Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Kỹ thuật xét nghiệm y học: Ứng dụng kỹ thuật Realtime - PCR để phát hiện đột biến JAK2-V617F trong hội chứng tăng sinh tủy

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:47

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài "Ứng dụng kỹ thuật Realtime - PCR để phát hiện đột biến JAK2-V617F trong hội chứng tăng sinh tủy" bao gồm: Hoàn thiện được quy trình xét nghiệm đột biến JAK2-V617F bằng kỹ thuật Realtime-PCR; ứng dụng được quy trình xét nghiệm gen JAK2-V617F xác định đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính bằng kỹ thuật Realtime-PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Kỹ thuật xét nghiệm y học: Ứng dụng kỹ thuật Realtime - PCR để phát hiện đột biến JAK2-V617F trong hội chứng tăng sinh tủy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI QUANG CÔNG ỨNG DỤNG KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN JAK2-V617F TRONG HỘI CHỨNG TĂNG SINH TỦY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Hà Nội – 2023
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI QUANG CÔNG ỨNG DỤNG KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN JAK2-V617F TRONG HỘI CHỨNG TĂNG SINH TỦY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Khóa: QH.2019.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Dương Quốc Chính 2. ThS. Trần Tuấn Anh Hà Nội – 2023
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Dương Quốc Chính - Giảng viên Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, ThS. Trần Tuấn Anh - Giảng viên thỉnh giảng Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, những người thầy đã luôn hướng dẫn chỉ bảo tận tình, cho tôi nhiều ý kiến nhận xét quý báu cũng như truyền đạt cho tôi tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc trong quá trình tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Thị Hồng Nhung - Giảng viên Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy luôn tận tâm giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Viện Huyết học Truyền máu - Trung ương cho đề tài. Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên làm việc tại thực tập tại Khoa Di truyền - Sinh học phân tử. Tôi xin chân thành cảm ơn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Trường Đại học Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày tháng năm
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT : Allele specific PCR (Phản ứng khuếch đại chuỗi allen đặc AS-PCR hiệu) BCR : Breakpoint cluster region CALR : Calreticulin ADN : Acid deoxyribonucleic TTCNP : Bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát ĐHC : Bệnh đa hồng cầu HCXT : Hội chứng xơ tủy JAK2 : Janus kinase 2 (Gen JAK2) JAK2-V617F : Janus Kinase Valin 617 Phenylalamin Mastermix : Hỗn hợp các thành phần (Enyme, MgCl2, dNTPs) tạo hệ cho phản ứng đệm MPNs : Myeloproliferative neoplasm (Hội chứng tăng sinh tủy) MPL : Myeloproliferative leukemia virus oncogen (Gen MPL) NC : Normal Control (Mẫu chứng âm) PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) RT-PCR : Realtime - PCR POS : Positive (Mẫu chứng dương) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 3 1.1 Tổng quan về hội chứng tăng sinh tủy ................................................... 3 1.1.1 Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học của hội chứng tăng sinh tủy ...... 3 1.1.2. Tổng quan và cơ chế bệnh về gen liên quan đến hội chứng tăng sinh tủy ................................................................................................................. 5 1.2. Tổng quan về gen JAK2-V617F............................................................ 7 1.2.1. Gen JAK2....................................................................................... 7 1.2.2. Đột biến gen JAK2 ......................................................................... 8 1.3. Một số kỹ thuật phát hiện các đột biến gen trong hội chứng tăng sinh tủy .. 