Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:56

Thêm vào BST

Báo xấu

75
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp đại học này được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định được nồng độ của một số chất hữu cơ tự nhiên đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía; xác định nồng độ tối ưu của một số chất hữu cơ tổng hợp đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ THỊ NGỌC Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT HỮU CƠ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY SINH KHỐI IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: K48 - CNSH Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Giảng viên hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Xuân Vũ 2. TS. Nguyễn Văn Hồng Thái Nguyên – năm 2020
i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực tập và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm và các thầy cô trong khoa đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện và chia sẻ những kinh nghiệm của mình để giúp đỡ em trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Xuân Vũ và thầy TS. Nguyễn Văn Hồng đã luôn tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp của mình của mình. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành kì thực tập của mình, cảm ơn bạn bè đã luôn ở bên cạnh cho tôi nhưng lời khuyên và động viên chân thành nhất. Em xin chân thành cảm ơn. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực tập Đỗ Thị Ngọc
ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT BAP: 6-Benzylaminopurine CS: Cộng sự CT: CT VC: Coefficient of Variation (Hệ số biến động) ĐC: ĐC HSNC: Hệ số nhân chồi KC: Knudson C HSN: Hệ số nhân HCHC: Hợp chất hữa cơ LSD: Least Singnificant Difference Test (Sai số trung bình nhỏ nhất có ý nghĩa) MS: Murashige and Skoog’s NAA: Naphlene axetic acid ND: Nước dừa SD: Sắn dây THT: Than hoạt tính TB: Trung bình TQ: trùng quế VW: Vacin & Went
iii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.....................................................................24 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía .....................................................26 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía .....................................................27 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía .........................................................................30 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ............................................................32 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ............................................................33 Bảng 4.7: Ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.....................................................................35
iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ..................................................... ii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iii MỤC LỤC ................................................................................................................. iv Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu của đề tài ...............................................................................................3 1.2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................................3 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................3 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..............................................................................3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..............................................................................3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài...............................................................................3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................4 2.1. Tổng quan về lan Thạch Hộc Tía .........................................................................4 2.1.1. Tên khoa học .....................................................................................................4 2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố..........................................................................4 2.1.3. Giá trị dược liệu của lan Thạch Hộc Tía ...........................................................5 2.1.4. Giá trị kinh tế ....................................................................................................7 2.2. Ảnh hưởng của các chất hữu cơ quá trình nuôi cấy sinh khối lan Thạch Hộc Tía ...... 8 2.5. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía .....................................13 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......18 3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu ........................................................18 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu ......................................................18 3.3. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................................18 3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .............................................................................18 3.5. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................19 3.6. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................20
