Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:60

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là tinh sạch được enzyme Nattokinase (NK) được lên men từ vi khuẩn B. subtilis; khảo sát được độ bền với pH và nhiệt độ của NK khi gắn với các chất mang giúp cố định enzyme. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN TÙNG LÂM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN TÙNG LÂM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH - 2016.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. TS. Vũ Thị Thơm Trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội HÀ NỘI – 2021
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh – phòng Công nghệ sinh học Enzyme – Viện Công nghệ sinh học – Viên Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Cô giáo TS. Vũ Thị Thơm – Trưởng bộ môn Y dược học cơ sở – Trường Đại học Y dược –ĐHQGHN là những người đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hiền Trang cùng toàn thể các cán bộ trong Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin bày bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình thân yêu đã luôn khích lệ và ủng hộ em về mặt vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành được luận văn này.
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Vật liệu polymer tự nhiên ................................................................. 9 Bảng 2.4. Cố định enzyme Nattokinase (NK) bằng Microcrystalline cellulose (MCC) ............................................................................................................. 23 Bảng 3.4. Hàm lượng protein tổng số và hoạt tính thủy phân casein của mẫu enzyme tủa bằng cồn và muối ammonium sulfate .......................................... 24 Bảng 3.7. Tóm tắt quá trình tinh sạch enzyme Nattokinase từ chủng B. subtilis27 Bảng 3.19. Hiệu suất gắn của enzyme Nattokinase với các chất mang .......... 33
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Nattokinase .................................................... 4 Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của Nattokinase ..................................................... 5 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tìm vật liệu cố định enzyme NK........ 14 Hình 2.2. Đường chuẩn Tyrosine ................................................................... 21 Hình 2.3. Đường chuẩn Bradford ................................................................... 22 Hình 3.1. (A) Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme sau khi kết tủa (M: marker, 1: tủa ammonium sulfate nồng độ 30 %, 2: tủa ammonium sulfate nồng độ 70 %, 3: tủa cồn, 4: dịch enzyme trước tủa). (B) Hoạt tính thủy phân fibrinogen của enzyme Nattokinase ........................................................................................ 25 Hình 3.2. Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme Nattokinase sau khi qua cột DEAE-Sepharose ............................................................................................ 26 Hình 3.3. Điện di Nattokinase sau khi qua cột DEAE ................................... 27 Hình 3.4. Điện di γ-PGA ................................................................................ 28 Hình 3.5. Hình ảnh kính hiển vi của Na-γ-PGA ở độ phóng đại 100X ......... 28 Hình 3.6. γ-PGA ở dạng natri ........................................................................ 29 Hình 3.7. Độ bền của NK và NK- Na-γ-PGA với các pH khác nhau sau 1h (A) và 24h (B) ................................................................................................. 30 Hình 3.8. Độ bền của NK và NK-Na-γ-PGA với các nhiệt độ khác nhau Sau 1h ủ (A), Sau 24 h ủ (B) .................................................................................. 32
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT NK : Nattokinase γ-PGA : γ-Polyglutamic acid MCC : Microcrystalline cellulose t-PA : tissue plasminogen activator - yếu tố hoạt hóa plasminogen PAI-1 : plasminogen-1 LDL : low-density lipoprotein – lipoprotein tỉ trọng thấp AD : bệnh Alzheimer TNF‐α : Tumour necrosis factor α IFN‐γ : Interferon- γ IL‐1β : Interleukin-1β MIP‐2 : Macrophage inflammatory protein-2 TCA : tricloacetic acid SDS-PAGE : sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis DEAE : diethylaminoethyl