9 1.3.1. Polymerase chain reaction (PCR) và AS - PCR ............................. 9 1.3.2. Realtime – PCR ........................................................................... 10 1.3.2.1. Nguyên lý kỹ thuật Real - time PCR....................................... 10 1.3.2.2. Taqman probe (Đầu dò) sử dụng trong Realtime - PCR.......... 11 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 13 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ............................................. 13 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 13 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu .................................................... 13 2.2. Thời gian địa điểm nghiên cứu ........................................................... 14 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 14 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu. ..................................................................... 14 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 14 2.3.3. Đánh giá nồng độ và chất lượng ADN trên máy quang phổ Nano Drop ....................................................................................................... 15 2.3.4. Xét nghiệm phát hiện đột biến gen JAK2-V617F .......................... 15 2.4. Quản lý và phân tích số liệu ............................................................... 16 2.5. Đạo đức trong nghiên cứu .................................................................. 16 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 17 3.1. Mô tả đặc điểm của đối tượng nghiên cứu .......................................... 17
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới ............................................................ 17 3.2.2. Taqpath sử dụng cho xét nghiệm Realtime-PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F .......................................................................................... 19 3.2.3. Tối ưu chu trình nhiệt cho xét nghiệm Realtime-PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F ................................................................................... 20 3.2.4. Khảo sát độ nhạy của quy trình Realtime - PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F .......................................................................................... 22 3.3. Ứng dụng quy trình Realtime-PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F .. 23 3.3.1. Phân bố tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu........................................ 23 3.3.2. Kết quả phân bố tỷ lệ thể bệnh dương tính với JAK2-V617F ........ 23 CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN ........................................................................ 25 4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ................................................... 25 4.1. Hoàn thiện quy trình xét nghiệm gen JAK2-V617F trong hội chứng tăng sinh tủy ..................................................................................................... 25 4.2. Ứng dụng quy trình Realtime - PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F 27 KẾT LUẬN ................................................................................................. 29 KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 31 PHỤ LỤC – DANH DÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU ..................... 34
