Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Tổng hợp pha rắn, đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và gây tan máu của peptid Mastoparan C có nguồn gốc từ nọc ong Vespa crabro

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:76

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài "Tổng hợp pha rắn, đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và gây tan máu của peptid Mastoparan C có nguồn gốc từ nọc ong Vespa crabro" là tổng hợp MP-C bằng phương pháp tổng hợp peptid pha rắn; đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của MP-C; đánh giá độc tính gây tan máu của MP-C.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Tổng hợp pha rắn, đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và gây tan máu của peptid Mastoparan C có nguồn gốc từ nọc ong Vespa crabro

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC -------------------- TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN TỔNG HỢP PHA RẮN, ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM VÀ GÂY TAN MÁU CỦA PEPTID MASTOPARAN C CÓ NGUỒN GỐC TỪ NỌC ONG VESPA CRABRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2023
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ------------------ TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN TỔNG HỢP PHA RẮN, ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM VÀ GÂY TAN MÁU CỦA PEPTID MASTOPARAN C CÓ NGUỒN GỐC TỪ NỌC ONG VESPA CRABRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) KHÓA: QH.2018.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH TS. LƯƠNG XUÂN HUY Hà Nội – 2023
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Thanh Bình, TS. Lương Xuân Huy và Ths. Bùi Thị Phương Hải, những người đã tận tâm hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến giảng viên thuộc Bộ môn Hóa Dược, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội (ĐHQGHN) và các thầy cô khoa Dược trường Đại học Phenikaa đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài. Em cũng xin gửi lời tri ân sâu sắc đến tập thể quý thầy cô Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN và Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong 5 năm học qua, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Bên cạnh đó, em cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè và những người thân yêu đã ủng hộ, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Hội đồng đánh giá đã đóng góp ý kiến, giúp em hoàn thiện khóa luận. Em rất cảm kích và trân trọng sự giúp đỡ của Quý thầy cô! Nghiên cứu này được tiến hành trong khuôn khổ đề tài QG.22.67 “Tổng hợp pha rắn, đánh giá tác dụng kháng khuẩn và độ bền đối với enzyme tiêu hóa của một số peptid cải tiến từ Mastoparan C” của Đại học Quốc gia Hà Nội. Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2023 Sinh viên Trần Thị Khánh Huyền
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AMP Antimicrobial peptides Peptid kháng khuẩn B.subtilis Bacillus subtilis Bacillus subtilis Boc tert-butoxycarbonyl tert-butoxycarbonyl C.albicans Candida albicans Candida albicans CD Circular Dichroism Quang phổ lưỡng sắc tròn 1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2 1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2 oxoethylideneaminooxy) oxoethylideneaminooxy) COMU dimethylaminomorpholino)] dimethylaminomorpholino)] uronium hexafluorophosphate uronium hexafluorophosphat DAD Diode Array Detector Đầu dò mảng Diode DCM Dichloromethane Dichloromethan DIPEA N,N-Diisopropylethylamine N,N-Diisopropylethylamin DMF Dimethylformamide Dimethylformamid E.coli Escherichia coli Escherichia coli Fluoren-9 Fluoren-9- Fmoc ylmethyloxycarbonyl ylmethyloxycarbonyl High-performance liquid HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao chromatography K.pneumonia Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia Liquid chromatography–mass LC-MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ spectrometry m/z Mass to charge Khối lượng trên điện tích
