Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL-6, IL-6R và đánh giá khả năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:210

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Dược học "Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL-6, IL-6R và đánh giá khả năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh" trình bày các nội dung chính sau: Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu; Đánh giá in vitro các chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R và khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6; Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL-6, IL-6R và đánh giá khả năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN QUẾ HƢƠNG NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÁC CẤU TRÚC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG GẮN KẾT IL-6, IL-6R VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GẮN KẾT BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP LÝ SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN QUẾ HƢƠNG NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÁC CẤU TRÚC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG GẮN KẾT IL-6, IL-6R VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GẮN KẾT BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP LÝ SINH NGÀNH: HÓA DƢỢC MÃ SỐ: 9720203 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ MINH TRÍ TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2024
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy GS. TS. Lê Minh Trí. Cảm ơn Thầy đã định hướng nghiên cứu và hỗ trợ mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Thầy GS. TS. Thái Khắc Minh, TS. Nguyễn Quốc Thái, các thầy cô trong Bộ môn Hóa dược, bộ môn Hóa sinh đã tạo điều kiện tốt nhất về cả tinh thần và cơ sở vật chất để luận án được thực hiện đúng tiến độ. Đặc biệt, trong thời gian thực hiện luận án, tôi vô cùng biết ơn Thầy GS.TS. Thái Khắc Minh đã giúp đỡ tận tình để các công trình khoa học của luận án được chấp nhân đăng trên các tạp chí quốc tế uy tín. Luận án được hoàn thiện về cả nội dung và hình thức chính nhờ sự góp ý tận tâm và tích cực từ các thầy cô trong hội đồng đánh giá bộ môn Hóa dược, hội đồng đánh giá cấp cơ sở và phản biện độc lập. Chân thành cảm ơn các quý thầy cô rất nhiều. Cảm ơn quý thầy cô ở Trường Đại học Kỹ thuật Y-Dược Đà Nẵng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình công tác để luận án có thể hoàn thành đúng hạn. Cảm ơn Thúy Nga, Thành Tấn, Thiện Vy, Công Luận, Hoàng Tùng, Đắc Nhân, Quỳnh Hƣơng, Hoàng Nhi, Thanh Phƣơng, Thảo Vy và Kim Hƣng. Cảm ơn các em đã luôn đồng hành cùng chị trong suốt thời gian thực hiện luận án. Cuối cùng, nếu không có sự hỗ trợ lớn từ gia đình, con đường đến đích ngày hôm nay cũng sẽ lắm chông gai. Tự đáy lòng, con cảm ơn Ba Mẹ đã luôn ở bên động viên con. Cảm ơn Anh và Con đã luôn là hậu phương vững chắc cho cuộc hành trình đầy gian nan và nhiều thử thách, tiếp thêm cho em vô vàn sức mạnh để vượt qua. Trân trọng! TP. Hồ Chí Minh, ngày.....tháng.....năm 2024 Tác giả Trần Quế Hƣơng
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi là Nghiên cứu sinh ngành Hóa Dược, khóa 2019 – 2022, xin cam đoan: (1) Luận án là do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học của người hướng dẫn; (2) Các tài liệu tham khảo được tôi xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng, trích dẫn và liệt kê tài liệu tham khảo đầy đủ; (3) Kết quả trình bày trong luận án được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của bản thân tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ đề tài cùng cấp nào khác. TP. Hồ Chí Minh, ngày....tháng....năm 2024 Ngƣời hƣớng dẫn Tác giả thực hiện GS.TS. Lê Minh Trí Trần Quế Hƣơng
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ......................................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT– THUẬT NGỮ ANH-VIỆT ..................................... v DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... x DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... xii ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 1.1. Interleukin 6 và đường truyền tín hiệu ...................................................................... 3 1.2. Thiết kế thuốc in silico ............................................................................................ 19 1.3. Các phương pháp thử nghiệm lý sinh đánh giá khả năng gắn kết IL6, IL6R và phối tử............................................................................................................................. 27 1.4. Thử nghiệm hoạt tính trên tế bào ung thư ............................................................... 32 1.5. Các nghiên cứu liên quan ........................................................................................ 33 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 36 2.1. Thiết kế nghiên cứu ................................................................................................. 36 2.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 37 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 42 2.4. Phương pháp nghiên cứu và công cụ đo lường ....................................................... 42 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ............................................................................................... 55 3.1. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu.................................................................................................................................. 55
iv 3.2. Đánh giá in vitro các chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R, khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6 ...................... 74 3.3. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu ....... 81 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................................ 93 4.1. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu.................................................................................................................................. 93 4.2. Đánh giá in vitro các chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R, khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6 .................... 110 4.3. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu ..... 123 KẾT LUẬN ................................................................................................................. 131 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 133 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ........................... 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ PHỤ LỤC ..........................................................................................................................
