Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp đại học này được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng; xác định được ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh phôi của cây Hài Trần Liên; xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng nhân nhanh Hài Trần Liên. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------o0o--------- ĐỖ NGỌC HÀ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI TRẦN LIÊN (Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH – CNTP Khoá học : 2015 – 2020 Giảng viên HD : ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020
i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro”. Lời đầu tiên trong khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên trên phòng cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH-CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập. Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
ii Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn sinh viên có sức khoẻ, thành công trong cuộc sống. Thái Nguyên, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện Đỗ Ngọc Hà
iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) .................................................... 8 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) . 34 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan ............................................................................. 36 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) .................................. 38 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên ................... 40 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy) ............. 42 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) .................................... 45 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy) ..... 47 Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Trần liên ...................................................... 49
iv DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum ................ 13 Hình 3.1. Quả lan Hài Trần Liên .................................................................... 23 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên ...................... 26 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên................. 35 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%) ......................................................... 37 Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA ..... 39 Biểu đồ 4.4. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin .................................................................................... 41 Biểu đồ 4.5. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin và TDZ ....................................................................... 43 Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA ............ 45 Biểu đồ 4.7. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với than hoạt tính ................................................................... 47 Biểu đồ 4.8. Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể ........................................ 49
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B5 : Gamborg cs, 1976 BAP : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation – Hệ số biến động Đ/C : Đối chứng LSD : Least Singnificant DifferenceTest MS : Murashighe và Skoog, 1962 MT : Môi trường GA3 : Gibberellic acid NAA : α-Napthalene acetic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế P. : Paphiopedilum tranlienuanum tranlienuanum P. malipoens : Paphiopedilum malipones WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iii DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ ....................................................................... iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v MỤC LỤC ........................................................................................................ vi PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1 1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 1 1.3 Yêu cầu của đề tài ....................................................................................... 2 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ....................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 2.1. Tổng quan về Lan Hài ................................................................................ 3 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ........................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 4 2.1.3. Sinh thái................................................................................................... 6 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam ............................................................ 7 2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) .................. 11 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) ở Việt Nam ............................................................................. 11 2.2.2 Hình Thái................................................................................................ 12 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên .................. 13 2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên ......................... 14 2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giới và trong nước ......................................................................................................................... 19
vii 2.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 19 2.4.2. Trong nước ............................................................................................ 21 PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................................... 23 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu.................................................. 23 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu.............................................................. 23 3.1.2. Hoá chất sử dụng ................................................................................... 23 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu................................................................. 24 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................. 24 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 24 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 24 3.2.3. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 25 3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25 3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 25 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro .................................................. 25 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống .................................... 26 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. 31 3.5. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá ........................ 31 3.5.1. Thu thập số liệu ..................................................................................... 31 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi.............................................................................. 31 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 34 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng ......................................................... 34 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên ............................................................................ 36 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên ......................................................... 38
viii 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan Hài Trần Liên ....................................................................... 38 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên .................................................. 40 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả năng nhân nhanh giống cây ............................................................................. 42 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan ............................................................................................ 44 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây lan ............................................................................................................. 44 4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây lan hài Trần liên ......................................................................... 46 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan ..................................................................................................... 48 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 51 5.1. Kết luận .................................................................................................... 51 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52
1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Lan Hài là loài hoa đẹp có giá trị thẩm mĩ và kinh tế cao. Được người yêu hoa trong và ngoài nước tìm kiếm, điều này đã dẫn đến hầu hết các loài lan hài trên thế giới cũng như của Việt Nam rơi vào mức báo động nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Hài Trần Liên (hài Bắc Thái) là một trong số loài lan hài đặc hữu của Việt Nam, có khu phân bố hẹp (khu vực Bắc Kạn và Thái Nguyên), hiện lan hài Trần Liên được tìm thấy ở khu vực đệm của Hồ Ba Bể - nơi xuất hiện nhiều loài phong lan, địa lan có giá trị thẩm mỹ. Hài Trần Liên được nhiều nhà sưu tầm lan quan tâm bởi kiểu dáng độc đáo với điểm nhấn cánh môi của hoa uốn cong giống hình chiếc hài và hai cánh bên lượn sóng, màu đỏ thẫm, hấp dẫn người chơi lan. Hài Trần Liên tái sinh bằng phôi nếu kết hợp được với loài nấm cộng sinh, do đó khả năng tái sinh trong tự nhiên thấp, đây là nguyên nhân thứ 2 khiến loài hoa có giá trị này được liệt kê vào phụ lục 1 của công ước CITES và danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006. Xuất phát từ thực tiễn trên em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro”. 1.2 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần liên từ phôi bằng phương pháp in vitro.
