Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp đại học này được thực hiện với mục tiêu nhằm nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống Hài Hương Lan từ đoạn thân non mang chồi ngủ bằng phương pháp in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khoá học : 2016 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2016 – 2020 Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020
i LỜI CÁM ƠN Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Em xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH & CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để em hoàn thành khóa luận này. Trong quá trình làm khóa luận không tránh khỏi những sai sót, em mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để em có thể làm tốt hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Quốc Ân
ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. 1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) ..................................................................7 Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ....................................................................21 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) .....................31 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy). ...............................................................................................................33 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy) ..35 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) ................................................................................................37 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy)..............................................................................39 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) .............43 Biểu đồ 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) ......43 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan (sau 4 tuần nuôi cấy) .....................45
iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình ảnh về cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tại nhà lưới khoa CNSH&CNTP ..........................................................................10 Hình 4.2. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy) ..............34 Hình 4.3. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 20 ngày nuôi cấy). .......37 Hình 4.4. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) .........................................................................39 Hình 4.5. Hình ảnh ảnh hưởng của BA và Kinetin kết hợp với TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) ....................................................................................42 Hình 4.6. Hình Hài Hương Lan ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ hoàn chỉnh (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) ............................44 Hình 4.7. Hình ảnh ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) ....................................................................................47
iv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) .......31 Biểu đồ 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy). ...................................................................................................33 Biểu đồ 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy) ...........................................................................................................35 Biểu đồ 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) ...................................................................................38 Biểu đồ 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii (sau 4 tuần nuôi cấy) .......................................................40 Biểu đồ 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) .. 43 Biểu đồ 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) ....................................................................................45
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BA : 6-Benzyladenine CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng H2 O2 : oxi già IUCN : International Union for Conservation of Nature and Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog’s, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế ND : Nước dừa TDZ : Thidiazol THT : Than hoạt tính TN : Thí nghiệm WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980
vi MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN ..............................................................................................................i DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... ii DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... iii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ....................................................................................iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................v MỤC LỤC ..................................................................................................................vi Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................1 1.2 Mục đích nghiên cứu .............................................................................................2 1.3 Yêu cầu của đề tài .................................................................................................2 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................2 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài ...............................................................................2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................4 2.1. Tổng quan về lan Hài ...........................................................................................4 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc .....................................................................................4 2.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................5 2.1.3. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam và phương thức bảo tồn ...............................6 2.2. Giới thiệu về giống Hài Hương lan .....................................................................9 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố ..................................................................................9 2.2.2 Hình dạng .........................................................................................................10 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) ...................................................................................................................................11 2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) ..................................................................................................................11 2.2.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật .............12 2.2.6. Môi trường dinh dưỡng ...................................................................................13 2.3. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước ..............17