Minimum bactericidal MBC Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu concentration Minimum biofilm eradication Nồng độ loại bỏ biofilm tối MBEC concentration thiểu MBHA 4-methylbenzhydrylamine 4-methylbenzhydrylamin Minimum biofilm inhibitory Nồng độ ức chế biofilm tối MBIC concentration thiểu Minimal inhibitory MIC Nồng độ kìm khuẩn tối thiểu concentration MP-C Mastoparan C Mastoparan C P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S.aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus SDS Natri dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat SPPS Peptid Solid Phase Synthesis Tổng hợp peptid pha rắn TFA Trifluoroaceticacid Trifluoroaceticacid TIS Triisopropylsilane Triisopropylsilan PBS Phosphate-buffered saline Đệm phosphat
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMINO ACID Chữ viết tắt Tên viết tắt Tên Tiếng anh A Ala Alanine I Ile Isoleucine K Lys Lysine L Leu Leucine N Asn Asparagine V Val Valine
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng biofilm của Mastoparan C trên một số chủng vi sinh vật ...................................................................................................12 Bảng 1.2. MIC của Melitin và Mastoparan M trên các chủng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans ....................13 Bảng 1.3. Nồng độ ức chế 50% của Mastoparan C trên một số dòng tế bào ung thư.......................................................................................................................14 Bảng 3.1. Nguyên liệu tổng hợp Mastoparan C .............................................26 Bảng 3.2. Ba bước lặp lại nhiều lần trong tổng hợp Mastoparan C ...............27 Bảng 3.3. Chương trình tinh chế peptid bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép đàu dò mảng Diode ...................................................................................................30 Bảng 3.4. Chương trình phân tích peptid bằng sắc kí lỏng khối phổ ............32 Bảng 3.5. So sánh giá trị m/z thực nghiệm và lý thuyết của Mastoparan C ..33 Bảng 3.6. Hoạt tính kháng sinh của Mastoparan C trên một số chủng vi sinh vật ..............................................................................................................................34 Bảng 4.1. Các peptid được thiết kế mới và các thông số của mỗi peptid ......37 Bảng 4.2. MIC của Mastoparan C, các peptid dẫn xuất của Mastoparan C và một số kháng sinh trên các chủng vi gram dương ( Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis) và gram âm( Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumonia) ................................................................................................................40 Bảng 4.3. Giá trị GM, MHC và TI của Mastoparan C và các peptid dẫn xuất của Mastoparan C ......................................................................................................43 Bảng 4.4. Hoạt tính chống lại một số vi khuẩn và vi nấm của hai loại mastopran ...................................................................................................................................44
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian ba chiều của peptid kháng khuẩn ...................7 Hình 1.2. Cấu trúc bậc 1 của Mastoparan C ..................................................10 Hình 1.3. Cấu trúc xoắn α của Mastoparan C biểu diễn theo chiều ngang ....11 Hình 1.4. Cấu trúc xoắn α của Mastoparan C biểu diễn theo chiều dọc ........12 Hình 1.5. Quy trình tổng hợp dipeptid sử dụng phương pháp tổng hợp peptid pha rắn với giá mang rắn sử dụng ở đây là polystyren liên kết ngang gắn thêm clorometyl..................................................................................................................19 Hình 1.6. Bình phản ứng tổng hợp pha rắn ....................................................19 Hình 2.1. Máy lắc HY-5 ORBITAL SHAKER ............................................. 21 Hình 2.2. Hệ thống hỗ trợ lọc hút chân không (Vaccum Manifold): máy hút chân không(a), cột phản ứng (b), bệ phản ứng(c) .....................................................21 Hình 2.3. Phương pháp tổng hợp pha rắn Mastoparan C sử dụng Rink Amide MBHA resin ..............................................................................................................22 Hình 2.4. Nguyên tắc hoạt động của thuốc thử Kaiser ..................................23 Hình 3.1. Theo dõi phản ứng tổng hợp Mastoparan C bằng thuốc thử Kaiser: Chuỗi peptid sau khi gắn acid amin mới, lúc chưa xử lý loại Fmoc (A) và đã xử lý loại Fmoc (B) ............................................................................................................ 