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc phân tử protein JAK2 ........................................................ 8 Hình 1.2. Gen JAK2 đột biến trên exon 14 ..................................................... 8 Hình 1.3. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime - PCR......................... 11 Hình 1.4. Nguyên lý hoạt động của Taqman probe trong Realtime - PCR ..... 12 Hình 2.1. Sơ đồ tiến hành nghiên cứu ........................................................... 14 Hình 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới ........................................ 17 Hình 3.2. Kết quả sử dụng Taqpath Mutiplex master mix với các mẫu 41-45 19 Hình 3.3. Kết quả sử dụng Taqpath qPCR master mix với các mẫu 41-45 .... 20 Hình 3.4. Kết quả Realtime – PCR sử dụng chu trình nhiệt chuẩn với 10 mẫu chọn ngẫu nhiên ........................................................................................... 21 Hình 3.5. Kết quả Realtime - PCR sử dụng chu trình nhiệt tối ưu với 10 mẫu chọn ngẫu nhiên ........................................................................................... 22 Hình 3.6. JAK2-V617F_ phương pháp AS-PCR ........................................... 23 Hình 3.7. JAK2-V617F_ phương pháp RT-PCR ........................................... 23 Hình 3.8. Phân bố tỷ lệ đột biến của nhóm nghiên cứu.................................. 23
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime - PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F ......................................................................................... 16 Bảng 3.1. Đặc điểm phân bố tuổi của đối tượng nghiên cứu.......................... 17 Bảng 3.2. Phân bố thể bệnh của nhóm đối tượng nghiên cứu ........................ 18 Bảng 3.3. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN ................................................ 18 Bảng 3.4. Chu trình nhiệt sau khi đã tối ưu ................................................... 21 Bảng 3.5. Kết quả phân bố tỷ lệ thể bệnh dương tính với .............................. 24 Bảng 4.1. Độ nhạy của các phương pháp PCR giữa 2 nghiên cứu ................. 27
ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng tăng sinh tủy là một dạng rối loạn dị dòng của hệ huyết học, bao gồm các bệnh lý: bạch cầu kinh dòng tủy (BCKDT), đa hồng cầu (ĐHC), tăng tiểu cầu nguyên phát (TTCNP) và hội chứng xơ tủy (HCXT). Ngoài các thông số huyết học đặc trưng của từng phân típ như sự gia tăng huyết sắc tố trong bệnh ĐHC, sự tăng sản tiểu cầu trong TTCNP, hay sự gia tăng quá mức tế bào megakaryocyte trong HCXT, đột biến gen JAK2 là một đặc điểm di truyền học nổi bật của 3 phân típ bệnh này. Giá trị chẩn đoán của phân tích đột biến JAK2 trong hội chứng tăng sinh tủy (HCTST) hiện là rất tốt, đã được Tổ chức Y tế Thế giới xác nhận và thành lập trong phân loại các khối u ác tính huyết học. Phổ biến nhất là đột biến JAK2-V617F, được tìm thấy ở nhiều bệnh nhân: 65% đến 97% trường hợp ĐHC, 23% đến 57% các trường hợp TTCNP, và 35% đến 57% trong số các trường hợp xơ tủy mạn tính (XTMT) [9]. Bệnh tăng hồng cầu nguyên phát (THCNP) là bệnh ĐHC nguyên phát duy nhất mắc phải, tỷ lệ mắc bệnh là |1-3| trên 100.000 người mỗi năm và được chẩn đoán thường xuyên nhất ở những người trong độ tuổi từ 60 đến 70 tuổi [10]. TTCNP có tỷ lệ mắc hàng năm là |0.5-2.5| trên 100.000 người. Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi (kể cả trẻ em), nhưng bệnh chủ yếu được chẩn đoán ở những bệnh nhân trong khoảng từ 30-60 tuổi. HCXT xảy ra với tỷ lệ mắc |0.5-1.5| trên 100.000 người mỗi năm. Độ tuổi trung bình khi được chẩn đoán thường là >70 tuổi [11]. Theo ước tính của hiệp hội bệnh bạch cầu và ung thư hạch (Leukemia & Lymphoma Society), tại Mỹ số người mắc HCTST là gần 300.000 bệnh nhân, với gần 20.000 ca mắc mới mỗi năm [12]. Thời gian sống sót trung bình của người mắc bệnh ĐHC là 13,5 năm, bệnh TTCTP là 19,8 năm, HCXT là 5,9 năm, với hệ số nguy cơ là 1.8 - khoảng tin cậy 95% [13]. Đồng thời việc phải chịu chi phí điều trị tốn kém sẽ gây ảnh hưởng đến 1