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ............................................................................. 4 1. Tổng quan về enzyme Nattokinase ............................................................... 4 1.1. Giới thiệu chung về Nattokinase ............................................................ 4 1.2. Cơ chế và tác dụng ................................................................................. 5 2. Bacillus subtilis natto .................................................................................... 6 2.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis natto ....................................................... 6 2.2. Đặc điểm và hình thái của Bacillus subtilis natto .................................. 6 2.3. Ứng dụng của Bacillus subtilis natto...................................................... 7 3. Vật liệu cố định enzyme ............................................................................... 8 4. Chất mang sử dụng trong nghiên cứu cố định Nattokinase.......................... 9 4.1. Poly glutamic acid (PGA) ...................................................................... 9 4.2. Microcrystalline cellulose (MCC) ........................................................ 10 5. Một số nghiên cứu về hướng của đề tài ...................................................... 10 5.1. Nghiên cứu trong nước ......................................................................... 10 5.2. Nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 11 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 13 1. Vật liệu .......................................................................................................... 13 1.1. Chủng ................................................................................................... 13 1.2. Hóa chất ................................................................................................ 13 2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 13 2.1. Phương pháp nuôi cấy .......................................................................... 15 2.2. Phương pháp tinh sạch enzyme ............................................................ 16 2.3. Phương pháp cố định enzyme Nattokinase (NK)................................. 22 2.4. Xử lý số liệu ......................................................................................... 23
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................... 24 1. Tinh sạch enzyme Nattokinase và Na-γ-PGA từ B. subtilis ......................... 24 1.1. Tinh sạch enzyme Nattokinase .............................................................. 24 1.2. Tinh sạch Na-γ-PGA ............................................................................... 28 2. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA ................ 29 2.1. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA dưới ảnh hưởng của pH.................................................................................. 29 2.2. Xác định khả năng làm bền enzyme Nattokinase của Na-γ-PGA dưới ảnh hưởng của nhiệt độ ......................................................................... 31 3. Đánh giá hiệu suất gắn NK với chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) ............................................................................................................... 32 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 35 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... PHỤ LỤC ............................................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối là hiện tượng xuất hiện các cục máu đông trong động mạch hay các tĩnh mạch nằm bên trong cơ thể. Bình thường nó có tác dụng cầm máu trong các trường hợp chảy máu do tổn thương mạch máu. Khi quá trình đông máu xảy ra không do tổn thương thì được gọi là chứng huyết khối bệnh lý và có thể là nguyên nhân dẫn đến các bệnh như: tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ, nhồi máu cơ tim…nguy hiểm hơn sẽ dẫn đến tử vong [52]. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2016, toàn cầu có 17,9 triệu người tử vong do các bệnh tim mạch, nhiều hơn gấp 4 lần tổng số người tử vong của 3 bệnh lý HIV/AIDS, sốt rét và lao phổi. Nguyên nhân chính là do cục máu đông và biến chứng của nó. Có nhiều phương pháp điều trị huyết khối như sử dụng thuốc hoặc phẫu thuật. Tuy nhiên, các thuốc tan huyết khối như Alteplase, Streptokinase, Urokinase… mặc dù có hiệu lực tức thì sau khi tiêm tĩnh mạch nhưng thời gian bán hủy ngắn, giá thành cao và chỉ tác động điều trị triệu chứng, không điều trị được căn nguyên của bệnh. Cả sử dụng thuốc tiêm tĩnh mạch và phẫu thuật đều có nguy cơ biến chứng cao. Natto, một loại thực phẩm làm từ đậu nành lên men với Bacillus subtilis đã được tiêu thụ như một loại thực phẩm truyền thống ở các nước châu Á trong hơn 2000 năm. Tiêu thụ natto được cho là một yếu tố đóng góp đáng kể vào tuổi thọ của dân số Nhật Bản. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng ăn nhiều natto có liên quan đến việc giảm nguy cơ tử vong tổng số bệnh tim mạch và đặc biệt là giảm nguy cơ tử vong do bệnh tim thiếu máu cục bộ [47]. Trước những năm 1980, rất ít người biết về việc tiêu thụ natto có lợi cho sức khỏe tim mạch tổng thể. Năm 1987, Sumi và cộng sự đã phát hiện ra rằng natto có chứa một loại enzyme tiêu sợi huyết mạnh có tên là Nattokinase (NK) [59]. Kể từ đó, một số lượng đáng kể nghiên cứu NK đã được thực hiện 1
ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Hoa Kỳ, và những nghiên cứu này đã xác nhận rằng NK có nhiều tác dụng thuận lợi đối với sức khỏe tim mạch. NK không liên quan đến bất kỳ kinase nào đã biết mà là một serine protease được tinh chế và chiết xuất từ natto [64]. Ngoài ra, ưu điểm của NK còn bao gồm sự an toàn và tiện lợi khi sử dụng đường uống, quy trình sản xuất đơn giản với chi phí thấp hơn các loại thuốc chống huyết khối và hạ huyết áp khác. Tại Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc và các nước phương Tây bao gồm Úc, Hoa Kỳ, Canada và Châu Âu, các sản phẩm NK được sử dụng rộng rãi dưới dạng viên nén hoặc viên nang như các chất bổ sung dinh dưỡng để tăng cường sức khỏe bao gồm làm loãng máu, ngăn ngừa cục máu đông và cải thiện tuần hoàn [15]. Tuy nhiên, chưa có dữ liệu thuyết phục để chứng minh tính sinh khả dụng và chuyển hóa của NK qua đường uống. Hiệu quả của enzyme trong máu và tiêu hóa đòi hỏi nhiều nghiên cứu hơn để cải thiện độ ổn định của enzyme dưới điều kiện nhiệt độ và độ pH thay đổi bằng cách tăng cường các điều kiện cho bảo quản và sản xuất NK [17, 39]. Hiện nay, có nhiều phương pháp để ổn định và tăng cường hoạt động của enzyme như sử dụng các vật liệu để cố định enzyme hoặc biến đổi enzyme. Trong đó, cố định enzyme là phương pháp được sử dụng nhiều hơn. Enzyme cố định có ưu điểm hơn các enzyme tự do như được tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài, bền hơn với nhiệt, pH và các dung môi hữu cơ. Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase” nhằm mục tiêu: 1. Tinh sạch được enzyme Nattokinase (NK) được lên men từ vi khuẩn B. subtilis 2
2. Khảo sát được độ bền với pH và nhiệt độ của NK khi gắn với các chất mang giúp cố định enzyme. 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1. Tổng quan về enzyme Nattokinase 1.1. Giới thiệu chung về Nattokinase Nattokinase lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1980 bởi bác sĩ Hyroyuki Sumi. Khi tiến hành nghiên cứu khả năng làm tan cục máu đông của các loại thực phẩm, ông phát hiện ra dịch chiết từ natto - một loại sản phẩm truyền thống của Nhật Bản lên men từ đậu nành có khả năng làm tan cục máu đông nhanh, mạnh và gọi đó là enzyme “nattokinase” có nghĩa “enzyme trong natto”. Nattokinase là enzyme có khả năng chống đông máu mạnh hơn cả các urokinase. Enzyme này đã được chứng minh là an toàn và được sử dụng ở Nhật Bản trong hơn 20 năm qua [59]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Nattokinase [69] Nattokinase hay còn gọi là subtilisin NAT là một enzyme có khả năng tiêu sợi huyết hiệu quả được sản xuất từ Bacillus subtilis. Nattokinase là một serine protease có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn gồm 275 gốc acid amin, khối lượng phân tử là 27,728 kDa và điểm đẳng điện là pI=8,6 [69].Trung tâm hoạt động của N là bộ 3 xúc tác gồm nhóm hydroxyl của Ser221, imidazol của His64 và nhóm cacboxyl của Asp32. Cơ chất đặc hiệu của 4