30 Hình 3.2. Sắc ký đồ của Mastoparan C ở bước sóng 220 nm sau tinh chế....31 Hình 3.3. Phổ khối của Mastoparan C sau tinh chế .......................................33 Hình 3.4. Quang phổ lưỡng sắc tròn của Mastoparan C ở môi trường mô phỏng màng tế bào SDS 10%...............................................................................................34 Hình 3.5. Hoạt tính gây tan máu của Mastoparan C đối với hồng cầu người35
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 3 1.1. Tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh .................................. 3 1.1.1. Kháng thuốc ở vi khuẩn ..................................................................3 1.1.2. Kháng thuốc ở virus ........................................................................4 1.1.3. Kháng thuốc ở vi nấm. ....................................................................4 1.1.4. Kháng thuốc ở kí sinh trùng. ...........................................................5 1.2. Peptid kháng khuẩn ............................................................................... 5 1.2.1. Nguồn gốc của peptid kháng khuẩn ................................................5 1.2.2. Cấu trúc của peptid kháng khuẩn ....................................................6 1.2.3. Tác dụng sinh học của peptid kháng khuẩn ....................................7 1.3. Mastoparan C ......................................................................................... 9 1.3.1. Nguồn gốc của Mastoparan C .........................................................9 1.3.2. Cấu trúc của Mastoparan C .............................................................9 1.3.3. Hoạt tính sinh học .........................................................................12 1.3.4. Sự ổn định với dịch sinh học .........................................................15 1.3.5. Liên quan cấu trúc-tác dụng ..........................................................16 1.3.6. Những thách thức trong quá trình phát triển Mastoparan C .........17 1.3.7. Tổng hợp pha rắn ..........................................................................17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 20 2.1.1. Dung môi, hóa chất .......................................................................20 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ............................................................................20 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 21 2.2.1. Phương pháp tổng hợp Mastoparan C ...........................................21 2.2.2. Tinh chế và kiểm tra độ tinh sạch của peptid ................................23 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc bậc một của Mastoparan C .........24 2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc bậc 2 của peptid Mastoparan C ..24 2.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của peptid Mastoparan C ..........................................................................................24
2.2.6. Phương pháp đánh giá tác dụng gây tan máu của peptid Mastoparan C .....................................................................................................24 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ .............................................................................. 26 3.1. Tổng hợp Mastoparan C ...................................................................... 26 3.1.1. Chuẩn bị nguyên liệu tổng hợp .....................................................26 3.1.2. Trình tự tiến hành ..........................................................................26 3.2. Tinh chế sản phẩm ............................................................................... 30 3.3. Phân tích peptid bằng sắc kí lỏng ghép khối phổ ................................ 