chất lượng cuộc sống của chính bệnh nhân cũng như trở thành gánh nặng kinh tế cho gia đình và xã hội. Những công bố đầu tiên về đột biến trên gen JAK2 (2005) [8], đã làm tiền đề cho những nghiên cứu mới về JAK2, các phòng nghiên cứu và xét nghiệm sinh học phân tử đã xây dựng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến JAK2-V617F trong các mẫu bệnh phẩm của người mắc HCTST. Trong đó đột biến JAK2-V617F được phát hiện bằng kỹ thuật Allen - specific PCR (AS - PCR) đang là phương pháp thường quy được áp dụng tại Viện Huyết Học - Truyền Máu Trung Ương và một số phòng xét nghiệm tại Việt Nam. Khi vận dụng phương pháp AS-PCR tại phòng xét nghiệm chúng tôi nhận thấy được những điểm hạn chế của phương pháp này như: thời gian chạy xét nghiệm lâu, bao gồm nhiều bước, tiêu tốn nhiều trang thiết bị và hóa chất, ngoài ra còn có nguy cơ lây nhiễm chéo khi thực hiện các bước điện di sau PCR. Kỹ thuật Realtime – PCR (RT-PCR) là một trong những phương pháp hữu hiệu để phát hiện đột biến JAK2-V617F. Kỹ thuật RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với PCR truyền thống. Đặc biệt với RT- PCR, phản ứng được thực hiện trong hệ thống kín, không cần thêm các thao tác phân tích kết quả sau phản ứng, do đó rút ngắn được thời gian thực hiện và giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm. Nhận thấy sự ưu việt của RT-PCR so với các phương pháp truyền thống chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Ứng dụng kỹ thuật Realtime - PCR để phát hiện đột biến JAK2-V617F trong hội chứng tăng sinh tủy”. Với 2 mục tiêu: 1. Hoàn thiện được quy trình xét nghiệm đột biến JAK2-V617F bằng kỹ thuật Realtime-PCR. 2. Ứng dụng được quy trình xét nghiệm gen JAK2-V617F xác định đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính bằng kỹ thuật Realtime-PCR. 2
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về hội chứng tăng sinh tủy 1.1.1 Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học của hội chứng tăng sinh tủy Hội chứng tăng sinh tủy (HCTST) là bệnh ảnh hưởng đến cách các tế bào máu được sản xuất trong cơ thể. Các bệnh tăng sinh tủy được coi là rối loạn về dòng tế bào. Rối loạn về dòng tế bào xảy ra khi ADN của một tế bào gốc trong tủy xương có nhiều thay đổi. Các tế bào gốc tạo máu là loại tế bào máu non có khả năng phát triển thành một trong ba dòng tế bào máu chính: hồng cầu, bạch cầu hay tiểu cầu. Các thay đổi ở tế bào gốc (tạo máu) khiến cho tế bào này sinh sản liên tục, tạo ra các tế bào bất thường, từ đó chúng phát triển thành một hay nhiều loại tế bào máu. Bệnh tăng sinh tủy thường tiến triển nặng hơn qua thời gian do số lượng tế bào máu dư thừa tích lũy ở tủy xương và máu ngoại vi. Cơ thể chúng ta thường sản xuất hàng tỷ tế bào máu mỗi ngày. Quá trình này xảy ra bên trong tủy xương. Tủy xương chứa các tế bào gốc phát triển và trưởng thành thành tất cả các tế bào máu mà cơ thể cần: Hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Mỗi loại tế bào này có một công việc cụ thể để thực hiện bên trong cơ thể. Khi một người được chẩn đoán mắc HCTST, có điều gì đó không ổn trong quá trình sản xuất tế bào máu của họ. Tủy xương bắt đầu sản xuất quá nhiều tế bào máu hoặc đôi khi quá ít. HCTST được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào loại ung thư máu vì tủy xương đang sản xuất các tế bào máu một cách không kiểm soát được. Bốn loại HCTST phổ biến được chia thành các rối loạn khác nhau vì mỗi loại ảnh hưởng đến mức độ tế bào máu theo một cách khác nhau. Bốn loại được chẩn đoán thường xuyên nhất này là: 1TTCNP, 2ĐHC, 3HCXT, 4 Bệnh bạch cầu kinh dòng tủy (BCKDT). Bệnh TTCNP là một loại ung thư tăng sinh tủy được đặc trưng bởi sự gia tăng số lượng tiểu cầu, tăng sản megakaryocytic và xu hướng xuất huyết 3
hoặc huyết khối. Triệu chứng và dấu hiệu có thể bao gồm yếu, đau đầu, dị cảm đầu chi, chảy máu, và hồng ban với thiếu máu cục bộ. Hầu hết những người phát triển TTCNP được chẩn đoán ở tuổi 60 trở lên, nhưng có vẻ như chứng rối loạn này đang trở nên phổ biến hơn ở những người trẻ tuổi, đặc biệt là phụ nữ dưới 40 tuổi. Bệnh ĐHC là một rối loạn tăng sinh tủy mạn tính được đặc trưng bởi sự gia tăng hồng cầu bình thường về hình thái (dấu hiệu), nhưng cũng có các tế bào trắng và tiểu cầu. 10 đến 30% bệnh nhân cuối cùng tiến triển thành xơ tủy và suy tủy; 1,0 đến 2,5% chuyển lơ xê mi cấp. Tăng nguy cơ xuất huyết và huyết khối động tĩnh mạch. Các biểu hiện thông thường gồm có lách to, các biến cố mạch máu