v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT – THUẬT NGỮ ANH-VIỆT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ACE2 Angiotensin-converting enzyme 2 Enzym chuyển hóa angiotensin 2 AD Alzheimer's disease Bệnh Alzheimer ADMET Absorption, distribution, Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải metabolism, excretion and toxicity trừ và độc tính Ala Alanine Alanin Asp Aspatic acid Acid aspatic Asn Asparagine Asparagin Arg Arginine Arginin BBB Blood–brain barrier Hàng rào máu não BCR B-cell receptor Thụ thể tế bào B CADD Computer-Aid Drug Design Thiết kế thuốc dựa trên máy tính CBD Cytokin binding domain Miền liên kết cytokin CD80 Cluster of differentiation 80 Cụm biệt hóa 80 CD86 Cluster of differentiation 86 Cụm biệt hóa 86 CNTF Ciliary neurotrophic factor Yếu tố dinh dưỡng thần kinh thể mi CML Chronic myelogenous leukemia Ung thư bạch cầu tủy mạn CLC Cytokine like cardiotrophin Cytokin giống cardiotrophin COPD Chronic obstructive pulmonary Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính disease CSF Cerebrospinal fluid Dịch não tủy CRC Colorectal cancer Ung thư đại tràng CRP C-reactive protein Protein phản ứng C CS Cytokin storm Bão cytokin CSDL Cơ sở dữ liệu CT-1 Cardiotrophin-1 Cardiotrophin-1 Cys Cystein Cystein DC Dendritic cell Tế bào tua
vi DB Drugbank Ngân hàng thuốc EGFR Epidermal growth factor receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ELISA Enzyme linked immunosorbent Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên assay kết với enzym EPR Electron paramagnetic resonance Quang phổ cộng hưởng thuận từ điện tử IUPAC International Union of Pure and Hiệp hội Hóa học Thuần túy và Ứng Applied Chemistry dụng Quốc tế GP130 Glycoprotein 130 Glycoprotein 130 Gln Glutamine Glutamin Glu Glutamic acid Acid glutamic JAK Janus kinase Janus kinase ICU Intensive Care Unit Đơn vị chăm sóc đặc biệt IL1β Interleukin 1β Interleukin 1β IL6 Interleukin 6 Inteuleukin 6 IL6R Interleukin 6 receptor Thụ thể inteuleukin 6 IL8 Interleukin 8 Interleukin 8 IL10 Interleukin 10 Interleukin 10 IL11 Interleukin 11 Interleukin 8 IL27 Interleukin 27 Interleukin 27 INF β2 Interferon beta 2 Interferon beta 2 ITC Isothermal titration calorimetry Phép đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt FDA Food and drug administration Cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ FNIII Fibronectin III Fibronectin loại III HBD Hydrogen bond donor Nhóm cho hydro HBA Hydrogen bond acceptor Nhóm nhận hydro HCC Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào ga
vii HIA Human intestinal absorption Hấp thu qua đường tiêu hóa ở người HIV Human immunodeficiency virus Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người HTRF Homogeneous Time Resolved Huỳnh quang phân giải theo thời Fluorescence gian HRP Orseradish peroxidase Enzym peroxidase cải ngựa LDB Ligand-based drug design Thiết kế thuốc dựa trên phối tử Leu Leucine Leucin LIF Leukemia inhibitory factor Yếu tố ức chế bệnh bạch cầu Lys Lysine Lysin MAPK Mitogen-activated protein kinase Protein kinase hoạt hóa bằng mitogen MCP-1 Monocyte chemoattractant Protein hóa hấp dẫn đơn bào 1 protein-1 MD Molecular dynamics Động lực học phân tử mIL6R Membrance interleukin 6 receptor Thụ thể interleukin 6 