiol 10 5 Hình 1.5. Cấu trúc của 20(S)- protopanaxatriol 12 6 Hình 1.6. Cấu trúc của saponin có cấu trúc Ocotillol 13 7 Hình 1.7. Cấu trúc của saponin dẫn chất của acid oleanolic 15 Hình 1.8. (1): squalene; (2): tetradecanol; (3): α – tocopherolquinone; (4): docosanol; (5): daucosterol; (6): 8 20 kaempferol; (7): panaxolide; (8) ginsenoside R10; (9): kaempferol 3– O–β–D–glucosyl (12)– β –D–galactoside; (10): junipediol A. Hình 2.1. Mẫu lá của Sâm Việt Nam được sử dụng trong nghiên 9 22 cứu 10 Hình 2.2. Hệ thống máy cất quay Rotavapor R-100 (BUCHI) 24 11 Hình 3.1. Sơ đồ phân lập hợp chất từ lá sâm Việt Nam 30 12 Hình 3.2. Hình ảnh phổ 1H-NMR của hợp chất 34 13 Hình 3.3. Hình ảnh phổ 13C-NMR của hợp chất 38 14 Hình 3.4. Hình ảnh phổ ESI- MS của hợp chất (positive [M+H]+) 39 15 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của PV1 40 16 Hình 3.6. Sắc ký đồ TLC định tính hợp chất Rb1 trong lá sâm Việt 41
Nam DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol 10 2 Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol 12 3 Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc ocotillol 14 4 Bảng 1.4. Hai saponin dẫn chất của acid oleanolic 15 Bảng 1.5. Hàm lượng saponin của SVN so sánh với các loại 5 16 Panax spp 6 Bảng 1.6. Các saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxadiol 18 7 Bảng 1.7. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol 18 8 Bảng 1.8. Các saponin có cấu trúc ocotillol 19 9 Bảng 2.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 23 10 Bảng 2.2. Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu 24 11 Bảng 2.3. Hóa chất dùng làm từng loại cột 27 12 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất PV1 36
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ SÂM VIỆT NAM .................................................... 3 1.1. Đặc điểm thực vật .................................................................................................. 3 1.1.1. Lịch sử phát hiện ............................................................................................. 3 1.1.2. Phân loại .......................................................................................................... 4 1.2. Danh pháp khoa học .............................................................................................. 5 1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................................. 6 1.4. Sinh thái và phân bố .............................................................................................. 7 1.5. Thành phần hóa học ............................................................................................... 9 1.5.1. Thành phần hoá học từ phần dưới mặt đất của cây sâm Việt Nam ................. 9 1.5.1.1. Các hợp chất saponin ................................................................................ 9 1.5.1.2. Hợp chất polyacetylen ............................................................................ 16 1.5.1..3. Thành phần acid béo .............................................................................. 16 1.5.1.4. Thành phần acid amin ............................................................................. 16 1.5.1.5. Thành phần các nguyên tố vi đa và vi lượng .......................................... 17 1.5.1.7. Hợp chất glucid ....................................................................................... 17 1.5.2. Thành phần hoá học từ phần trên mặt đất của cây sâm Việt Nam ................ 17 1.5.2.1. Các hợp chất saponin .............................................................................. 17 1.5.2.2. Một số hợp chất mới ............................................................................... 19 1.6. Công dụng trong y học cổ truyền ........................................................................ 21 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 22 2.1.1. Mẫu lá Sâm Việt Nam ................................................................................... 22 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ............................................................................ 23