31 3.4. Phân tích peptid bằng quang phổ lưỡng sắc tròn................................. 33 3.5. Sơ bộ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của Mastoparan C ............................................................................................................................. 34 3.6. Sơ bộ đánh giá hoạt tính gây tan máu hồng cầu người của Mastoparan C ............................................................................................................................. 34 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................ 36 4.1. Tổng hợp và tinh chế Mastoparan C.................................................... 36 4.2. Cấu trúc bậc 1 của Mastoparan C ........................................................ 39 4.3. Cấu trúc bậc 2 của Mastoparan C ........................................................ 39 4.4. Đánh giá hoạt sinh học của Mastoparan C .......................................... 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... PHỤ LỤC ..........................................................................................................
MỞ ĐẦU Ngay từ khi kháng sinh được ra đời, đã có những ghi nhận đối với sự kháng thuốc của các chủng vi sinh vật. Đặc biệt, thực trạng kháng thuốc ngày càng trở nên phức tạp, phổ biến và nhanh chóng lan rộng đến hầu hết các nước trên thế giới trong vòng hai thập kỷ qua. Ngược lại với tốc độ gia tăng mạnh mẽ của tình trạng kháng thuốc, tốc độ xuất hiện những kháng sinh mới lại giảm dần. Điều này đã khiến một số nhà khoa học tin rằng một kỷ nguyên hậu kháng sinh đang đến gần [1]. Tại Hoa Kỳ, ba nguyên nhân chính gây tử vong thời kỳ tiền kháng sinh là bệnh lao, viêm phổi và nhiễm trùng đường tiêu hóa. Ba nguyên nhân trên cộng lại chiếm khoảng 30% tổng số ca tử vong [2]. Tại quốc gia này, ước tính hàng năm, nhiễm trùng kháng thuốc tiêu tốn 20 tỷ Đô la chi phí chăm sóc sức khỏe [3, 4]. Đối với Liên minh châu Âu, con số đó là hơn 1,6 tỷ Euro [5]. Thuốc kháng sinh hiện chiếm hơn 30% tổng ngân sách nhà thuốc bệnh viện ở Hoa Kỳ [6]. Tại Việt Nam-điểm nóng tình trạng kháng kháng sinh, với một quốc gia đông dân trên thế giới, với gánh nặng cao của các bệnh truyền nhiễm, kết hợp với việc sử dụng kháng sinh không hợp lý trong hệ thống chăm sóc sức khỏe, nuôi trồng thủy sản, chăn nuôi và trong cộng đồng [7-9]. Đây là mối đe dọa lớn đối với cộng đồng, không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe, đời sống của người dân mà còn gây tác động tiêu cực đối với sự phát triển tổng thể và bền vững của cả quốc gia. Chính vì vậy, cùng với sự tăng cường công tác quản lý và sử dụng kháng sinh, việc tiến hành những nghiên cứu nhằm phát triển các thuốc điều trị nhiễm khuẩn mới là hết sức cấp thiết. Để tìm ra các thuốc kháng sinh mới, một hướng nghiên cứu nhiều tiềm năng hiện nay là sử dụng các hoạt chất có nguồn gốc từ nọc độc của các loại côn trùng và lưỡng cư [10, 11]. Trong đó, nọc ong chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học về tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh lý, dược lý và điều trị. Trong số nhiều hợp chất có nguồn gốc từ nọc ong đã được biết đến, các peptid là những ứng cử viên sáng giá có đặc tính kháng khuẩn rất tốt. Phần lớn các peptid này có chiều dài 14 acid amin, đa số là các acid amin thân dầu như leucin, isoleucin, valin và alanin [12]. Các peptid này được sản sinh ra từ tế bào biểu mô và thực bào, từ đó tạo ra những đáp ứng miễn dịch cho sinh vật nhằm chống lại các tác nhân gây 1
nhiễm trùng. Vì thế các peptid này gọi là peptid kháng sinh (Antimicrobial peptid) viết tắt là AMP [11]. Mastoparan C (MP-C) là một AMP được phân lập đầu tiên từ nọc ong bắp cày châu Âu Vespa crabro. So với nhiều hợp chất cùng loại từ nọc ong bắp cày khác, MP-C có hàm lượng cao hơn (khoảng 57 nmol (86 μg)/túi) [13]. Tại các báo cáo và nghiên cứu quốc tế trong lĩnh vực khám phá và tìm ra thuốc mới, đã chỉ ra rằng MP- C có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư và gây tan máu. Mặc dù, độc tính gây tan máu là tác dụng bất lợi của MP-C trong việc phát triển MP-C thành thuốc mới. Nhưng nhờ những ưu điểm vượt trội, thì MP-C vẫn là ứng cử viên sáng giá để phát triển thành tác nhân chống vi trùng [13-15]. Do đó, đề tài:” Tổng hợp pha rắn, đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và gây tan máu của peptid Mastoparan C có nguồn gốc từ nọc ong Vespa crabro” được thực hiện với những mục tiêu sau: 1. Tổng hợp MP-C bằng phương pháp tổng hợp peptid pha rắn. 2. Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của MP-C. 3. Đánh giá độc tính gây tan máu của MP-C. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh Vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc kháng sinh là một thách thức toàn cầu do tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao. Cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm đa kháng thuốc đã dẫn đến các bệnh nhiễm trùng khó điều trị hoặc thậm chí không thể điều trị bằng thuốc kháng sinh thông thường [16]. Vì thế, tình trạng kháng kháng sinh đã giết chết ít nhất 1,27 triệu người trên toàn thế giới và liên quan đến gần 5 triệu ca tử vong vào năm 2019 [17]. Tại báo cáo về các mối đe dọa của kháng kháng sinh năm 2019 của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ, có hơn 2,8 triệu ca nhiễm trùng kháng kháng sinh xảy ra mỗi năm. Kết quả là hơn 35.000 người chết. Họ lo ngại về sự xuất hiện và lan rộng của các chủng kháng thuốc mới và các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc đang gia tăng trong cộng đồng. Với tình trang nghiêm trọng này, có thể khiến nhiều người gặp rủi ro hơn. Từ đó, khiến việc xác định và ngăn chặn kháng kháng sinh ngày càng trở nên khó khăn hơn. Trong đó, Việt Nam hiện đang là một trong những quốc gia bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hiện tượng đề kháng kháng sinh. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, nước ta là một trong những nước có tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh cao trên thế giới. Trong khi nhiều nước phát triển vẫn sử dụng kháng sinh thế hệ 1 thì Việt Nam phải sử dụng kháng sinh thế hệ 3,4. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các chủng vi khuẩn tại nước ta có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh. Kháng thuốc xảy ra ở cả chủng vi khuẩn, virus, nấm và kí sinh trùng theo như báo cáo vào ngày 17/11/2021 của Tổ chức Y tế thế giới. Dưới đây, sẽ đề cập tình trạng kháng thuốc của 4 loại vi sinh vật này. 1.1.1. Kháng thuốc ở vi khuẩn Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới 17/11/2021 về tình trạng kháng thuốc hiện nay, đối với các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn thông thường, bao gồm nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và một số dạng tiêu chảy. Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh thường được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng này cao và đã được ghi nhận trên toàn thế giới. Chúng ta có thể quan sát ví dụ điển hình trong nhiễm trùng đường tiết niệu. Như đã biết, ciprofloxacin là kháng sinh thường được sử dụng để điều trị. Tuy nhiên, hiện nay, E.coli có khả năng kháng lại loại thuốc này với tỷ lệ dao động từ 8,4% đến 3
92,9%. K.pneumonia cũng có tỷ lệ kháng ciprofloxacin dao động từ 4,1% đến 79,4%. Nguy hiểm hơn hết, E.coli không chỉ kháng lại ciprofloxacin mà còn kháng fluoroquinolone và cephalosporin thế hệ thứ ba với tỷ lệ kháng 36%. Ngoài ra, tụ cầu vàng S.aureus là chủng vi khuẩn nguy hiểm thường xuyên gây ra nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng bệnh viện nghiệm trọng có tỷ lệ kháng methicilin là 12,11%. Một ví dụ điển hình ở Việt Nam cho tình trạng kháng thuốc là tình trạng kháng thuốc trong điều trị vi khuẩn Helicobacter pylori (HP). Tỷ lệ kháng các thuốc chính sử dụng trong phác đồ tiêu diệt vi khuẩn HP như amoxicillin, clarithromycin, metronidazol, levofloxacin và tetracyclin lần lượt là 15,0%, 34,1%, 69,4%, 27,9% và 17,9%. Vì vậy, tỷ lệ tiêu diệt HP có xu hướng giảm dần theo thời gian. Đặc biệt, ở miền Nam tỉ lệ điều trị thành công giảm từ 88,2% (năm 2009) xuống 62,8% (năm 2011). Ở miền Bắc, năm 2002 tỷ lệ tiêu diệt HP rất cao (98,1%) nhưng giảm còn 67,9% năm 2014 [18]. 