Nattokinase là cơ chất đặc hiệu chung của subtilisin: Suc-Ala-Ala-Pro-Phe- pNA [48]. Nattokinase ổn định trong khoảng pH từ 6-10 và nhiệt độ 30-60°C, mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C [22, 44] 1.2. Cơ chế và tác dụng Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của Nattokinase [27] Nattokinase có đặc điểm sinh học giống như plasmin, phân hủy fibrin trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua 3 con đường (Hình 1.2): - Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp (A) - Nattokinase tăng cường plasmin thông qua hoạt hóa prourokinase (nội sinh) thành urokinase (B) - Nattokinase làm tăng nồng độ t-PA (tissue plasminogen activators -yếu tố hoạt hóa plasminogen) (C) [27, 41]. Ngoài tác dụng tiêu sợi huyết, chống huyết khối mạnh mẽ [58, 59], NK còn cho nhiều tác dụng như: tác dụng chống xơ vữa động mạch và hạ lipid máu [18, 53], tác dụng hạ huyết áp [23, 36], tác dụng chống kết tập tiểu cầu, chống đông máu [32], và các tác dụng bảo vệ thần kinh [20, 34]. 5
Tuy nhiên, NK bất ổn định với sự thay đổi của nhiệt độ và pH, cần thiết phải có những nghiên cứu thêm để NK đạt độ ổn định cao hơn, tạo điều kiện thuận cho quá trình sản xuất, bảo quản NK, hơn nữa giúp enzyme bền hơn trong trình tiêu hóa cũng sẽ giúp tăng hiệu quả hoạt động của enzyme trong máu [17, 39]. 2. Bacillus subtilis natto 2.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis natto Năm 1913, Tiến sĩ S. Sawamura đã phân lập được trực khuẩn natto và đặt tên là Bacillus subtilis natto. Natto đầu tiên sử dụng phương pháp nuôi cấy thuần chủng B. subtilis đã được bán bởi Giáo sư J. Hanzawa vào năm 1928 [69]. Bacillus subtilis natto thuộc loài Bacillus sutilis để lên men đậu tương luộc tạo natto. B. subtilis natto có cả dạng tế bào sinh dưỡng và dạng bào tử. Các bào tử thích hợp hơn để bảo quản. Vẫn chưa có bằng chứng chứng minh tác dụng riêng có lợi của vi khuẩn này. Tuy nhiên, đến nay chưa có chủng B. subtilis nào khác có thể lên men ra natto. Điều này là do natto với các đặc tính chỉ có thể được sản xuất với các chủng B. subtilis. Sử dụng các chủng B. subtilis tạo ra natto có mùi thơm đặc biệt, lớp vi khuẩn nhăn trên bề mặt đậu nành và độ dính mong muốn [51]. 2.2. Đặc điểm và hình thái của Bacillus subtilis natto B. subtilis natto là một loại vi khuẩn hình thành bào tử Gram (+) tự nhiên và được coi là an toàn [31]. Vì là vi khuẩn hiếu khí nên trong quá trình nuôi cấy B. subtilis natto cần phải bổ sung oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37˚C - 43˚C và ngừng sinh trưởng ở 55˚C [46]. 6
2.3. Ứng dụng của Bacillus subtilis natto B. subtilis natto được sử dụng để sản xuất Fructooligosaccharides (FOSs) là các oligomer của fructose với mức độ trùng hợp thấp (DP) và được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm do liên tạo ra các đặc tính y sinh như cải thiện hấp thụ khoáng chất [42], chống ung thư [54], các hoạt động chống đái tháo đường [9], chống oxy hóa và bảo vệ gan [13]. B. subtilis natto cũng được sử dụng như một chủng sinh tổng hợp vitamin K2. Bằng cách phát hiện sự thay đổi điện thế oxy hóa khử trong quá trình sinh trưởng của B. subtilis, một nguồn cung cấp oxy tốt và trạng thái của màng tế bào được cho là có lợi cho quá trình tổng hợp vitamin K2 [7, 66]. Bacillus subtilis natto còn có ảnh hưởng tốt đối với động vật nhai lại. Nó có tiềm năng được ứng dụng như một chế phẩm sinh học dùng cho bò sữa. Uống B.subtilis natto đã được chứng minh có tác dụng thúc đẩy sự tăng trưởng và chức năng miễn dịch của bê sữa [61], tăng sự phát triển dạ cỏ của bê [60], cải thiện sản lượng sữa và thay đổi quá trình lên men dạ cỏ của bò sữa [50, 62]. Ngoài ra, B. subtilis natto có tác dụng điều hòa miễn dịch đối với đại thực bào. Nghiên cứu đo việc sản xuất TNF‐α, IFN‐γ, IL‐1β, IL‐6, IL‐12, IL‐ 10 và MIP‐2 bởi các tế bào RAW 264,7 được xử lý bằng B. subtilis natto để đánh giá các phản ứng miễn dịch và viêm của đại thực bào. Từ đó thấy rằng B. subtilis natto tăng cường chức năng miễn dịch của đại thực bào bằng cách thúc đẩy các phản ứng miễn dịch và viêm. Ứng dụng chính của B. subtilis natto là lên men đậu nành luộc tạo natto thu enzyme Nattokinase [65] và sản xuất γ-Polyglutamic acid (γ-PGA) là một loại polymer tan trong nước được sử dụng làm chất tạo màng sinh học ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm [14]. γ- 7