vii 2.3.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới ...........................17 2.3.2. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trong nước .............................18 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......21 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................21 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ........................................................................21 3.1.2. Hoá chất sử dụng .............................................................................................21 3.1.3. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu............................................................................21 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................22 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................22 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................22 3.2.2. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................22 3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................22 3.3.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng của cây Hài Hương Lan. ...........................22 3.3.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi rường đến khả năng tái sinh của chồi Hài Hương Lan từ đoạn thân mang chồi ngủ. ...................................................22 3.3.3.Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinnetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan. ....................................................................22 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây Hài Hương Lan. ....................................................................23 3.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................23 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro ............................................................23 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................23 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................24 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ..............................................................27 3.5.1. Thu thập số liệu ...............................................................................................27 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................................28 3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu ...............................................................................29 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................30
viii 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng ............................................................................30 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) ................32 4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số Cytokinnetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) từ đoạn thân mang mầm ngủ. ......................34 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). .....................................................................34 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) ............................................37 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA,Kinetin kết hợp với TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) .................................39 Kết quả thu được ở bảng 4.5 cho thấy: Giá trị CV (%): 6,7 và LSD0.5 đạt 0,63; các thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ không tin cậy 95%. Cho thấy rằng tất cả các công thức có bổ sung nồng độ BA 2,0 mg/l; Kinetin 1,0 mg/l; TDZ 0- 3,0mg/l vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tới việc nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). ...............................................................................40 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây . .....................................................................................................................42 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của Hài Hương Lan. ..................................................................................................42 4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính (THT) đến khả năng ra rễ Hài Hương Lan . .......................................................................................45 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................48 5.1. Kết luận ..............................................................................................................48 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................49 PHỤ LỤC
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Họ Lan, hay họ Phong lan, (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm Họ Orchideceae là một trong những họ lớn nhất của thực vật và có các thành viên mọc trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực; có cây hoa lan sống dưới mặt đất và chỉ nở hoa trên mặt đất cũng như có cây hoa lan sống tại vùng cao nguyên của dãy núi Himalaya; hoa lan có thể tìm thấy tại các vùng có khí hậu nhiệt đới như trong rừng già của Brasil đến các vùng có tuyết phủ trong mùa đông như tại bình nguyên của Manitoba, Canada. Các loài lan chủ yếu mọc trên cây cao, sống biểu sinh lâu năm. Chúng được gọi chung là phong lan. Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất, tức là địa lan và có một số loài mọc trên đá tức thạch lan. Họ Orchidaceae phân bổ rộng khắp thế giới, gần như có thể có mặt trong mọi môi trường sống, ngoại trừ các sa mạc và sông băng. Phần lớn các loài được tìm thấy trong khu vực nhiệt đới, chủ yếu là châu Á, Nam Mỹ và Trung Mỹ. Chúng cũng được tìm thấy tại các vĩ độ cao hơn vòng Bắc cực, ở miền nam Patagonia và thậm chí trên đảo Macquarie, gần với châu Nam Cực. Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có khu phân bố hẹp tại một số nơi như Thái Nguyên và Vĩnh Phúc với số lượng cá thể rất ít, trên các vách núi dựng đứng và loài cây làm cảnh rất quý vì hoa có màu sắc đẹp dịu dàng với cấu tạo môi có hạt độc đáo, cánh hoa hình bầu dục rộng - gần tròn, ở gốc có lông dài và chấm tía, mép bên đôi khi uốn vào trong; môi màu vàng hay da cam nhạt, gân hình cầu với các chấm to và trắng đục như hạt ngọc lại rất hiếm có giá trị thẩm mỹ cao nên rất được thế giới ưa chuộng dẫn đến tình trạng thu thập và xuất khẩu hài hương lan khiến chúng đang đứng trên bờ vực của sự tuyệt chủng ngoài thiên nhiên do việc thu mẫu ồ ạt nhằm mục đích thương mại. Hiện nay, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội, nhiều loài lan quý hiếm đang bị đe doạ tuyệt chủng. Trong đó phải kể đến hài Hương Lan là một trong các
2 loài lan Hài quý của Việt Nam đang bị đe doạ nghiêm trọng. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy in vitro tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn. Bởi vậy, phương pháp nhân giống hài vô tính in vitro Hài Hương Lan.đã và đang mở ra triển vọng tốt cho việc bảo tồn các loài thực vật quý hiếm và phát triển các giống lan quy hiếm này. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro” 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống Hài Hương Lan từ đoạn thân non mang chồi ngủ bằng phương pháp in vitro. 1.3 Yêu cầu của đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. - Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan. - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokiinine đến khả năng nhân nhanh Hài Hương Lan. - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan. 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này.
3 - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân giống cây Hài Hương lan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương phán nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng giống hài Hương Lan góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về lan Hài 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1. Phân loại Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá chồi (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta). Lan Hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Chúng dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống như một chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ ngoài đặc sắc có thể dễ dàng phân biệt với các loại lan khác. Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ. - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông, Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1],[13]. 2.1.1.2. Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế. Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong
5 gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1],[13]. 2.1.2. Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1] - Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1]. - Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn. - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp
6 hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài [1]. Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài. Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1]. - Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]. - Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]. 2.1.3. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam và phương thức bảo tồn Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao, được sưu tầm và tìm kiếm rất nhiều. Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng [3]. Vì vậy tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng.