2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................... 23 2.1.3.2. Hóa chất, dung môi ................................................................................. 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 25 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất .............................................................. 25 2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .......................................................................... 25 2.2.1.2. Phương pháp sắc ký cột (CC) ................................................................. 26 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất .................................. 28 2.2.2.1. Phương pháp phân tích khối phổ (Mass Spectroscopy - MS) ................ 28 2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance - NMR) .... 28 2.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................ 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ .............................................................................................. 30 3.1. Chiết xuất, phân lập ............................................................................................. 30 3.2. Xác định cấu trúc chất ......................................................................................... 31 3.2.1. Phổ 1H- NMR ................................................................................................ 32 3.2.2. Phổ 13C-NMR ................................................................................................ 35 3.2.3. Phổ MS .......................................................................................................... 39 3.2.4. Kết luận ......................................................................................................... 39 3.3. Định tính Rb1 trong lá sâm Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ....... 40 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................... 42 4.1. Về phương pháp nghiên cứu. ............................................................................... 42 4.2. Về thành phần hóa học Ginsenoside Rb1 ............................................................. 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................... 45
ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thời gian gần đây, mọi người đang có xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị bệnh vì đặc tính an toàn, ít gây tác dụng phụ và hiệu quả điều trị cao. Bởi vậy việc đi sâu vào nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao đang rất được quan tâm. Đặc biệt là Việt Nam - một đất nước có hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa dạng và tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc với 4000 loài cây thuốc, hơn 50 loài tảo biển, 75 loài khoáng vật và gần 410 động vật làm thuốc [1]. Không ngoại lệ, sâm Việt Nam (sâm Ngọc Linh) là một loài thảo dược quý hiếm, có nhiều tác dụng. Sâm Việt Nam có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha & Grushv, là một trong 12 loài thuộc chi Nhân sâm (Panax), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) được phát hiện lần đầu trong tự nhiên ở vùng núi Ngọc Linh thuộc tỉnh Kon Tum và Quảng Nam vào năm 1973 và được chính thức ghi nhận đầy đủ về mặt định danh thực vật học năm 1985 [2]. Đây loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới và cho đến nay chỉ mới phát hiện ở Việt Nam. Kể từ khi được phát hiện và ghi nhận là một loài Panax mới, SVN đã được sự quan tâm nghiên cứu về phân loại thực vật của các nhà khoa học trên thế giới học [3-6]. Ngoài 26 hợp chất saponin tương tự sâm Mỹ và sâm Triều Tiên, trong sâm Việt Nam còn phát hiện được hơn 20 loại saponin