Polyglutamic acid (γ-PGA) là một trong những vật liệu tạo nên độ dính của chế phẩm natto [49]. 3. Vật liệu cố định enzyme Các vật liệu được sử dụng để cố định enzyme được gọi là chất mang hoặc ma trận hỗ trợ. Các đặc điểm của ma trận là quan trọng hàng đầu quyết định sự thành công và kết quả của enzyme cố định. Chất mang lý tưởng cần bao gồm các đặc điểm như chi phí thấp và thân thiện với môi trường, hoàn toàn trơ sau khi cố định và không cản trở các phản ứng mong muốn, có khả năng chống nhiệt, cơ học và cho phép enzyme hoạt động trong các điều kiện khác nhau. Ngoài ra, chất mang cần có độ ổn định cao, giúp tăng cường tính đặc hiệu của enzyme, có thể làm thay đổi pH tối ưu của enzyme để nó hoạt động đến giá trị mong muốn [57]. Trên cơ sở thành phần hóa học của chất mang, chúng được phân loại thành 2 nhóm chính: vật liệu cố định vô cơ và vật liệu cố định hữu cơ. Vật liệu cố định vô cơ thường bền với các tác động bên ngoài, khả năng chịu nhiệt và cơ học cao, không bị vi sinh vật ăn mòn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzyme thường khó khăn. Tính năng đặc trưng là cung cấp độ cứng và độ xốp cho enzyme cố định [28, 57]. Một số vật liệu vô cơ thông dụng như: thủy tinh xốp, silica gel, aluminium, oxit kim loại, zirconia (oxit kim loại của zirconium) và nhiều các vật liệu khác… Vật liệu cố định hữu cơ là những chất có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH2, -COOH, -OH… nên có thể dễ dàng gắn với enzyme. Tuy nhiên, độ bền với các tác động của môi trường không cao, đặc biệt là các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công. Vật liệu cố định hữu cơ được chia làm các polymer tự nhiên (Bảng 1.1) và các polymer tổng hợp. Các polymer tổng hợp là nhựa trao đổi ion có bề mặt xốp và không hòa tan trong tự nhiên. Những polymer này, vì cấu trúc của chúng nên có thể cố 8
định enzyme rất mạnh. Chúng trơ trước sự tấn công của vi sinh vật. Một số polymer tổng hợp cố định enzyme như: Amberlite và DEAE cellulose được sử dụng để cố định α-amylase [37], PVC được sử dụng để cố định cyclodextrin glucosyltransferase, ngăn chặn sự bất hoạt do nhiệt của enzyme [3]… Bảng 1.1. Vật liệu polymer tự nhiên Polymer tự nhiên Tính chất Alginate Có thể tái sử dụng, cải thiện sự ổn định của enzyme [19, 21]. Chitosan và chitin Được dùng kết hợp với alginate. Ít bị rửa trôi, hơn thế nữa đáng tin cậy để sử dụng cho bẫy enzyme, ở dạng hạt, có thể bẫy được nhiều enzyme hơn [8, 12]. Collagen Giữ lại đáng kể hoạt động sau nhiều chu kì tái sử dụng [16, 35]. Carrageenan Cải thiện sự ổn định, rẻ, bền và hiệu quả [33, 63]. (tuyến tính sunfat hóa polysaccharide) Gelatin Khả năng hấp phụ cao, thúc đẩy tải hiệu quả [55]. Cellulose Thường sử dụng để hấp phụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị hoặc bẫy trong gel [4, 10, 45]. Tinh bột Ổn định. Sepharose Xốp, dễ hấp phụ, giữ được tính chất xúc tác ở các cực pH, nhiệt độ, nồng độ muối cao [29]. Pectin Được sử dụng cùng với glycerol làm chất hóa dẻo để giảm độ giòn của chất hỗ trợ Pectin-chitin và pectin-canxi alginate đã tăng cường khả năng chịu nhiệt, biến tính và các đặc tính xúc tác [11, 24]. 4. Chất mang sử dụng trong nghiên cứu cố định Nattokinase 4.1. Poly glutamic acid (PGA) Poly glutamic acid (PGA) là một polyme sinh học hòa tan trong nước có khả năng tự phân hủy, được tạo thành từ các đơn vị D- và L-glutamic acid 9