v 3.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ...........................................20 3.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ...........................................21 3.7. Chỉ tiêu đánh giá ................................................................................................23 3.8. Phương pháp xử lí số liệu...................................................................................23 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................24 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy in vitro sinh khối của lan Thạch Hộc Tía ................................................24 4.2. Kết quả ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ........................................................................26 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. .....................................................27 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía ........................................................................30 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. ..........................................................31 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. ..........................................................33 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. .................................................................35 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................37 5.1. Kết luận ..............................................................................................................37 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................39 PHẦN PHỤ LỤC.....................................................................................................43
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong hàng thập kỉ qua con người đã hướng tới việc sử dụng thực vật để cung cấp các hợp chất thiên nhiên như: polysacarit, carbohydrate, protein, chất béo…để sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Theo WHO thì có tới 80% dân số có xu hướng sử dụng thực vật chứa dược chất để làm thuốc và chăm sóc cho sức khỏe. Do nhu cầu sử dụng của con người ngày càng tăng nên quá trình khai thác và thương mại hóa cũng vô cùng sôi nổi. Tuy nhiên vấn đề đặt ra ở đây việc khai thác và quá trình thương mại hóa không có kế hoạch dẫn đến các loài chứa dược chất bị giảm nhanh chóng về số lượng trong tự nhiên. Thêm vào đó việc biến đổi khí hậu tác động mạnh mẽ đến môi trường sống trong tự nhiên của chúng khiến số lượng của chúng giảm mạnh trong tự nhiên. Điều này buộc các nhà khoa học phải tính đến việc nghiên cứu tạo ra môi trường nhân tạo và điều kiện thuận lợi để nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm có thể đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người. Nuôi cấy mô tế bào thực vật được quan tâm và nghiên cứu từ những năm 1950. Việc nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với canh tác ngoài tự nhiên như: thời gian nuôi cấy ngắn hơn, hạn chế được tác động của môi trường tự nhiên, tránh được ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, và tránh được việc nhiễm các hóa chất động hại như thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật… Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho rằng hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học tích lũy bên trong tế bào thực vật được nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao hơn nhiều so với cơ quan tích lũy của chúng bên ngoài tự nhiên. Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale Kimura et Migo) thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae), phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400m so với mặt biển. Thạch Hộc Tía là loại dược liệu tốt và quý hiếm có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu. Trong Thạch Hộc Tía có khoảng 190 hợp chất, đặc biệt
2 có nhóm polysaccharides, Alkaloids là những nhóm hoạt tính chống oxi hóa có hiệu quả cao phòng và điều trị các bệnh về đường huyết, tim mạch và ung thư. Thạch Hộc được chế biến thành phong đấu giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000 USD/kg. Một cây Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch Hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại lợi nhuận cho những người trồng và chế biến Thạch Hộc. Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15.000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD. Tuy nhiên việc sản xuất loại dược liệu này từ trước tới nay chưa được quan tâm đầu tư thích đáng khiến Thạch Hộc Tía có nguy cơ bị tuyệt chủng và được đưa vào danh mục đỏ của “Sách đỏ Việt Nam”. Với giá trị to lớn của Thạch Hộc Tía, các nghiên cứu về bảo tồn, khai thác và phát triển loài lan này đã và đang được thực hiện mạnh mẽ. Trong đó việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống và sản xuất sinh khối, hợp chất tự nhiên từ lan Thạch Hộc Tía đã có những thành công nhất định. Nhiều nhà nghiên cứu đã công bố thành công trong việc sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng nhằm nâng cao hệ số nhân giống lan Thạch Hộc Tía [31], [ 24]. Bên cạnh đó cũng có nhiều kết quả nghiên cứu khác nhau trong việc sử dụng các chất hữu cơ (nước dừa, khoai tây, carot,…) với mục đích nhân giống lan Thạch Hộc Tía. Ngoài các công trình nghiên cứu về nhân giống lan Thạch Hộc Tía, các nghiên cứu về nhân sinh khối trên đối tượng này còn hạn chế. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu được công bố về ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía in vitro. Xuất phát từ thực tế trên, việc thực hiện “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” là cần thiết và có tính khả thi cao. Thành công của đề tài không những tăng cường khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía in vitro mà còn giảm thiểu tác hại có thể có trong việc sản xuất sinh khối an toàn Thạch Hộc Tía in vitro xuất phát từ việc sử dụng chất điều tiết sinh trưởng tổng hợp, cung cấp nguồn sinh khối lan Thạch Hộc Tía sạch sử dụng với mục đích chăm sóc sức khỏe và làm đẹp cho con người.