khác như majonoside R1-2, vinaginsenoside R1-11 và các saponin khác thuộc nhóm glycosid, các saponin chính phải kể đến như majonoside-R2, ginsenoside-Rb1, ginsenoside-Rg1 và ginsenoside-Rd [7]. Các saponin từ SVN đã được chứng minh có tác dụng bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa huyết áp, chống ôxy hóa, phòng chống ung thư, chống lão hóa, kích thích hệ miễn dịch, chống trầm cảm, giảm căng thẳng, gan, thận [8]… Tuy nhiên, hiện nay các nghiên cứu được công bố chủ yếu là về các thành phần saponin trong rễ cũng như tác dụng sinh của rễ SVN mà có ít các nghiên cứu về thành phần hoạt chất saponin trong lá SVN. Bởi vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học, đặc biệt là saponin trong lá sâm Việt Nam là cần thiết, từ đó tạo cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu, phát triển các sản phẩm từ bộ phận lá của SVN. Bên cạnh đó, các kỹ thuật sắc ký hiện nay được sử dụng rất rộng rãi để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp và được ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, môi trường,… vì nhiều lý do như có 1
độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [9]. Từ những cơ sở trên, để tiến hành nghiên cứu và đánh giá thành phần hoạt chất của lá sâm Việt Nam trong phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu hoạt chất Ginsenosid Rb1 trong lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)” với 2 mục tiêu chính: 1. Chiết xuất, phân lập thành phần saponin ginsenoside Rb1 trong mẫu cao lá sâm Việt Nam. 2. Xác định cấu trúc của thành phần saponin ginsenoside Rb1 trong mẫu cao lá sâm Việt Nam. 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ SÂM VIỆT NAM 1.1. Đặc điểm thực vật 1.1.1. Lịch sử phát hiện Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, sâm Việt Nam đã được các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê Đăng, sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Dựa trên những thông tin lưu truyền trong cộng đồng các dân tộc thiểu số Quảng Nam, Kon Tum về một loại củ quý hiếm trên núi Ngọc Linh có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người, và do nhu cầu của kháng chiến đã khiến ngành dược khu Trung Trung Bộ quyết phải tìm ra cây sâm chi Panax tại miền Trung, mặc dù trước đó nhiều nhà khoa học cho rằng chi Panax chỉ có ở miền Bắc. Năm 1973, khu Y tế Trung Trung bộ cử một tổ 4 cán bộ do dược sĩ Đào Kim Long làm trưởng đoàn, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt, dược sĩ Nguyễn Châu Giang, dược sĩ Trần Thanh Dân là thành viên, đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô tỉnh Kon Tum. Khi đoàn lên tỉnh Kon Tum, Ban Dân y Kon Tum cử thêm dược tá Nguyễn Thị Lê trợ giúp cho đoàn, dẫn đường lên núi Ngọc Linh. Sau nhiều ngày vượt suối băng rừng, đến 9 giờ sáng ngày 19 tháng 03 năm 1973, ở độ cao 1.800 mét so với mặt biển, đoàn đã phát hiện hai cây sâm đầu tiên và ngay buổi chiều cùng ngày đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc Linh. Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, quần thể, quần lạc, phân bố, di cư và phát tán, dược sĩ Đào Kim Long đã xác định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm mới, đặc biệt quý hiếm, chưa từng xuất hiện tại bất cứ nơi nào khác trên thế giới. Theo đánh giá của Tiến sĩ Trần Chí Liêm, Thứ trưởng Bộ Y tế Việt Nam: đây là cống hiến quan trọng cho khoa học, bổ sung tri thức mới về vùng phân bố chi Panax xuống tới vĩ tuyến 15 và bổ sung cho chi Panax họ Araliaceae một loài mới. Sau khi sâm được phát hiện, Khu uỷ Khu 5 đã chỉ đạo Ban Dân y bí mật bảo vệ và khai thác, giao cho xưởng Dược Trung Trung Bộ chế biến làm thuốc phục vụ cán bộ, chiến sĩ và nhân dân; đồng thời gửi mẫu ra Bộ Y tế, Viện Dược liệu Hà Nội. Những năm sau khi hòa bình lập lại, tháng 10 năm 1978 một tổ công tác thứ hai lên vùng núi Ngọc Linh với nhiệm vụ ước lượng sơ bộ diện tích sâm mọc. Kết 3