lớn và vi mạch (ví dụ, các thiếu máu cục bộ thoáng qua, ban đỏ đau, đau nửa đầu mắt) và ngứa dưới nước không rõ nguyên nhân (ngứa khi tiếp xúc với nước nóng). Đa hồng cầu nguyên phát là bệnh phổ biến nhất trong các rối loạn tăng sinh tủy, tỷ lệ mắc ở Mỹ ước tính là 1,9/100.000 với tỷ lệ mắc tăng theo tuổi tác. Nó chủ yếu ảnh hưởng đến người trung niên và người cao tuổi và hầu như không được chẩn đoán ở trẻ em. Hội chứng xơ tủy (HCXT) là một chứng rối loạn ảnh hưởng đến cách các tế bào máu được sản xuất trong cơ thể. Những người trên 60 tuổi có nhiều khả năng mắc bệnh này nhất, nam và nữ đều có nguy cơ mắc bệnh như nhau. HCXT ảnh hưởng đến tủy xương, “nhà máy” bên trong cơ thể chúng ta sản xuất tế bào máu. Bệnh nhân mắc HCXT thường có số lượng hồng cầu, bạch cầu và/hoặc tiểu cầu thấp dẫn đến thiếu máu, giảm bạch cầu trung tính và giảm tiểu cầu tương ứng. HCXT được coi là một bệnh hiếm gặp. Số người được chẩn đoán mắc HCXT mỗi năm sẽ là hai đến ba trường hợp trên 100.000 và bệnh này phổ biến như nhau ở nam và nữ. Nó chủ yếu ảnh hưởng đến người trung niên và người cao tuổi và hiếm khi được chẩn đoán ở trẻ em. Bệnh bạch cầu kinh dòng tủy xuất hiện khi tế bào gốc vạn năng chuyển dạng ác tính và tăng sinh tủy, dẫn tới một sự sản xuất thừa quá mức các hạt bạch cầu hạt chưa trưởng thành. Ước tính tại Hoa Kỳ vào năm 2020 sẽ có khoảng 8.450 trường hợp mắc bệnh bạch cầu kinh dòng tủy mới và khoảng 1.130 trường hợp tử vong. Tuổi trung bình của bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu kinh dòng tủy là 64 tuổi. Nguy cơ trung bình suốt đời của bệnh bạch cầu kinh 4
dòng tủy ở Hoa Kỳ ở cả hai giới là khoảng 0,19% (1 trong 526). 1.1.2. Tổng quan và cơ chế bệnh về gen liên quan đến hội chứng tăng sinh tủy Hội chứng tăng sinh tủy đã được chứng minh là có liên quan đến một số đột biến gen như BCR-ABL và JAK2-V617F. Trong đó, BCR-ABL là nguyên nhân gây ra bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, JAK2-V617F gây bệnh đa hồng cầu, tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy tiên phát. Việc xác định các đột biến soma của gen JAK2-V617F được tìm thấy ở khoảng 90% bệnh nhân đã cải thiện đáng kể phương pháp chẩn đoán cho rối loạn này. Cho đến nay, việc ngăn ngừa các biến cố về mạch máu là mục tiêu chính của điều trị và quản lý bệnh nhân mắc bệnh TTCPNP. Ngoài ra, một số phương pháp điều trị tế bào học chủ yếu được dùng cho những bệnh nhân có nguy cơ cao bị biến chứng mạch máu. Các loại thuốc kích thích tế bào hiện đang được sử dụng bao gồm hydroxyurea, chủ yếu được sử dụng ở bệnh nhân lớn tuổi và interferon α được dùng chủ yếu ở bệnh nhân trẻ tuổi.[1] Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng khoảng các bệnh có liên quan đến hội chứng tăng sinh tủy đều có liên quan đến các gen Janus kinase 2 (JAK2), gen thụ thể thrombopoietin (MPL) và calreticulin (CALR). Cả JAK2 và MPL đều là các protein điều chỉnh quá trình sản xuất tế bào máu. Calreticulin tham gia vào dòng canxi trong tế bào, điều này cũng rất quan trọng trong các tín hiệu tăng trưởng. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng trong bệnh TTCNP khoảng 50-60% bệnh nhân có đột biến (hoặc thay đổi) trong protein JAK2, 25-30% có đột biến gen CALR và 2-5% bệnh nhân khác có đột biến protein MPL. Khoảng 50-60% người mắc HCXT có đột biến (hoặc thay đổi) trong protein JAK2. Hơn 30% bệnh nhân có đột biến ở gen CALR, khoảng 5-10% bệnh nhân có đột biến ở thụ thể hormone tiểu cầu MPL. Trong bệnh PV khoảng 95% những người có đột biến gen JAK2-V617F. Hơn 2% bệnh nhân có đột biến ở một phần khác của gen JAK2 được gọi là exon 12. 5