gắn màng MMPBSA Molecular mechanics Poisson– Cơ học phân tử diện tích bề mặt Boltzmann surface area Poisson–Boltzmann MMGBSA Molecular mechanics generalized Cơ học phân tử tổng quát hóa diện Born surface area tích bề mặt Born MS Multiple sclerosis Bệnh đa xơ cứng NCI National Cancer Institute Viện ung thư Quốc Gia NFTs Neurofibrillary tangles Rối loạn sợi thần kinh NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain- Yếu tố hạt nhân kappa-tăng cường enhancer of activated B cells chuỗi ánh sáng của các tế bào B được kích hoạt NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NSCLC Non-small cell lung cancer Ung thư phổi không tế bào nhỏ PAR-1 Protease-activated receptor 1 Chất chủ vận thụ thể protease-1
viii PDB Protein Data Bank Ngân hàng dữ liệu Protein PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase Phosphatidylinositol-3-kinase Phe Phenylalanine Phenylalanin PLIF Protein-Ligand Interaction Phân tích dấu vân tay tương tác Fingerprinting protein phối tử PLNB Phân lập nội bộ PKB Protein kinase B Protein kinase B PPI Protein-protein interaction Tương tác protein-protein PDGFR The platelet-derived growth factor Thụ thể yếu tố tăng trưởng tiểu cầu receptor Pro Proline Prolin OSM Oncostatin M Oncostatin M SAA Serum Amyloid A Amyloid huyết thanh A SASA Solvent-accessible surface area Diện tích bề mặt có thể tiếp cận được bằng dung môi SBD Structure-based drug design Thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc sIL-6R Solube interleukin 6 receptor Thụ thể interleukin 6 hòa tan SMPPIIs Small-molecule protein-protein Các chất ức chế tương tác protein- interation inhibitors protein phân tử nhỏ SPR Surface plasmon resonance Phổ cộng hưởng plasmon bề mặt STAT Signal transducer and activator of Bộ chuyển đổi tín hiệu và kích hoạt transcription phiên mã SYK Spleen tyrosine kinase Tyrosin kinase lách RA Rheumatoid arthritis Viêm khớp dạng thấp RMSD Root mean square deviation Độ lệch bình phương trung bình RMSF Root mean square fluctuation Dao động bình phương trung bình Rg Radius of gyration Bán kính hồi chuyển TGF-β Transforming growth factor-beta Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng- beta
ix Th 17 T helper 17 cell Tế bào trợ giúp T 17 Thr Threonine Threonin TR-FRET Time-resolved fluorescence Truyền năng lượng huỳnh quang energy transfer theo thời gian TLR Toll like receptor Thụ thể giống Toll Trp Trytophan Tryptophan TPSA Topological polar surface area Diện tích bề mặt phân cực hình học Topo TYK Tyrosine kinase Tyrosin kinase
x DANH MỤC BẢNG Bảng Bảng 1.1. Các acid amin nằm ở bề mặt tương tác của phức hợp IL6/IL6R/gp130 ................... 12 Bảng 1.2. Các thuốc nhắm mục tiêu IL6/IL6R/gp130 và các giai đoạn phát triển lâm sàng .... 18 Bảng 1.3. Các nghiên cứu liên quan đến đích tác động IL6, IL6R và gp130............................ 34 Bảng 2.1. Thông tin cấu trúc phức hợp IL6 với thụ thể IL6R và kháng thể trên RCSB PDB . 37 Bảng 2.2. Phần mềm được sử dụng trong nghiên cứu ............................................................... 41 Bảng 3.1. Tương tác giữa các acid amin quan trọng của IL6 với IL6R tại vị trí I ................... 55 Bảng 3.2. Tương tác giữa các acid amin quan trọng của IL6 và 6F82 tại vị trí I ..................... 