7 Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1. Bảng 2. 1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] Tên loài Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) (tiếng Việt) Đã bị tuyệt chủng P. vietnamense Hài Việt ngoài thiên nhiên Đang bị tuyệt P. delenatii Hài Đỏ chủng trầm trọng P.  aspersum Chưa rõ tên gọi P. barbigerum var. lokianum Hài Lộc P. callosum Hài Vân P. dianthum Hài Xoắn P. emersonii Hài Hương Lan P. gratrixianum Hài Đuôi công P. hangiannum Hài Hằng P. helenae Hài hê len P. henryanum Hài Henry Đang bị P.  herrmannii Hài Herman tuyệt chủng P. malipoense var. jackii Hài Jack P. malipoense Hài Giáp P. micranthum Hài Mốc Hồng P. purpuratum Hài Tía P. tralienianum Hài Trần liên Sắp bị tuyệt chủng P. appletonianum Hài Cánh Sen P. concolor Hài Gia Định P. hirsutissimum var. chiwuawnum Hài Tiên biến dị P. hirsutissimum var. esquirolai Hài Tiên P. villosun var. annamense Hài Lông Thiếu dẫn liệu P.  affine Hài Hoà P.  datalanse Chưa rõ tên gọi P. villosum var. boxalli Chưa rõ tên gọi (Nguồn: Averyanov et al, 2008) Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra
8 thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [8],[9],[10]. Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái. Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam trong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ [1]. Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu. Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]. Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.
9 - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P.dalatensis. - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum. - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.hangianum, P. malipoense varijackii. - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae. - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. malipoense Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau. 2.2. Giới thiệu về giống Hài Hương lan 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố 2.2.1.1. Nguồn gốc - Sau rất nhiều những nghi ngờ về sự tuyệt chủng của chúng thì loài này cuối cùng cũng đã được tìm thấy năm 2000 ở vùng núi đá vôi cao ngất thuộc tỉnh Tuyên Quang. Từ lâu, cây lan này được ghi nhận là một loài đặc hữu của Trung Quốc. Nhưng mãi đầu năm 2001 nhà thực vật học người Nga Averyanov và các cộng sự đã phát hiện ra nơi mọc ở những phần nhỏ của khu vực núi đá vôi thuộc tỉnh Bắc Cạn và phía bắc tỉnh Thái Nguyên.
10 2.2.1.2 Phân bố - Loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) này được phân bố ở nước ta điển hình tại huyện Võ Nhai - Thái Nguyên, Vĩnh phúc [16]. 2.2.2 Hình dạng - Loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có lâu năm, có 4 - 7 lá xếp thành 2 dãy. Lá rất giống P. hangianum, chất da, có hình thoi - bầu dục, cỡ 15 - 25 x 3 - 5 cm,mặt trên màu lục bóng, mặt dưới màu lục nhạt. Cụm hoa có cuống dài 10 - 15 cm, mang 1 hoa. Lá bắc hình bầu dục rộng, cỡ 2,8 - 3 x 1,2 - 2 cm, màu trắng. Hoa thơm dịu, rộng 8 - 9,5 cm; lá đài và cánh hoa dày, màu trắng, có lông ngắn ở cả 2 mặt; lá đài ở gần trục hoa hình bầu dục - trứng, cỡ 3 - 4,5 x 2 - 3 cm; lá đài kia hình bầu dục rộng - gần tròn, cỡ 2,5 - 3,5 x 2,4 - 3,5 cm; cánh hoa hình bầu dục rộng - gần tròn, cỡ 4 - 4,5 x 2,5 - 3,5 cm, ở gốc có lông dài và chấm tía, mép bên đôi khi uốn vào trong; môi màu vàng hay da cam nhạt, gân hình cầu với các chấm to và trắng đục như hạt ngọc, cỡ 3,5 - 4,5 x 2 - 3 cm, mép cuốn vào trong với mạng gân lõm; nhị lép màu vàng với 2 vệt màu đỏ cam, cỡ 1,6 - 2 x 0,8 - 1,1 cm; bầu dài khoảng 3 cm, có lông nhung trắng [16]. Hình 2.1. Hình ảnh về cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tại nhà lưới khoa CNSH&CNTP