Trên thực tế, rất nhiều bệnh nhân có thể chuyển từ dạng này sang dạng khác trong hội chứng tăng sinh tủy trong thời gian điều trị. Từ năm 2005, trên thế giới đã biết đến vai trò của gen JAK2 với điểm đột biến V617F trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng tăng sinh tủy. Đột biến gen JAK2-V617F gặp hầu hết ở bệnh đa hồng cầu thực, gây bệnh tăng sinh tủy khoảng 50% ở tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy. Bình thường gen JAK2 có vai trò trong sự phát triển dòng tủy bình thường do truyền các tín hiệu từ các receptor của các Cytokin và các yếu tố phát triển như Interleukin 3 (IL- 3), các yếu tố tạo máu như Erythropoietin, yếu tố kích thích tạo cụm đồng hạt và mônô (GM- CSF, G- CS.F) và Thrombopoetin (yếu tố kích thích tạo dòng mẫu tiểu cầu). Đột biến gen JAK2-V617F làm mất vai trò tự điều hòa của JAK2 gây tăng sinh không kiểm soát các tế bào máu. Tuy nhiên tại sao từ một đột biến có thể gây các bệnh tăng sinh tủy các dòng khác nhau thì vẫn chưa rõ ràng. Hiện nay, có rất nhiều báo cáo đã được công bố góp phần chẩn đoán bệnh di truyền hoặc định hướng chữa bệnh trong lâm sàng, Từ những phát hiện về cấu trúc và chức năng sinh học của các thành phần cấu tạo nên ADN, nhân loại đã từng bước khám phá được nhiều vấn đề khác nhau, đặt nền tảng cho nhiều nghiên cứu khác. Các acid deoxyribonucleic tạo nên gen, giúp duy trì các chức năng của tế bào dưới mức độ phân tử, cũng như quy định cấu trúc di truyền sinh học của tế bào. Cần phân biệt thường biến và biến dị di truyền, thường biến là các biến dị biểu hiện ra ở kiểu hình do tác động của điều kiện môi trường, nó thể hiện mức phản ứng của kiểu gen đối với điều kiện môi trường, thường biến không di truyền. Biến dị di truyền là các biến đổi trong kiểu gen có thể được biểu hiện hoặc không ra kiểu hình, nguyên nhân có thể do ngẫu nhiên hoặc do cơ chế tái tổ hợp trong hệ gen hoặc do tác nhân đột biến lên ADN hay Nhiễm sắc thể như tác nhân hoá học, vật lý, sinh học. Đột biến gen là những biến đổi trong cấu trúc của gen, những biến đổi này có thể xảy ra trong quá trình giảm phân tạo giao tử ở tế bào sinh dục hoặc đột biến trong quá trình phát triển của tế bào sinh dưỡng, hay còn gọi là đột biến soma. Đột biến soma gây nên các biến đổi kiểu hình thể hiện ở mức độ mô hoặc cơ quan trong thế hệ một cá thể chứ không di truyền cho thế hệ sau qua 6
giao tử, thông thường những đột biến gen ít khi tạo ưu thế tiến hoá vì khả năng phá vỡ tính ổn định của bộ gen sinh vật, thay vào đó đột biến thường trung tính hoặc có hại, đối với động vật và con người các đột biến soma thường gây nên các hư hỏng ở mức độ tế bào, mô hoặc cơ quan nào đó ví dụ như ung thư. Qua giao tử đột biến soma được ứng dụng nhiều nhất trong ghép cành, chiết cành ở thực vật, đặc biệt là những cây ăn quả, để đạt giống tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện khắc nghiệt khác. Nếu đột biến gen trội và được biểu hiện ra ngoài cơ thể thì được gọi là thể khảm. 1.2. Tổng quan về gen JAK2-V617F 1.2.1. Gen JAK2 Janus kinase 2 (JAK2) là một protein thuộc nhóm Janus kinase (JAK1, JAK2, JAK3 và TYK2) có hoạt tính tyrosine kinase trong tế bào chất, là thành phần quan trọng, tham gia vào quá trình truyền tín hiệu từ các receptor của các yếu tố kích thích tạo máu (growth factor) và đóng vai trò chủ chốt trong con đường JAK-STAT (truyền tín hiệu và hoạt hóa phiên mã). Gen JAK2 nằm trên cánh ngắn của NST số 9, (9p24) gồm 15 exon, dài khoảng 152kb, chứa các trình tự nucleotid mã hóa cho việc tổng hợp protein JAK2. Chuỗi tín hiệu JAK- STAT bao gồm 3 thành tố: receptor của các yếu tố kích thích tạo máu có trên bề mặt tế bào, Janus kinase (JAK) và 2 protein đóng vai trò là yếu tố truyền tín hiệu và hoạt hóa phiên mã. Protein JAK2 được hoạt hóa ngay khi các receptor trên màng tế bào gắn với các yếu tố kích thích tạo máu. Sau khi được dimer hoạt hóa, JAK2 gắn với các phân tử STAT, phosphoryl hóa để các phân tử này đi vào nhân tế bào, gắn lên ADN và hoạt hóa vùng gen đích, thu nhận tín hiệu, bắt đầu quá trình phiên mã là tăng sinh và biệt hóa tế bào [14, 15]. Protein JAK2 có trọng lượng phân tử khoảng 130 kDa, gồm 1132 acid amin. Cấu trúc phân tử của protein JAK2 là sự hiện diện của 7 vùng (JH1  JH7) trong đó có 2 vùng có cấu trúc và chức năng quan trọng: JH1 là vùng có hoạt tính tyrosine kinase (chứa các tyrosine cần thiết để kích hoạt JAK2), và JH2 là một miền pseudokinase có cấu trúc tương tự như vùng JH1 nhưng là vùng có hoạt tính enzyme và một số chức năng điều chỉnh quan trọng. Ở trạng thái bình thường, hoạt tính tyrosine kinase của vùng JH1 luôn bị ức chế bởi tác dụng của vùng JH2. 7