1.1.2. Kháng thuốc ở virus Cũng theo báo cáo về tình trạng kháng thuốc của Tổ chức Y tế Thế giới ngày 17/11/2021, tình trạng kháng thuốc đã xảy ra với hầu hết các loại thuốc khángvirus. Đây chính là mối lo ngại đối với hầu hết các bệnh nhân. Đặc biệt, ở bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch, sự nhân lên của virus đang diễn ra trong cơ thể họ, cộng thêm việc họ phải sử dụng thuốc trong thời gian kéo dài dẫn đến việc quen thuốc. Từ đó, dẫn đến tình trạng kháng thuốc càng trở nên nghiêm trọng hơn. Tiêu biểu là các chủng cúm kháng thuốc đã lan nhanh trong cộng đồng. Hiện tại, virus cúm A H3N2 và H1N1 2009 đang lưu hành hầu như nhạy cảm với oseltamivir và zanamivir, nhưng 2 chủng này lại kháng amantadin và rimantadin. Mặc dù, chỉ có rất ít chủng cúm A (H1N1) kháng oseltamivir nhưng loại virus này có khả năng trở nên kháng thuốc phổ biến [19]. 1.1.3. Kháng thuốc ở vi nấm. Trên toàn cầu, gánh nặng nhiễm nấm đang gia tăng. Hơn 300 triệu người được cho là bị nhiễm nấm nghiêm trọng dẫn đến hơn 1.350.000 ca tử vong. Nhiễm nấm có thể gây ra các bệnh cấp tính đe dọa tính mạng cũng như các bệnh mãn tính nghiêm trọng. Hơn 90% trường hợp tử vong do nấm thuộc ba chi: Cryptococcus, Candida và Aspergillus [20] Trong đó, Candida auris là một loài Candida mới đặc biệt kháng thuốc kháng nấm và có thể lây lan nhanh chóng trong môi trường bệnh viện [21]. 4
Theo báo cáo của CDC ngày 30/09/2022 về tình trạng nấm kháng thuốc, có đề cập rằng nấm Aspergillus, một loại nấm được tìm thấy trong môi trường và thường xuyên gây ra các bệnh liên quan đến đường hô hấp. Loại nấm này đã được báo cáo là có thể kháng lại thuốc fluconazol. Hơn nữa, việc sử dụng thuốc chống nấm trong thời gian dài được cho là một yếu tố thúc đẩy kháng thuốc [22]. 1.1.4. Kháng thuốc ở kí sinh trùng. Đối với kí sinh trùng, theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới ngày 17/11/2021, sự xuất hiện của ký sinh trùng kháng thuốc đặt ra một trong những mối đe dọa lớn. Đặc biệt nhất là đối với việc kiểm soát bệnh sốt rét và tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do sốt rét gây ra. Các liệu pháp phối hợp dựa với thuốc artemisinin là phương pháp điều trị đầu tay được khuyến cáo đối với bệnh sốt rét P. falciparum không biến chứng. Liệu pháp artemisinin được hầu hết các quốc gia có tỉ lệ lưu hành sốt rét cao sử dụng phổ biến. Tuy vậy, hiện nay, ở khu vực Tây Thái Bình Dương và ở khu vực Đông Nam Á, tình trạng kháng một phần artemisinin đã được xác nhận ở Campuchia, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam thông qua các nghiên cứu được tiến hành từ năm 2001 đến năm 2019. Qua đây, có thể thấy được rõ hơn về thực trạng kháng thuốc ở cả trong và ngoài nước đang diễn ra theo diễn biến xấu và ngày càng tồi tệ hơn. Chính vì vậy, vấn đề cấp bách và cần được ưu tiên hơn hết ở hiện nay là đẩy mạnh công tác tìm kiếm và phát triển kháng sinh mới. Từ đó, mới có thể tạo ra những tác động tích cực trong công tác điều trị các loại bệnh do vi khuẩn, virus, vi nấm và kí sinh trùng kháng thuốc gây ra. 1.2. Peptid kháng khuẩn 1.2.1. Nguồn gốc của peptid kháng khuẩn Vào năm 1922, peptid kháng khuẩn đầu tiên đã được xác định từ chất nhầy mũi bởi Alexander Fleming. Tuy nhiên, năm 1928, ông lại phát hiện ra penicillin nhờ đó được trao giải thưởng Nobel năm 1945. Do đó, sự khởi đầu của “Kỷ nguyên vàng kháng sinh” vào năm 1940 đã dẫn đến việc mất đi sự quan tâm tiềm năng điều trị của các AMP tự nhiên. Vào những năm 1960, sự gia tăng của các mầm bệnh vi khuẩn đa kháng thuốc đã đánh thức sự quan tâm trở đối với AMP [23] AMP được sản xuất bởi tất cả các sinh vật, từ sinh vật nhân sơ đến con người, đóng vai trò cơ bản trong khả năng miễn dịch bẩm sinh. Chúng tồn tại trong các sinh 5