3 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Xác định ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của lan Thạch Hộc Tía trong môi trường in vitro. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Xác định được nồng độ của một số chất hữu cơ tự nhiên đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Xác định nồng độ tối ưu của một số chất hữu cơ tổng hợp đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài sẽ xác định được nồng độ ảnh hưởng của các loại chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía, bổ sung cơ sở khoa học cho việc sử dụng các hợp chất hữu cơ trong nuôi cây mô lan Thạch Hộc Tía nói riêng và nuôi cấy mô thực vật nói chung. Đồng thời kết quả của đề tài là nguồn tài liệu khoa học có giá trị có thể tham khảo cho các nghiên cứu trên đối tượng này trong tương lai. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Thực hiện đề tài nghiên cứu giúp cho sinh viên có cơ hội củng cố lại kiến thức cũ , học hỏi được những kiến thức mới, và tích lũy được kinh nghiệm cho bản thân. Kết quả của đề tài có thể dùng làm cơ sở khoa học cho quá trình nhân sinh khối các loài thực vật chứa dược chất quy mô lớn. Góp phần bảo tồn nguồn gene, cũng như thúc đẩy phát triển nuôi cấy cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về lan Thạch Hộc Tía Theo từ điển Bách khoa dược học của Việt Nam (1999) đã ghi “Thạch Hộc” (Dendrobium nobile Lindt) có tên khác là Kim Thạch Hộc [28]. Thạch Hộc sống phụ sinh trên thân gỗ hoặc trên các vách đá ở vùng rừng có độ ẩm cao. Hiện nay trên khắp thế giới có khoảng 1.400 loài Lan, ở Trung Quốc có khoảng 81 loài. Trong chi Thạch Hộc cũng có rất nhiều loài được dùng để chữa bệnh. Tại Trung Quốc, chi Thạch Hộc có khoảng 12 loài phụ và 14 loài chính, trong đó có tới 11 loài được xem là dược liệu quý. Đặc biệt, Thạch Hộc Tía là loài được đánh giá cao nhất và cũng có giá trị kinh tế lớn nhất. Tại Việt Nam cũng có nhiều loài Lan. Chúng được phân bố rộng rãi, trải dài từ Bắc vào Nam. Có nhiều loại sắp hoặc đã bị tuyệt chủng, một số khác thì đang được liệt vào sách đỏ cần phải được bảo tồn. Trong số những loài này, chúng ta cần kể đến loài lan Thạch Hộc Dendrobium nobile Lindl. Nó phân bố chủ yếu ở vùng trung du và miền núi phía Bắc, được nghiên cứu nhân giống nhằm mục đích làm thuốc. 2.1.1. Tên khoa học Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là một loài thuộc chi Dendrobium, họ lan (Orchidaceae). 2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố Đặc điểm hình thái Là cây phụ sinh trên thân gỗ hay vách đá, cao 30-50 cm, thường mọc thành bụi. Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5-3 cm. Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12cm, rộng 2-3cm trên có 5 gân dọc. Lá mọc so le thành dãy đều ở hai bên thân. Hoa to màu hồng, mọc thành chùm trên những cuống dài, ở họng hoa có những điểm màu tím. Hoa rất đẹp, to, màu hồng hay điểm hồng. Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4-5cm, rộng 3cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía [5], [13].
5 Quả nang hình thoi, khi khô tự mở. Hạt nhiều, mùa hoa tháng 2-4, mùa quả: tháng 4-6 Đặc điểm phân bố Thạch Hộc được phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanma và nhiều nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [13]. Ở Trung Quốc chi Thạch Hộc chủ yếu phân bố ở các tỉnh: Chiết Giang, Quảng Tây, Hồ Nam, Vân Nam, Quý Châu. Thạch Hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán. Trong tự nhiên Thạch Hộc thường sinh trưởng trong môi trường có độ ẩm khoảng 70%, lượng mưa khoảng 900 – 1.500mm, nhiệt độ từ 12 – 18ºC. Do đó nó thường tập trung ở các phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và các vách đá chua. 2.1.3. Giá trị dược liệu của lan Thạch Hộc Tía Thành phần hóa học Trong Thạch Hộc có chất nhầy và chất ankaloit gọi là dendrobin khoảng 0,3% có CT thô C16H25O22. Theo báo cáo của Viện nghiên cứu y học, hệ dược học Bắc Kinh năm 1958 thì trong Thạch Hộc Dendrobium nolile có 0,05% ankaloit, không có saponin và không cho phản ứng tanin đới [13]. Tác dụng dược lý Năm 1936, hai tác giả Kinh Lợi Bâu và Lý Đăng Bảng đã báo cáo dùng cao Thạch Hộc chế bằng rượu 1ml = 4g dược liệu tiến hành thí nghiệm tác dụng giảm sốt thì thấy với liều 2,5ml trên 1kg thể trọng, tiêm vào màng bụng thỏ đã được gây sốt bằng dung dịch 0,03% trực trùng coli (2,3ml đối với 1kg thể trọng) không thấy có tác dụng giảm sốt [13]. Trên tràng thỏ cô lập, với nồng độ thấp (0,0001-0,5%) thì thấy có tác dụng kích thích, sự co bóp được tăng cường. Nhưng với nồng độ cao: 1-10% thì lại thấy tác dụng ức chế [13].