quả chuyến đi là việc tìm ra được một vùng dài hàng chục kilômét, có trữ lượng khoảng 6.000-7.000 cây sâm mọc dày đặc với mật độ từ 1 mét vuông một cây đến 7,8 mét vuông một cây. Nǎm 1979, Trung tâm Y tế Quảng Nam tổ chức điều tra ở 5 xã của huyện Trà My với sự giúp đỡ của Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả đợt điều tra là việc tìm thấy 1.337 cây trong 211 ô tiêu chuẩn. Trọng lượng trung bình thân rễ sâm là 5,26 gam; số thân có trọng lượng trên 25 gam là 7,39% và số thân rễ có trên 10 sẹo (ước tính trên 8 năm tuổi) là 36,9%. Đợt điều tra này đã thu được 1 thân rễ có tới 52 sẹo (ước tính cây trên 50 năm tuổi), đường kính 1,2 cm, tuy đây chưa phải là thân rễ sống lâu nhất. Trong những đợt tìm kiếm, điều tra về sau còn phát hiện ra cây khoảng 82 năm tuổi có rễ, củ và thân rễ dài hơn nửa mét [7,10-12]. 1.1.2. Phân loại Sâm Việt Nam với danh pháp khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv, ngoài tên gọi chính thống là Sâm Việt Nam còn có nhiều tên khác như sâm Ngọc Linh, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc), củ ngải rọm con, rơm con (Xê Đăng) hay cây thuốc giấu [7,12-14], và có vị trí phân loại theo hệ thống phân loại thực vật như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Mộc lan (Magnoliophyta) Lớp: Mộc lan (Magnoliopsida) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi: Sâm (Panax) Loài: Panax vietnamensis Ha & Grushv 4
Hình 1.1. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv) (https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html) 1.2. Danh pháp khoa học Ngày 8 tháng 6 năm 1973 tại văn phòng Ban Dân y Khu 5 dược sĩ Đào Kim Long, chủ nhiệm đề tài nghiên cứu sâm Việt Nam đã nêu rõ đặc điểm hình thái, sinh thái học, quần thể, thảm thực vật, khả năng thích nghi, cách phát tán, khả năng tái sinh của cây nhân sâm này, kèm theo báo cáo có các tiêu bản mẫu cây ép khô, ảnh chụp và 3kg sâm đã phơi khô. Dược sĩ Đào Kim Long đã đặt tên khoa học của cây sâm Việt Nam này là Panax articulatus KL Dao (trong kháng chiến để giữ bí mật nên thường gọi là Sâm K5), hay Panax articulatus Kim Long Đào theo tên người phát hiện. 12 năm sau, tên Nhân sâm Việt Nam và tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushy, họ Ngũ gia bì - Araliaceae, được công bố tại Viện Thực vật Kamarov (Liên Xô cũ) năm 1985, do Hà Thị Dung và I. V. Grushvisky đặt tên. Áp dụng Quy tắc quốc tế về danh pháp thực vật công bố năm 1994 (ICBN - Tokyo code), điều 1, mục 3 phần C, danh pháp khoa học của sâm Việt Nam có thể được nối tên của người thứ hai công bố với tên người thứ nhất qua chữ ex, và khi đó tên khoa học của cây nhân sâm Việt Nam được viết hợp pháp theo luật quốc tế hiện nay sẽ phải là Panax articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Grushv (1985) [10-12]. 5
1.3. Đặc điểm hình thái Sâm Việt Nam là loài cây thân thảo, sống lâu năm, cao 40-80cm. Thân rễ nạc, có đường kính từ 3,5 cm; mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm để lại, căn cứ vào các vết sẹo trên thân rễ, người ta tính được tuổi của các cây sâm, mặt ngoài thân rễ màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối thân rễ ở một số cây đôi khi có củ gần hình cầu, đường kính đến 5 cm. Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1 - 4 thân. Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng đứng, nhẵn, cao 40 - 80cm, rỗng, có 3 mặt hơi tròn có những rãnh nhỏ theo chiều dọc. Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt, mọc vòng thường có 4 (hiếm khi 3,5 hoặc 6). Ở ngọn, mỗi lá kép gồm 5 lá chét (ít khi có 6,7), lá dài 7 - 12cm; lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 -14 cm, rộng 3 - 5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5 – 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít khi 8-11) cặp dọc theo gân chính và gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3mm, mặt dưới ít hơn. Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang một tán đơn, đôi khi có thêm 1 - 4 tán phụ hoặc một hoa đơn độc. Cuống hoa dài 1,5 – 2 cm, có nhiều lông. Tán hoa chính đường kính 2,5 - 4 cm, có 50 - 120 hoa. Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4 mm; đài 5 răng hình tam giác dài 1 – 1,5 cm; tràng có 5 cánh hoa hình trứng dài 2mm; bao phấn hình trái xoan dài 1mm và có 5 nhị. Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có 2 ô, 2 vòi (chiếm 20%). Quả mọng, hình trứng, khi chín màu đỏ và thường có 1 chấm đen ở trên đỉnh quả. Quả 1 hạt hình thân, quả 2 hạt có hình cầu hơi dẹt dài 7 – 10mm, rộng 4- 6mmm. Hạt lớn dài 8mm, vỏ hạt cấu tạo bởi nhiều vết xốp lồi lõm. Ra hoa vào tháng 4 - 6, quả có vào tháng 7 – 9 [7,12,15]. 6
Hình 1.2. Hình ảnh lá và quả của sâm Việt Nam (https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html) 1.4. Sinh thái và phân bố Trong số hơn 10 loài và dưới loài (var.) đã biết của chi Nhân sâm (Panax L), ở Việt Nam có 3 loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Việt Nam là loài được phát hiện sau cùng nhất (1972), cho đến năm 1985 nó mới được công bố là loài mới đối với khoa học (Hà Thị Dung và Grus Vitzki B, 1985). Cho đến nay, sâm Việt Nam mới chỉ phát hiện được duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Đây cũng là giới hạn xa nhất về phía nam (ở 15o vĩ Bắc) của bản đồ phân bố chi Panax L trên thế giới. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ 2 của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o15’ - 108o7’ kinh độ Đông và15o0’0’’- 15o10’ vĩ độ Bắc). Đỉnh cao nhất của Ngọc Linh là 2598m. Những điểm vốn trước đây có sâm Việt Nam mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500-2000m, chủ yếu tập trung ở 1800-2000m, thuộc địa bàn 2 huyện Đắk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà 7
My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng như mức độ phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi. Sâm Việt Nam là loại cây thảo đặc biệt sinh trưởng ở độ cao từ 1500 – 2200 m so với mặt nước biển, cây đặc biệt ưa ẩm và bóng, thường mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh cây lá rộng, nhất là dọc theo hành lang ven suối ở độ cao từ 1900 m. Môi trường rừng nơi có sâm Việt Nam mọc tự nhiên luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù. Nhiệt độ trung bình ước tính từ 15⁰C đến 18⁰C; lượng mưa xấp xỉ khoảng 3000 mm/năm. Đất rừng ở đây được tạo từ lá cây mục lâu ngày nên đất có màu nâu rêu, tơi xốp, độ mùn cao và chứa nhiều nước trong đất. Sâm Việt Nam sinh trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ mùa xuân đến hè, mặc dù ở miền Nam lúc này đang là cuối mùa khô - đầu mùa mưa nhưng ở vùng núi Ngọc Linh do có độ cao và thảm thực vật nguyên sinh nên môi trường luôn ẩm ướt. Loài cây này có mùa hoa vào tháng 4-5, mùa quả vào tháng 6-9, cây ra quả tương đối đều. Khi quả chín sẽ rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông và nảy mầm vào mùa xuân năm sau. Gieo giống tự nhiên bằng hạt. Phần thân rễ bị gãy còn lại vẫn có thể tái sinh. Cây thường lụi hàng năm vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm sau từ thân rễ sẽ mọc lên chồi thân mới. Sau nhiều năm điều tra phát hiện, từ năm 1978, sâm Việt Nam bắt đầu được phát động khai thác ồ ạt, dẫn đến việc sâm Việt Nam rơi vào thời kỳ bị đe dọa tuyệt chủng, đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “Đang nguy cấp”. Hai tỉnh Quảng Nam (trước đây là Quảng Nam- Đà Nẵng) và Kon Tum đã kiên trì đầu tư để duy trì bảo tồn giống và hiện nay có khoảng 200.000 cây ở các lứa tuổi khác nhau. Cây trồng bán tự nhiên dưới tán rừng, ở độ cao 1800, đã tỏ ra có kết quả, sau 3-4 năm bắt đầu thu được hạt giống tốt để gieo trồng. Việc bảo vệ cây sâm Việt Nam và nghiên cứu nhân trồng tại chỗ loài cây đặc biệt quý hiếm này, hiện vẫn là nhiệm vụ hàng đầu trong công tác bảo tồn cây thuốc ở Việt Nam [7,12]. 8