vật khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật và thực vật, và trong tất cả các loài động vật có vú khác [24]. Nó là một thành phần không thể thiếu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh ở các loài khác nhau bao gồm con người, động vật và thực vật và trở thành tuyến phòng thủ đầu tiên chống lại các cuộc tấn công từ bên ngoài. Peptid kháng khuẩn là những ứng cử viên hấp dẫn để thiết kế các chất kháng khuẩn mới cho ứng dụng cụ thể vì đặc tính kháng khuẩn tự nhiên của chúng. Với cơ chế kháng khuẩn khác với kháng sinh truyền thống thì chúng có khả năng được áp dụng để điều trị các loại vi khuẩn khác nhau và thậm chí cả những loại kháng thuốc [25]. 1.2.2. Cấu trúc của peptid kháng khuẩn Các loại AMP khác nhau có những điểm chung sau: số lượng acid amin của chúng nằm trong khoảng từ 10 đến 60 (trung bình: 33,26) và hầu hết tất cả các AMP đều là cation (điện tích tổng trung bình: 3,32). Tuy nhiên, một số AMP anion cũng tồn tại và chúng có một số acid amin có tính acid như acid aspartic và acid glutamic. Sự đa dạng của AMP tự nhiên gây khó khăn trong việc phân loại chúng. AMP được phân loại dựa trên nguồn gốc, hoạt động, đặc điểm cấu trúc và loại giàu acid amin [26]. Dựa trên cấu trúc thứ cấp của chúng, AMP phù hợp với bốn loại chính – cụ thể là peptid xoắn α, peptid phiến β, peptid hỗn hợp (xoắn α/ phiến β) và peptid vòng [27]. Trong số các nhóm cấu trúc này, cấu trúc xoắn α và tấm β phổ biến hơn. Peptid xoắn α là những AMP được nghiên cứu nhiều nhất cho đến nay. Trong các cấu trúc chuỗi xoắn α, khoảng cách giữa hai acid amin liền kề là khoảng 0,15 nm và góc giữa chúng so với tâm là khoảng 100 độ so với góc nhìn từ trên xuống. Tuy nhiên, một số AMP không thuộc bất kỳ nhóm nào trong 4 nhóm này. Ngoài ra, nhiều peptid chỉ hình thành cấu trúc hoạt động khi chúng tương tác với màng tế bào đích. Ví dụ, indolicin chỉ thể hiện cấu trúc hình cầu và lưỡng tính trong môi trường có lớp lipid kép [28]. 6
Hình 1.1. Cấu trúc không gian ba chiều của peptid kháng khuẩn [29] 1.2.3. Tác dụng sinh học của peptid kháng khuẩn Các AMP tự nhiên thường có phổ hoạt động rộng chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương, nấm, ký sinh trùng nhân chuẩn và virus [30]. Đặc biệt, sức mạnh chính của AMP là khả năng tiêu diệt vi khuẩn đa kháng thuốc. Hoạt động phổ rộng của AMP là một trong những đặc điểm khiến chúng trở thành ứng cử viên thích hợp cho các lựa chọn thay thế kháng sinh [31]. 1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn AMP còn có khả năng nhắm mục tiêu cụ thể vào lớp lipopolysacarit của màng tế bào vi khuẩn. Không như kháng sinh, ngoài tác động lên màng và thành tế bào của vi khuẩn, kháng sinh còn tác động thêm vào quá trình tổng hợp DNA, protein, thành tế bào của vi khuẩn. Chính điều này, làm cho vi khuẩn dễ dàng có cơ hội để kháng lại các loại kháng sinh. Ngược lại đối với AMP, vi khuẩn dường như rất khó để kháng lại được peptid này [28, 32]. Việc sử dụng AMP trong điều trị nhiễm trùng khắc phục và hạn chế được việc vi khuẩn có thể kháng lại thuốc. Ngoài việc tấn công trực tiếp vi khuẩn, AMP có thể bảo vệ bằng các cơ chế thay thế, chẳng hạn như duy trì cân bằng nội môi bình thường ở ruột và điều chỉnh các phản ứng viêm của vật chủ [33-35]. Hiện tại, AMP được nghiên cứu nhiều nhất là những loại có hoạt tính kháng khuẩn. Hầu hết là AMP cation [36]. Phần lớn các AMP này lưỡng tính, có cả miền 7
ưa nước và kỵ nước. Nhờ cấu trúc như vậy cho phép AMP nhắm vào màng tế bào vi khuẩn và gây ra sự phân hủy cấu trúc lớp lipid kép [36, 37]. AMP có hiệu quả đối với các vi sinh vật kháng kháng sinh thông thường [38] và tiêu diệt S.aureus kháng methicillin và P.aeruginosa đa kháng thuốc [24]. Cecropin là một AMP lần đầu tiên chúng được phân lập từ Hyalophora cecropia. Cecropin thể hiện hiệu quả ức chế mạnh đối với E.coli, P.aeruginosa, Bacillus megatherium và Micrococcus luteus [39]. Nhóm AMP nổi bật thứ hai là defensin côn trùng. Defensin chống lại vi khuẩn gram dương và tham gia vào các phản ứng bảo vệ kháng khuẩn ở côn trùng. Ngoài ra, đã có báo cáo rằng persulcatusin, được phân lập từ ve (Ixodes persulcatus), có tác dụng kháng khuẩn đối với S.aureus kháng methicillin và S. aureus kháng vancomycin [38]. Trong một số trường hợp, một số AMP nhất định đã được chứng minh là tiêu diệt cả những vi khuẩn kháng kháng sinh. Ví dụ, cả nisin (một AMP) và vancomycin đều có thể ngăn chặn quá trình tổng hợp thành tế bào. Tuy nhiên, một chủng S. aureus kháng methicillin đã được báo cáo là kháng vancomycin, trong khi nó vẫn nhạy cảm với nisin [28]. 