6 Đối với tim cô lập của loài cóc Bugo sp. (dùng dung dịch Locke-Ringer) bất kể nồng độ như thế nào đều thấy sử dụng ức chế co bóp. Hiện tượng ức chế này hình như liên quan với thần kinh phó giao cảm vì thuốc chế từ thạch học đều có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của pilocacpin, atropin và adrenalin trên cơ ruột, trên tim. Tuy nhiên tác dụng ức chế đối với adrenalin có kém hơn. Khi tiêm dung dịch Thạch Hộc trên tim của loài cóc thấy dù nồng độ nào từ 0,01-10% đều không thấy ảnh hưởng [13]. + Tăng cường khả năng miễn dịch: Nghiên cứu về dược lý hiện đại cho biết, Thạch Hộc có tác dụng tốt về chống mệt mỏi và chống chịu ngạt oxy [13]. + Hệ gan lợi mật: Thạch Hộc có tác dụng lợi mật, tư dưỡng can âm, là dược thảo tốt điều trị các bệnh gan, mật, chữa trị viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật [13]. + Kháng phong thấp: Thạch Hộc có khả năng tư dưỡng âm dịch, bôi trơn các khớp, giúp cho gân cốt khỏe, khớp nối thanh thoát, có hiệu quả tăng cường kháng phong thấp [13]. + Giảm đường huyết, mỡ máu: Kết quả nghiên cứu lâm sàng cho biết Thạch Hộc không những có hoạt tính tăng cường Insulin, đồng thời có khả năng giảm đường huyết giúp cho máu hoạt động bình thường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản, giảm cholesterol và triglyceride [13]. + Kháng u bướu: Thạch Hộc có khả năng tiêu diệt một số tế bào ác tính của ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng với hoạt tính kháng ung thư tương đối mạnh. Trong lâm sàng sử dụng Thạch Hộc rỉ sắt làm thuốc điều trị bổ sung các bệnh ung thư ác tính, cải thiện tình trạng của người bệnh, giảm nhẹ tác dụng phụ của các liệu pháp xạ trị, hóa trị, tăng sức miễn dịch, nâng cao chất lượng cuộc sống, kéo dài tuổi thọ [13]. + Bảo vệ mắt: Thạch Hộc có công năng dưỡng âm, là thảo mộc quý bảo vệ mắt, có hiệu quả tương đối tốt để chữa bệnh lòa của tuổi già, bảo vệ mắt cho trẻ em. + Tự dưỡng da: Khi vào tuổi trung niên, âm dịch sa sút, da lão hóa, nám da và nhăn da. Thạch Hộc có chất nhờn, có tác dụng tư nhuận dinh dưỡng da [13].
7 + Kháng suy não: Thạch Hộc là thần dược có tác dụng trẻ hóa cơ thể. Trong Thạch Hộc có nhiều nguyên tố vi lượng quý có tác dụng chống lão hóa tốt hơn nhiều so với các loại thuốc khác [13] + Thạch Hộc ngoài tác dụng trên thì nó còn được sủ dụng như một loại thực phẩm bổ vào để bồi bổ sức khỏe. Chẳng hạn như nấu súp với hồng sâm, bách sa có tác dụng lợi phổi, sinh tân. Bên cạch đó với những kĩ thuật hiện đại ngày nay Thạch Hộc còn được sự dụng dưới dạng trà thảo mộc, cháo dinh dưỡng ăn liền bổ sung Thạch Hộc. Ngoài ra ngành y học phát triển không ngừng thì hiện nay cũng có rất nhiều dòng sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ Thạch Hộc. Chúng là những sản phẩm bổ dưỡng và cũng an toàn cho sức khỏe, do đó bạn có thể tham khảo và sử dụng. 2.1.4. Giá trị kinh tế Trong các loại hoa phong lan được trồng tại Việt Nam thì lan công nghiệm cho hiệu quả kinh tế tương đối cao. Giá của một chậu lan có thể cho thu nhập từ 100.000 1.000.000 đồng/cây [4]. Giá xuất khẩu vào những năm 80 đạt mức 3.000 USD/kg. Ở Đài Loan giá từ 1.000 -3.000USD/kg. Ở Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg. Giá 1 cây Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây Thạch Hộc, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch Hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại siêu lợi nhuân cho những người trồng và chế biến Thạch Hộc. Nhu cầu thị trường Trung Quốc hiện nay cần khoảng 2.000 tấn/năm, nhưng mới sản xuất được 200 tấn/năm. Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15.000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD [13]. Với loài hoa chủ lực là Dendrobium, Thái Lan xuất khẩu đạt doanh thu gần 600 triệu USD mỗi năm. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệm Hoa Kỳ, năm 2000, tổng sản lượng bán ra thị trường tương đương 100 nghìn USD. Bên cạnh đó, ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý đều nhập khẩu rất nhiều phong lan [26].