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử protein JAK2 1.2.2. Đột biến gen JAK2 Vào năm 2005, bốn nhóm nghiên cứu độc lập bằng những phương pháp nghiên cứu khác nhau đã phát hiện đột biến điểm G  T trên exon 14 của gen JAK2 ở vị trí nucleotid 1849. Sự thay thế G  T trên gen JAK2 làm biến đổi acid amin valine ở codon 617 thành phenylalanine xảy ra ở vùng JH2 của protein JAK2, được đặt tên là đột biến JAK2-V617F. Hình 1.2. Gen JAK2 đột biến trên exon 14 [16] Đột biến JAK2-V617F này làm phá vỡ khả năng tự điều hòa của vùng JH2 gây tăng hoạt tính tyrosine kinase của protein này, thậm chí ngay cả khi không có các yếu tố kích thích tạo máu và kết quả là tăng sinh không kiểm soát được các tế bào tạo máu. Đột biến JAK2-V617F có thể hoạt hóa cả 3 8
cytokine receptor dòng tủy (bao gồm: EPO, MPL (Tpo-R) và granulocyte colony stimulating factor receptor (GCSF) – yếu tố kích thích cụm dạng bạch cầu hạt). Dạng đột biến này thường gặp ở 96% bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát, 55% trường hợp ở bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát và 65% các trường hợp xơ tủy nguyên phát. Đây cũng là xét nghiệm giúp phân biệt với bệnh lý đa hồng cầu di truyền do đột biến gen mang thông tin tổng hợp EPO – R. Như vậy, có thể thấy đột biến JAK2-V617F có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh học ở nhóm bệnh nhân tăng sinh tủy mạn ác tính [17]. Người ta quan sát thấy đột biến JAK2-V617F xảy ra từ tế bào gốc sinh máu và trên cả những tế bào nguồn sinh máu đa tiềm năng. Đột biến này được phát hiện trên tất cả các tất cả các dòng tế bào sinh máu, bao gồm cả lympho B và lympho T. Cho đến nay, người ta vẫn chưa phát hiện thấy đột biến JAK2-V617F ở những người khỏe mạnh hay những bệnh nhân có tình trạng tăng sinh tủy phản ứng. Đây là một đặc điểm rất quan trọng giúp chẩn đoán phân biệt các bệnh tăng sinh tủy mạn tính với các bệnh tăng sinh tủy phản ứng [6]. 1.3. Một số kỹ thuật phát hiện các đột biến gen trong hội chứng tăng sinh tủy 1.3.1. Polymerase chain reaction (PCR) và AS - PCR PCR là phản ứng hóa học tổng hợp ADN dựa trên khuôn mẫu ban đầu nhờ hoạt động của enzyme ADN polymerase. Phản ứng dựa trên sự thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ, trải qua 3 giai đoạn: (1) ADN khuôn được biến tính từ sợi đôi thành sợi đơn ở nhiệt độ cao (92º đến 95º). (2) Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 55º đến 65º để tạo điều kiện cho mồi gắn vào ADN khuôn. (3) Nhiệt độ tăng lên khoảng 72º cho enzyme ADN polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài chuỗi ADN nhờ trình tự mồi. Sau 3 bước nhiệt độ, chu trình phản ứng được lặp lại liên tiếp từ 30 – 35 lần. Lượng ADN tạo ra là A x 2n (trong đó A là số khuôn ADN ban đầu, n là số chu kỳ nhiệt của phản ứng). Allele specific PCR (AS – PCR): Là một kỹ thuật cải tiến của PCR thông thường, được ứng dụng trong sàng lọc và phát hiện các đột biến di truyền. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc thiết kế một đoạn mồi có trình tự sai khác so với trình tự đặc hiệu một nucleotid ở đầu 3’ để ngăn cản quá trình kéo 9
dài chuỗi ADN của enzyme Tag polymerase trong phản ứng PCR. Trong phương pháp này, 2 ống phản ứng PCR được thiết kế song song: ống thứ nhất được sử dụng cặp mồi primer đặc hiệu cho allele bình thường, ống thứ hai sử dụng cặp mồi để khuếch đại allele đột biến. Vì vậy, trong phản ứng PCR thường có ít nhất một sản phẩm: Nếu trường hợp dị hợp tử thì 2 ống PCR đều có 1 băng sản phẩm khi điện di, nếu trường hợp đồng hợp mang gen bệnh thì ống thứ hai xuất hiện băng sản phẩm, ngược lại, nếu đồng hợp mang gen bình thường thì chỉ có ống thứ nhất xuất hiện băng đặc hiệu[2, 3]. 