1.2.3.2. Hoạt động kháng nấm Các AMP kháng nấm nhắm mục tiêu vào thành tế bào nấm. Tiêu diệt các tế bào đích bằng cách phá vỡ tính toàn vẹn của màng nấm bằng cách tăng tính thấm của màng sinh chất, hoặc bằng cách hình thành lỗ trực tiếp. Chitin là một trong những thành phần chính của thành tế bào nấm và một số peptid kháng nấm có khả năng liên kết với chitin. Khả năng liên kết như vậy giúp AMP nhắm mục tiêu các tế bào nấm một cách hiệu quả [28].Ví dụ, Indolicidin là một amid tridecapeptid thuộc họ cathelicidin, được phân lập từ các hạt tế bào chất của bạch cầu trung tính ở bò, có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với Trichosporon beigelii, C.albicans, Candida krusei và Aspergillus flavus. Nọc độc của bọ cạp là nguồn cung cấp một lượng lớn AMP có hoạt tính kháng nấm, với các đặc điểm tương tự, chẳng hạn như đặc tính cation và tính linh hoạt của cấu trúc. TistH là một peptid xoắn α được tìm thấy trong nọc độc của bọ cạp Tityus stigmurus. Nó có tác dụng vừa phải đối với C.albicans, Trichophyton rubrum và Aspergillus flavus với tính nhạy cảm rất khác nhau giữa các chủng. Ngoài ra, peptid này còn được đặc trưng bởi tính không gây độc tế bào [40]. 8
1.2.3.3. Hoạt động chống virus Nhiều AMP đã được báo cáo là chất ức chế virus [24]. Các AMP có thể bám vào vỏ bọc của virus và gây mất ổn định màng, khiến virus không thể lây nhiễm tế bào chủ. Bên cạnh đó, AMP cũng có thể làm giảm sự liên kết của virus với tế bào chủ. Ví dụ, defensin liên kết với glycoprotein của virus làm cho virus herpes simplex không thể liên kết với bề mặt của tế bào chủ. Ngoài ra, một số AMP kháng virus có thể ngăn chặn virus xâm nhập vào tế bào chủ bằng cách liên kết với các thụ thể cụ thể trên tế bào động vật. Ví dụ, heparan sulfat là thành phần trên tế bào để các hạt virus herpes simplex gắn được vào. Các phân tử heparan sulfat là các phân tử glycosaminoglycan tích điện âm. Do đó, một số peptid cation xoắn ốc α, ví dụ, lactoferrin, có thể ngăn ngừa nhiễm herpes bằng cách liên kết với các phân tử heparan, từ đó ngăn chặn các tương tác giữa thụ thể virus [28]. 1.3. Mastoparan C 1.3.1. Nguồn gốc của Mastoparan C Mastoparan C(MP-C) là một hợp chất được phân lập từ nọc ong bắp cày châu Âu Vespa crabro. Hàm lượng của MP-C khoảng 57 nmol (86 μg/túi), cao hơn so với nhiều các Mastoparan từ nọc ong bắp cày khác, ví dụ như Mastoparan M và Mastoparan T (từ Vespa mandarin và Vespa tropica), Mastoparan L (Vespula lewisii), Mastoparan X (Vespa xanthoptera) và một số Mastoparan thuộc chi Polistes [13]. Mặc dù MP-C có hoạt động kháng khuẩn thấp hơn và mức độ tán huyết cao hơn nhưng nó có thời gian bán hủy dài và khả năng chống ung thư cao hơn peptid gốc nên MP-C là ứng cử viên sáng giá để phát triển thành tác nhân chống vi trùng [14]. 1.3.2. Cấu trúc của Mastoparan C 1.3.2.1. Cấu trúc bậc 1 MP-C là một peptid gồm 14 acid amin với trình tự Leu-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu- Leu-Ala-Val-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-NH2 hoặc viết ngắn gọn H-LNLKALLAVAK KIL-NH2 trong đó nhóm amino ở đầu N tồn tại dưới dạng tự do, nhóm carboxyl ở đầu C được amid hoá (Hình 1.2). Hợp chất này có công thức phân tử là C72H135N19O15, khối lượng mol phân tử (MW): 1506,99 (g/mol). 9
Hình 1.2. Cấu trúc bậc 1 của Mastoparan C Các thông số khác của MP-C như sau: - Chỉ số thân dầu (H) : 0,634 - Moment thân dầu (µH) : 0,399 - Điện tích toàn phần : +4 - Số acid amin thân dầu : 10 - Số acid amin thân nước : 4, trong đó: + Số acid amin thân nước tích điện dương: 03 + Số acid amin thân nước không tích điện: 01 - Số acid amin đặc biệt (Cystein hoặc Prolin) : Không có - Số acid amin nhân tạo (unnatural amino acid) : Không có. Tương tự như các mastoparan khác, MP-C là một phân tử lưỡng phần với hàm lượng acid amin kỵ nước cao. Đặc tính này tạo điều kiện tốt cho việc liên kết với phospholipid. Sự biến thiên về trị số điện tích dương từ +1 đến +5 cũng như mật độ và sự phân bố điện tích trên toàn phân tử do trình tự của các MP thông thường có từ 1 đến 4 gốc Lysin tại các vị trí khác nhau. Sự biến thiên về trị số điện tích dương là đặc điểm quan trọng đối với khả năng tương tác chọn lọc của các AMP nói chung với tế bào vi sinh vật gây bệnh. Tại các vị trí 2–8–9, 3–10–11, 4–5–11, 4–5–12, 4–11–12, 5–8–9 của Mastoparan thường có 3 gốc Lysin. Đối với MP-C thì vị trí 4-11-12 là phổ biến nhất [13, 41, 42]. 10