8 2.2. Ảnh hưởng của các chất hữu cơ quá trình nuôi cấy sinh khối lan Thạch Hộc Tía Trong nuôi cấy sinh khối thực vật nói chung và lan Thạch Hộc Tía nói riêng chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau: yếu tố vật lý (nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng,…) và yếu tố hóa học (thành phần môi trường nuôi cấy). Trong thành phần môi trường nuôi cấy có nhiều yếu tố khác nhau: khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều tiết sinh trưởng và chất hữu cơ. Trong đó, chất hữu cơ là có vai trò rất quan trong và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy sinh khối, đặc biệt là nuôi cấy sinh khối các dòng thực vật sử dụng làm thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm. Các chất hữu cơ đã và đang được nghiên cứu phục vụ trong nuôi cấy mô tế bào gồm * Nước dừa Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cho biết trong nước dừa có nhiều protein, carbohydrate, calcium, các hợp chất sắt, đường, và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic. Các chất này có thể đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào. Tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận. Ngoài ra nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng.. Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi [9]. Nước dừa là thành phần dinh dưỡng hữu cơ được bổ sung trong nhiều môi trường nuôi cấy mô đặc biệt đối với các loài phong lan. Cụ thể như sau: - Trong nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ liên quan đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) in vitro nhằm nghiên cứu về ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi lan hài hồng. Trong các nồng độ nước dừa được khảo sát, nồng độ 200 ml/l, thích hợp nhất cho sự tạo chồi, tạo lá và tăng trưởng chiều cao của chồi. Khi tăng nồng độ nước dừa lên trên 200 ml/l, quá trình tạo chồi bị hạn chế. Trong nghiên cứu này, số lượng chồi đạt cao nhất (3,2 lầncấy) ở CT có bổ sung 200 ml/l nước dừa. Từ kết quả trên có thể thấy, bổ sung nước dừa có khả năng kích thích quá trình sinh
9 trưởng và khả năng tạo chồi của lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Điều này được giải thích bởi trong các dịch chiết này có chứa các chất có lợi cho sự sinh trưởng phát triển của cây như các amino acid, các loại vitamin, đường và các chất kích thích sinh trưởng (nhóm cytokinin), cũng như các chất khoáng vô cơ như photpho, magiê, kali và natri [2]. - Kết quả cho thấy, khi môi trường không bổ sung ND (CT1), các chỉ tiêu số lá TB (trung bình)/chồi và chiều dài lá TB chỉ đạt lần lượt là 2,27 lá và 1,4cm. Khi bổ sung ND với các nồng độ 5% (CT2), các chỉ tiêu số lá và chiều lá đã tăng rõ rệt với kết quả là 3,1 lá; 1,6cm. Tốc độ lớn của chồi lan nhanh nhất khi môi trường có bổ sung 10% ND, thể hiện ở chỉ số số lá TB/chồi là cao nhất (3,63 lá/chồi) và chiều dài lá TB là 2,7cm. Khi tăng nước dừa lên đến nồng độ 15%, 20%, các chỉ tiêu về số lá và chiều dài lá TB cao hơn CT1 (ĐC) nhưng vẫn thấp hơn CT3 ở mức có ý nghĩa, đúng với nghiên cứu của Parisa (2014) [43] khi bổ sung nước dừa làm tăng khả năng nhân nhanh giống lan Phalaenopsis lai. Vậy môi trường MS + 10% ND là thích hợp nhất cho nuôi lớn chồi nghiên cứu [22]. * Dịch nghiền chuối Dịch nghiền chuối có chứa nguồn chất sơ lành mạnh, giàu kali, Vitamin B6, Vitamin C, chất chống oxy hóa và các phytonutrients. Theo nghiên cứu của Benrt (1975) cho rằng dịch nghiền chuối có tác dụng kích thích chồi với khả năng tạo protocorm và sinh trưởng chồi. Theo Hoàng Thị Giang và cs trong nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng lan hài quý đã nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến hệ số nhân của lan hài với các nồng độ: 50, 100, 120, 150g/l môi trường. Kết quả khi bổ sung 100g/l chuối xanh hệ số nhân chồi cao làm chiều cao chồi thấp chỉ đạt 2,67cm. Qua quan sát thấy CT 4, 5 chồi Thạch Hộc có hiện tượng ra rễ, chất lượng chồi tốt; thân mập, lá xanh đậm, phát triển tốt [7]. * Dịch chiết của khoai tây Dịch chiết của khoai tây có chứa cacbonhydrat dưới dạng saccaroza, glucose và fructose, rất giàu amino axít acid amin như lysine, methionine, threonin, tryptophan, vitamin c, vitamin B6, các muối khoáng (K, Fe, Mg…). Dịch chiết khoai tây thường