1.3.2. Realtime – PCR 1.3.2.1. Nguyên lý kỹ thuật Real - time PCR Realtime - PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng thông qua hệ thống nhận biết của máy. Các sản phẩm của quá trình PCR được gắn huỳnh quang và dựa vào ngưỡng phát hiện huỳnh quang, từ đó sẽ biết được lượng ADN đích ban đầu có trong ống phản ứng. Sử dụng các chất huỳnh quang gắn vào sợi ADN kép nên kỹ thuật PCR định lượng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với PCR truyền thống. Đặc biệt với RT-PCR, phản ứng được thực hiện trong hệ thống kín, không cần thêm các thao tác phân tích kết quả sau phản ứng, do đó rút ngắn được thời gian thực hiện và giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm. Kết quả của RT-PCR được thể hiện qua biểu đồ khuếch đại phản ứng và được biểu thị ngay trên máy sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Biểu đồ này biểu biện cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận nguồn ánh sáng kích thích (trục Y) tương ứng với sự gia tăng của các chu kỳ nhiệt (trục X) của phản ứng. Sự khuếch đại ADN trong phản ứng RT-PCR trải qua 3 giai đoạn chính như sau: - Giai đoạn ủ: Xảy ra trong những chu kỳ đầu của phản ứng. ADN đích được nhân lên và gắn huỳnh quang nhưng số lượng còn ít, cường độ huỳnh quang thấp chưa đủ phát ra ánh sáng để máy ghi nhận. Giai đoạn này được biểu thị bằng một đường nằm ngang trong biểu đồ khuếch đại phản ứng. - Giai đoạn lũy thừa: Khi số lượng bản sao ADN đích đạt đến một ngưỡng nhất định, sản phẩm ADN có gắn huỳnh quang phát ra cường độ 10
huỳnh quang đủ để máy ghi nhận được. Trong giai đoạn này, số lượng bản sao ADN và cường độ huỳnh quang đều tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Lúc này đường biểu diễn khuếch đại phản ứng trong đồ thị bắt đầu đi lên. - Giai đoạn bình nguyên: Là giai đoạn kết thúc của quá trình phản ứng, khi lượng dNTP cạn kiệt dần và enzyme Tag polymerase hoạt động không còn hiệu quả. Giai đoạn này số lượng bản sao ADN đích và cường độ huỳnh quang sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên bằng một đường nằm ngang trong biểu đồ khuếch đại phản ứng [3, 7]. Hình 1.3. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime - PCR 1.3.2.2. Taqman probe (Đầu dò) sử dụng trong Realtime - PCR Taq man probe là những đoạn oligonucleotide có trình tự đặc hiệu với ADN đích (hoặc sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của ADN đích) với đầu 5’ được gắn chất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ được gắn chất hấp phụ huỳnh quang tương ứng (quencher). Khi có mặt của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại dẫn đến sự phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào số lượng probe bắt cặp (phụ thuộc vào số lượng bản sao ADN đặc hiệu hiện diện trong ống phản ứng). 11
Reporter: Có thể sử dụng nhiều loại hóa chất để làm reporter với các thông số chi tiết về bước sóng của nguồn sáng kích thích, bước sóng huỳnh quang phát ra. Quencher: Chất hấp phụ huỳnh quang tương ứng được phát ra từ reporter. Có 2 loại quencher được sử dụng phổ biến:  Quencher phát huỳnh quang: Khi hấp phụ huỳnh quang được phát ra từ reporter, năng lượng chuyển thành dạng ánh sáng.  Quencher phát nhiệt: Năng lượng hấp phụ được chuyển thành dạng nhiệt, có khả năng hấp phụ huỳnh quang mạnh. Nguyên lý hoạt động của Taqman probe trong RT-PCR: (Phát huỳnh quang ở giai đoạn kéo dài). Dưới hoạt tính 5’-3’ exonuclease của enzyme Taq polymerase thủy giải probe, phân tách reporter và quencher. Năng lượng quencher hấp phụ được (dưới dạnh ánh sáng hoặc nhiệt) tỷ lệ thuận với sản phẩm ADN khuếch đại. Hình 1.4. Nguyên lý hoạt động của Taqman probe trong Realtime - PCR Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của probe phải cao hơn nhiệt độ nóng chảy của primer từ 5 - 10ºC. Nếu primer bắt cặp với ADN đích trước thì Taqman probe sẽ không được thủy giải. Ánh sáng huỳnh quang do reporter phát ra đến đâu được quencher hấp phụ ngay đến đó, năng lượng không được chuyển thành dạng ánh sáng hoặc nhiệt. 12