2 1.3 Yêu cầu của đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. - Xác định được ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh phôi của cây Hài Trần Liên - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng nhân nhanh Hài Trần Liên - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Trần Liên. - Xác định ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên. 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này. * Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan hài Trần Liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương phán nuôi cấy in vitro, góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.
3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về Lan Hài 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1. Phân loại Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ lan. Chúng dễ dàng được nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa. Chiếc môi đặc sắc và hình dạng khác thường của hoa tạo nên vẻ bề ngoài dễ dàng phân biệt lan Hài với các loài lan khác. Vì vậy nó trở thành tên chung của loài lan này. Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ. - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae).[1] 2.1.1.2. Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở
4 Trung Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế. Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa 2.1.2. Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn[1] - Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1] - Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên
5 cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn.[1] - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài[1] Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài.[1] Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1] - Qủa: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Qủa mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Qủa thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]
6 - Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn,dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1] - Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Sau khi rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có các búi nấm xung quanh rễ [1]. 2.1.3. Sinh thái Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700-2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit. Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các loài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lan Hài mọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m. Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ
7 ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài. Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam.[1] 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy việc trồng lan đã trở thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát triển khu vực Đông Nam Á. Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng[2] Lan Hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái. Nền kinh tế phát triển nhanh chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm
8 nhanh chóng do hoạt động khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay [1]. Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) Tên loài Tên loài Tình trạng (tiếng Latinh) (tiếng Việt) Đã bị tuyệt chủng P. vietnamense Hài Việt ngoài thiên nhiên Đang bị tuyệt chủng p. delenatii Hài Đỏ trầm trọng P.  aspersum Chưa rõ tên gọi P. barbigerum var. lokianum Hài Lộc P. callosum Hài Vân P. dianthum Hài Xoắn P. emersonii Hài Hương Lan P. gratrixianum Hài Đuôi công Đang bị tuyệt chủng P. hangiannum Hài Hằng P. helenae Hài hê len P. henryanum Hài Henry P.  herrmannii Hài Herman P. malipoense var. jackii Hài Jack P. malipoense Hài Giáp P. micranthum Hài Mốc Hồng
9 Tên loài Tên loài Tình trạng (tiếng Latinh) (tiếng Việt) P. purpuratum Hìa Tía P. tralienianum Hài Trần liên P. appletonianum Hài Cánh Sen P. concolor Hài Gia Định P. hirsutissimum var. Sắp bị tuyệt chủng Hài Tiên biến dị chiwuawnum Hài Tiên P. hirsutissimum var. esquirolai Hài Lông P. villosun var. annamense P.  affine Hài Hoà Thiếu dẫn liệu P.  datalanse Chưa rõ tên gọi P. villosum var. boxalli Chưa rõ tên gọi Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [12],[13],[14] Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái.
10 Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam trong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ.[1] Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu. Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1] Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum. - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum. - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P.dalatensis.
11 - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum. - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.hangianum, P. malipoense varijackii. - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae. - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. malipoense Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH – CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống bằng phương pháp in vitro một số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen. 2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) ở Việt Nam 2.2.1.1 Nguồn gôc Lan hài Trần liên - Paphiopedilum Tranlienianum là một loài lan hài nhỏ, là dài khoảng 8-15cm màu xanh bóng. Loài này có hoa tao nhã với lá đài lưng trắng có sọc tía nâu, cánh hoa tía nâu lượn sóng rất mạnh ở mép, môi nâu tía và nhị lép vàng tươi. Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam, cây ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày. Lan Hài Trần Liên được mô tả chính thống năm 1988 dựa trên một cây sống