10 được bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan. Vì vậy dịch chiết khoai tây được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật khác nhau cụ thể như: - Nghiên cứu nhân giống lan Thạch Hộc từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô có sử dụng dịch nghiên khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm mục đích tăng thêm hàm lượng các cacbonhydrat, acid amin, và vitamin. Từ kết quả của đề tài cho thấy với nồng độ dịch chiết khoai tây 50g/l thích hợp cho hệ số nhân nhanh chồi tăng lên đáng kể [9]. - Ngoài ra một số môi trường nuôi cấy các loại lan khác như: phi diệp, lan kim tuyến,… cũng sử dụng dịch chiết khoai tây với nồng độ 100ml/l bổ sung trong môi trường nền trong quá trình nghiên cứu và nhân giống [20], [14]. * Casein Casein được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid. - Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên khả năng tăng sinh khối và giảm sử dụng nguồn nitrate vô cơ trong qui trình sản xuất sinh khối cây lan kim tuyến Casein hydrolysate với các nồng độ khác nhau (0, 1, 3, 5, 7 g/L) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã cho thấy hiệu quả đối với sự gia tăng sinh khối lan kim tuyến. Sau 6 tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu tăng trưởng của cây được theo dõi, ghi nhận. Kết quả cho thấy nồng độ casein hydrolysate thích hợp cho sự tăng trưởng của cây lan kim tuyến khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 5g/l [21]. * Myo-inosytol Myo-inositol (inositol) là một carbohydrate giống như đường được tạo ra bởi hầu hết các loại cây. Nó có vị đã được khảo nghiệm bằng một nửa vị ngọt của đường (sucrose). Myo-inositol (inositol) là một thành phần quan trọng đối với sự tăng trưởng và phát triển bình thường của cây. Inositol cũng là một phân tử thiết yếu để sản xuất thành tế bào thực vật. Vách tế bào thực vật được làm chủ yếu bằng các chuỗi đường được gọi là polysaccharides. Một dạng oxy hóa của inositol là đường phổ biến và quan trọng nhất liên quan đến việc sản xuất polysaccharide cho thành tế bào. Ngoài việc tổng
11 hợp thành tế bào, các đường dẫn xuất inositol này cung cấp các thành phần quan trọng khác liên quan đến lưu trữ, vận chuyển và phát triển. - Với tầm quan trọng của Myo-inositol được sử dụng trong nhiều môi trường phục vụ cho nhanh nhanh sinh khối một số loài thực vật khác nhau như: + Tăng hệ số nhân nhanh chồi chuối Laba (Musa SP.) nuôi cấy in vitro bằng sử dụng ánh sáng, myo-inositol và adenin sulphate. Khảo sát ảnh hưởng của myo- inositol đến khả năng nhân nhanh sinh khối chồi. Kết quả cho thấy việc sử dụng Myo- inositol với nồng độ 0,1g/l thu được chồi có chiều cao vượt trội so với các nồng dộ thử nghiệm khác. Ngoài ra, Myo-inositol còn có tác động tích cực đến quá trình hình thành lá của chồi [6]. Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp. - Ngoài ra dịch chiết nấm men cũng được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phổ biến như: + Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự phát triển của cây lan gấm (A. roxburghii) được thược hiện nhằm đánh giá vai trò của dịch chiết nấm men trong môi trường nuôi cấy cây lan gấm không có chất điều hòa. Dịch chiết nấm men được khảo sát với 3 nồng độ khác nhau 1, 3, 5 g/l đã cho thấy những tác động tích cực lên sự phát triển sinh khối của cây lan gấm. Sau 8 tuần nuôi cấy, mẫu ban đầu có khối lượng 0,3 – 0,4 g/cây được cấy trên môi trường Albert’s bổ sung hàm lượng dịch chiết nấm men riêng lẻ thích hợp cho cây lan gấm phát triển là 1 g/l cho khối lượng tươi và khối lượng khô đạt 0,56 g/cây và 0,074 g/cây [23]. Môi trường nuôi cấy bao gồm các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin. Việc bổ sung cao nấm men vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng hàm lượng nitơ trong môi trường có chứa hàm lượng nitơ tương đối thấp hoặc không có nitơ để thúc đẩy sự tăng trưởng của cây trồng. Sau 6 tuần nuôi cấy, mẫu cấy trên các môi trường có bổ sung cao nấm men tăng trưởng tốt hơn so với môi trường không bổ sung cao nấm men. Kết quả ghi nhận được cho thấy, cây lan kim tuyến tăng trưởng tốt nhất trên môi trường Albert’s chứa
12 muối nitrate theo các tỉ lệ (100%; 75%; 50% và 25%) kết hợp bổ sung 5 g/L cao nấm men. Kết quả cho thấy lan kim tuyến tăng cao về lượng sinh khối [21]. * Tảo spirulina Tảo spirulina: Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong các thực phẩm hiện nay, 56%-77% trọng lượng khô, cao hơn 3 lần thịt bò, cao hơn 2 lần trong đậu tương... - Hàm lượng vitamin rất cao. Cứ 1 kg tảo xoắn Spirulina chứa 55 mg vitamin B1, 40 mg vitamin B2, 3 mg vitamin B6, 2 mg vitamin B12, 113 mg vitamin PP, 190 mg vitamin E, 4.000 mg caroten trong đó β-Caroten khoảng 1.700 mg (tăng thêm 1.000% so với cà rốt), 0,5 mg axít folic,inosit khoảng 500-1.000 mg. - Hàm lượng khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thông thường sắt là 580–646 mg/kg(tăng thêm 5.000% so với rau chân vịt), mangan 23– 25 mg/kg, Mg 2.915-3.811/kg, selen là 0,4 mg/kg, canxi, kali, phốtpho đều khoảng là 1.000-3.000 mg/kg hoặc cao hơn (hàm lượng canxi tăng hơn sữa 500%). - Phần lớn chất béo trong Spirulina là axít béo không no, trong đó axít linoleic 13.784 mg/kg, γ-linoleic 11.980 mg/kg. Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm tự nhiên khác. - Hàm lượng cacbon hydrat khoảng 16,5%, hiện nay đã có những thông tin dùng glucoza chiết xuất từ tảo Spirulina để tiến hành những nghiên cứu chống ung thư. - Tảo Spirulina có chứa phong phú các axít amin cần thiết như lysin, threonin. - Với hàm lượng dinh dưỡng cao trong tảo nên hiện nay tảo cũng được sử dụng như một chất hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật cụ thể như: + Khảo sát ảnh hưởng của tảo spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Tảo spirulina được bổ sung ở các nồng độ 10 mg/l, 30 mg/l, 50 mg/l và 70 mg/l. Ảnh hưởng của tảo spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triền của chồi lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy, bổ sung của tảo spirulina có tác động tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan hài hồng in vitro. Khi tăng nồng độ tảo spirulina, các chỉ tiêu theo dõi như số lá, số chồi, chiều
13 cao chồi và tỷ lệ sống của mẫu cấy cũng tăng theo tương ứng và đạt tốt nhất khi bổ sung 50 mg/l bột tảo. Nếu tiếp tục gia tăng nồng độ tảo cao hơn 50 mg/l, các chỉ tiêu tăng trưởng trên bắt đầu giảm. Bột tảo spirulina làm gia tăng tỷ lệ sống của mẫu cấy và đạt 100%, đây là chỉ tiêu sinh trưởng rất quan trọng trong giai đoạn nhân chồi cây lan hài hồng. Điều này có thể giải thích, trong thành phần của tảo có chứa nhiều amino acid tự do, các loại vitamin như vitamin A, vitamin B và vitamin E làm gia tăng quá trình trao đổi chất, chống hóa nâu của mẫu cấy, giúp mẫu cấy hấp thụ dưỡng chất tốt hơn làm cho mẫu cấy sinh trưởng và phát triển mạnh làm gia tăng tỷ lệ sống [2]. 2.5. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía Năm 2014, Parisa Shekarriz nhân giống hạt lan Hồ Điệp trên môi trường 1/2MS bổ sung 100ml/l nước dừa, pepton giúp tăng tỷ lệ nảy mầm của lan Hồ Điệp [29]. Năm 1999, Mai Thị Tâm và cs nghiên cứu trên giống lan Dendrobium E.R. Đối tượng nghiên cứu là chồi và quả của giống Dendrobium E.R, tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu là protocorm. Môi trường cơ bản là VW có cải tiến với 1% sacarose, 15% nước dừa và các hàm lượng khác nhau của BA. Kết quả cuối cùng tìm ra được các môi trường thích hợp cho quá trình tạo nguồn vật liệu khởi đầu, quá trình nhân nhanh tạo cây hoàn chỉnh [24]. Cũng trên giống này, với vật liệu là các protocorm đều, xanh mập, có mầm chồi, nghiên cứu đã xác định được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, phụ gia như đường saccarose, nước dừa, NAA, axit Nicotinic đến sự phát sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của cây. Trên môi trường VW, tìm ra hàm lượng các chất bổ sung hợp lý giúp cây sinh trưởng tốt, tăng cường sức sống và tạo cây hoàn chỉnh. Năm 2003, Nguyễn Quang Thạch và cs nghiên cứu trên giống lan hồ điệp (Phalaenopsis) với quả sau khi thụ phấn trên 100 ngày là đủ độ chín thuần thục và có khả năng nảy mầm tốt nhất (95 - 100 %), thời gian khử trùng thích hợp cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, mẫu sạch sống cao là khử trùng kép 5 phút + 1 phút việc sử dụng nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng (lá non, mắt ngủ trên phát hoa và đỉnh hoa)
14 và cơ quan sinh sản hữu tính (hạt), kết quả VW + 100 ml nước dừa + 10 g đường saccarose + 6,5g agar +30 g khoai tây + 30 g cà rốt + 1g pepton thích hợp cho nhân cụm chồi in vitro [22]. Năm 2007, Nguyễn Thị Tâm và cs nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và giá thể đến sinh trưởng của cây lan Dendrobium hybrid in vitro. Sử dụng môi trường nền là VW (Vacin Went) + đường sacaroza 20 g/l + agar 9g/l + nước dừa 100 ml/l + than hoạt tính 2 g/l. Nồng độ BAP 2 mg/l và kinetine 3 mg/l thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lan Dendrobium hybrid, cho hệ số tạo chồi và lá mới cao nhất (sau 6 tuần nuôi cấy). Khi bổ sung kết hợp NAA 0,3 mg/l với BAP 2 g/l cho hệ số nhân chồi và tạo lá cao nhất (1,80 và 2,04). Bổ sung NAA 0,3 mg/l có ảnh hưởng tốt đến khả năng ra rễ và phát triển của bộ rễ (số rễ đạt 15,83 cái/cây và chiều dài rễ đạt 2,3 cm). Khi ra cây trên 3 nền giá thể: rêu ngoại, rêu ngoại: xơ dừa (1:1), xơ dừa đều cho tỷ lệ sống khá cao (57,89 % - 67,67 %). Trong đó, giá thể rêu ngoại đạt tỷ lệ sống cao nhất 67.67 % [25]. Năm 2009, Nguyễn Thanh Tùng và cs, nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro cây Mỹ Dung Dạ Lan Vanda denisoniana benson. Đã xác định được: Khử trùng quả Mỹ Dung Dạ Lan bằng HgCl2 với nồng độ 0,5% trong 10 phút cho tỷ lệ sống và tỷ lệ không nhiễm cao (81,82 %). Môi trường MS bổ sung kinetine 0,5 -1,5 mg/l cho tỷ lệ nảy mầm cao (>75 %), cao nhất ở nồng độ 0,5 mg/l (đạt 92,31 %). Nồng độ NAA tối ưu cho quá trình nảy mầm của hạt là từ 0,1-0,5 mg/l (tỷ lệ nảy mầm > 85%). MS +BAP 0,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất (2,7 chồi/protocorm). Nồng độ kinetine tối ưu cho nhân nhanh Mỹ Dung Dạ Lan là 0,5 mg/l [27]. Năm 2010, tác giả Ngô Xuân Bình và cs nghiên cứu kĩ thuật nhân giống phong lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa blume [1]) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Xác định được môi trường MS là tối ưu nhất cho sự nảy mầm của hạt lan. Đồng thời, nhóm tác giả cho rằng cytokine có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tái sinh hạt. Tuy nhiên, khi sử dụng kết hợp giữa BA và Kinetine với tỷ lệ kinetine 0,1 mg/l + BA 0,3 mg/l cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất đạt 86.7 % [1].