(A) (B) Hình 1.3. (A) Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha and Grushv). Sơ lƣợc về nhân sâm Việt Nam và sự phân bố tự nhiên của nhân sâm Việt Nam ở Việt Nam. (B) Bản phác thảo màu sắc của nhân sâm Việt Nam [17] 1.5. Thành phần hóa học 1.5.1. Thành phần hoá học từ phần dưới mặt đất của cây sâm Việt Nam Sâm Việt Nam đã được tập trung nghiên cứu ngay từ khi loài này được phát hiện ở Việt Nam vào những năm cuối của thế kỉ XX. Từ 1974 đến 1990, các tác giả Nguyễn Thời Nhâm và Trần Công Luận đã nghiên cứu về thành phần hợp chất saponin trong Sâm Việt Nam hoang dại, khởi đầu cho những nghiên cứu toàn diện hơn và sâu hơn của các thành phần hóa học có ở loài cây này [12,14,16]. Kể từ báo cáo đầu tiên vào năm 1993, cho đến nay đã có 52 hợp chất saponin trong Sâm Việt Nam đã được phân lập và xác định cấu trúc [14,17]. Các hợp chất này chủ yếu được phân lập từ rễ và thân rễ của Sâm Việt Nam. Ngoài saponin, trong Sâm Việt Nam các tác giả cũng xác định được trong sâm có chứa các polyacetylen, acid béo, acid amin, glucid, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng khác có trong loài sâm này [7,14,16,18-20]. 1.5.1.1. Các hợp chất saponin Chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Việt Nam cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. 9
Từ những nghiên cứu về phần dưới mặt đất của Sâm Việt Nam đã phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxadiol oxid II và 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới đã phát hiện trong Sâm Việt Nam được đặt tên là vina – ginsenosid-R1-R25 và 20-O-Me-G.Rh1 [14,21]. Các saponin của Sâm Việt Nam được xác định hầu hết thuộc loại dammarane triterpene chúng có thể được phân loại thêm thành các nhóm protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT) và occotillol (OT) ngoại trừ cho hai saponin loại oleanane (ginsenosid Ro và hemslosid Ma3) [16,17,22]. Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học có giá trị cũng chiếm một tỉ lệ rất cao về hàm lượng và số lượng trong thành phần hợp chất saponin của Sâm Việt Nam (50/52 saponin được phân lập) [14,23]. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol Các saponin dẫn chất của 20(S)- protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với đại diện chính là G-Rb1 chiếm 2,0% về hàm lượng [4,14]. Hình 1.4. Cấu trúc của 20(S)-protopanaxadiol Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol [3,4,7,14,16,17] STT Tên Kiểu R1 R2 Hàm lƣợng (%) 1 G-Rb1* (A) -Glc2- Glc -Glc6- Glc 2,0 10
2 G-Rb2 (A) -Glc2- Glc -Glc6-Ara(p) 0,012 3 G-Rb3* (A) -Glc2- Glc -Glc6-Xyl 0,11 4 G-Rc (A) -Glc2- Glc -Glc6-Ara(f) 0,013 5 G-Rd* (A) -Glc2- Glc -Glc 0,87 6 PG-RC1 (A) -Glc2- Glc6-Ac -Glc 0,001 7 GY-IX (A) -Glc -Glc6-Xyl 0,002 8 GY-XVII (A) -Glc -Glc6- Glc 0,036 9 Q-R1 (A) -Glc2- Glc6-Ac -Glc6- Glc 0,012 10 Q-R1 (A) -Glc2- Glc2-Xyl -Glc6- Glc 0,072 11 M-F1 (B) -Glc2- Glc -Glc 0,001 12 VG-R3 (H) -Glc2- Glc -Glc 0,009 13 VG-R7 (A) - Glc2- Glc2-Xyl -Glc 0,01 14 VG-R8 (C) -Glc2- Glc -Glc 0,004 15 VG-R9 (B) -Glc2- Glc -Glc 0,004 16 VG-R13 (E) -Glc2- Glc -Glc 0,002 17 VG-R24 (A) -Glc2-Xyl -Glc 0,001 18 VG-R23 (A) -Glc2- Glc -Ara 0,001 19 VG-R22 (A) -Glc2- Glc -Xyl 0,001 20 VG-R16 (D) -Glc2- Glc -Glc 0,003 21 VG-R21 (G) -Glc2- Glc -Glc 0,001 22 VG-R20 (F) -Glc2- Glc -Glc 0,003 Ghi chú: G= ginsenoside; PG= pseudo-ginsenoside; GY= gypenoside; Q= quinquenoside; N= notoginsenoside; M= majonoside; VG= vina-ginsenoside. *: các saponin chính Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol 11
Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện chính là: ginsenoside- Re, -Rg1, notoginsenoside –R1 [7]. Hình 1.5. Cấu trúc của 20(S)- protopanaxatriol Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol [3,4,7,14,16] Hàm lƣợng STT Tên Kiểu R1 R2 R3 (%) 23 G-Re* (I) -H -Glc2-Rha -Glc 0,17 24 20-Glc-G-Rf (I) -H -Glc2-Glc -Glc 0,01 25 G-Rg1* (I) -H -Glc -Glc 1,37 (I) 26 G-Rh1 -H -Glc -H 0,008 20(R),20(S) 27 G-Rh1 (I) -H -Glc -H 0,021 28 PG-RS1 (I) -H -Glc2-Rha-6Ac -Glc 0,013 29 N-R1* (I) -H -Glc2-Xyl -Glc 0,36 -Glc6- 30 N-R6 (I) -H -Glc 0,01 αGlc 31 VG-R4 (I) -Glc2-Glc -H -Glc 0,004 12