[56]. PGA được chia thành hai dạng α-PGA và γ-PGA tùy thuộc vào việc gắn nhóm caboxyl. So với α-PGA, γ-PGA được sản xuất rộng rãi hơn bởi vi khuẩn đặc biệt là những loài thuộc chi Bacillus. Với ưu thế là một polyme tự nhiên, không độc với con người, không gây đáp ứng miễn dịch nên γ-PGA được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực ví dụ như: trong công nghiệp môi trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng; trong sản xuất thực phẩm γ-PGA được sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết tinh…; trong y dược γ-PGA được dùng như các chất mang, chất giữ ẩm… [70]. PGA đã đươc chứng minh có khả năng làm bền một số enzyme trong đó có cả Nattokinase [30, 40]. Hơn nữa, PGA cũng là sản phẩm thu được trong quá trình lên men natto sản xuất nattokinase từ Bacillus subtillis, do đó thực sự thích hợp trong việc làm chất mang phối trộn với nattokinase tăng độ bền enzyme trong quá trình sản xuất chế phẩm Nattokinase. 4.2. Microcrystalline cellulose (MCC) Cellulose bản chất là polysaccharide cấu tạo nên vách tế bào thực vật và là hợp chất hữu cơ có nhiều nhất trong sinh quyển. Cellulose và dẫn xuất của nó như CM cellulose, DEAE cellulose, triacetate cellulose, diacetate cellulose, micrystalline cellulose (MCC)… được sử dụng rộng rãi làm chất mang để cố định enzyme. Cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ có thể sử dụng ở dạng sợi và dạng vi hạt, dạng màng. 5. Một số nghiên cứu về hướng của đề tài 5.1. Nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam hiện nay cũng đã có một số công trình nghiên cứu của trường đại học Bách khoa – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, trường đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng về vấn đề cố định enzyme bằng chất mang Chitosan và chất mang Cacboxymethylcellulose (CMC)-alginate. 10
Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme Nattokinase. Bùi Xuân Đông và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu ezyme lipase cố định trên chất mang Chitosan-Fe3O4 bằng liên kết cộng hóa trị. Chất mang là phức hợp các hạt nano Fe3O4 được hấp phụ trên chitosan nên có từ tính. Enzyme liên kết với vi hạt thông qua cầu nối trung gian là glutaraldehyde. Kết quả cố định trên vi hạt chitosan-Fe3O4 đã được chế tạo thành công với hiệu suất gắn lipase lên chất mang đạt 75,1% so với lượng lipase tự do ban đầu [1]. Huỳnh Ngọc Oanh và cộng sự (2007) đã tiến hành khảo sát quá trình cố định enzyme α-amylase (termamyl) bởi chất mang CMC-alginate. Kết quả đạt được là hoạt tính của enzyme α-amylase (termamyl) cố định bởi gel CMC- alginate cao tại nồng độ alginate 75%, nồng độ CaCl2 6%. Nồng độ CMC thích hợp để cố định enzyme Termamyl là 2%. Hoạt tính enzyme Termamyl cố định phụ thuộc vào cơ chất, pH và nhiệt độ phản ứng. Kết quả cho thấy khả năng chịu nhiệt của enzyme cố định còn phụ thuộc vào chất mang. Cơ chất có kích thước càng nhỏ càng dễ tiếp xúc enzyme cố định. Tuy nhiên enzyme cố định sẽ bị thất thoát sau quá trình tái sử dụng, ở lần sử dụng thứ 10 hoạt tính giảm một nửa [2]. 5.2. Nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tìm vật liệu tăng cường sự ổn định cho hoạt động của enzyme. Lee và cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu tăng cường hoạt động và sự ổn định của enzyme bằng γ-Polyglutamic acid. γ-PGA ngăn chặn hiệu quả sự biến tính của enzyme bằng cách xử lý nhiệt và lặp lại quá trình đông lạnh-rã đông [40]. 11
Deepak và cộng sự (2009) tiến hành tinh chế, cố định và xác định đặc tính của Nattokinase trên các hạt nano polyhydroxybutyrate (PHB). Trong nghiên cứu này, nattokinase được tinh chế từ Bacillus subtilis bằng sắc ký trao đổi ion và cố định trên các hạt nano polyhydroxybutyrate (PHB). Việc cố định Nattokinase trên các hạt nano PHB làm tăng 20% hoạt tính của enzyme. Sự cố định cũng góp phần tăng cường tính ổn định của enzyme. Hơn nữa, hoạt tính hoàn toàn được giữ lại khi bảo quản ở 4°C trong 25 ngày. Phương pháp này đã được chứng minh là rất đơn giản và có thể được thực hiện cho các enzym khác. [17]. Law và cộng sự (2007) đã nghiên cứu phát triển một công thức mới nhằm ổn định enzyme Nattokinase và kiểm soát tốc độ giải phóng của nó khi qua đường tiêu hóa bằng cách nén enzyme Nattokinase cùng các tá dược thành viên nén sau đó được phủ bởi hỗn hợp Eudragit® L100-55 (EL100-55) và Hydroxypropylcellulose (HPC) bằng cách nén trực tiếp [39]. 12