57 Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc các chất gắn kết IL6, IL6R qua các mô hình 3D-pharmacophore và mô hình gắn kết docking phân tử tại vị trí I......................................................................... 60 Bảng 3.4. Điểm số docking chéo của các chất gắn kết IL6 và IL6R tiềm năng tại vị trí I ....... 62 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá các thông số dược động học ADMET của 23 chất không đáp ứng các đặc tính của thuốc phân tử sử dụng đường uống bằng công cụ SwissADME và pkCSM . 63 Bảng 3.6. Giá trị trung bình của RMSD protein, RMSD phối tử, SASA và Rg được tính toán từ dữ liệu quỹ đạo MD 100 ns của IL6 tại vị trí I ở dạng apoprotein và các phức hợp phối tử. .................................................................................................................................................. 66 Bảng 3.7. Giá trị trung bình của RMSD protein, RMSD phối tử, SASA và Rg được tính toán từ dữ liệu quỹ đạo MD 100 ns của IL6R ở dạng apoprotein và các phức hợp phối tử. ........... 70 Bảng 3.8. Tỷ lệ liên kết hydro giữa các phối tử với các ―điểm nóng‖ tại khoang gắn kết IL6R .................................................................................................................................................. 71 Bảng 3.9. Năng lượng tự do gắn kết của 15 phối tử tiềm năng với IL6R tại khoang gắn kết .. 73 Bảng 3.10. Giá trị % ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R của 13 chất ở nồng độ 100 µM ...... 75 Bảng 3.11. Giá trị % ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R của 6 chất tiềm năng ở nồng độ ..... 75 Bảng 3.12. Tỷ lệ tế bào tăng sinh dưới tác động hoạt hóa của IL6 trên 2 dòng tế bào ung thư gan HepG2 và Hu7 theo thời gian 48 và 72 giờ ....................................................................... 77 Bảng 3.13. Tỷ lệ tế bào tăng sinh dưới tác động hoạt hóa của IL6 trên dòng tế bào ung thư LNCaP theo thời gian 24, 48, 72 và 96 giờ .............................................................................. 77 Bảng 3.14. Tỷ lệ tế bào tăng sinh dưới tác động hoạt hóa của IL6 trên dòng tế bào ung thư SW480 và HT29 theo thời gian 24 và 48 giờ. .......................................................................... 77
xi Bảng 3.15. Tỷ lệ tế bào HT-29 sống dưới tác động của 13 chất ức chế ở nồng độ 10 µM ...... 78 Bảng 3.16. Tỷ lệ tế bào HT-29 sống dưới tác động của 8 chất ―tinib‖ ở nồng độ 0,1 µM ...... 79 Bảng 3.17. Tỷ lệ tế bào HT-29 sống dưới tác động của baicalin và chrysin ở nồng độ 100 µM .................................................................................................................................................. 79 Bảng 3.18. Tương tác giữa các acid amin quan trọng của IL6 và Olokizumab tại vị trí IIIa ... 82 Bảng 3.19. Kết quả sàng lọc các thư viện chất qua các mô hình pharmacophore và gắn kết docking phân tử tại khoang gắn kết IL6 ................................................................................... 84 Bảng 3.20. Điểm số docking của các chất gắn kết tốt nhất lên IL6 ở vị trí IIIa ....................... 86 Bảng 3.21. Kết quả đánh giá các thông số dược động học ADMET của 24 chất không đáp ứng các tiêu chí của thuốc phân tử nhỏ sử dụng đường uống bằng công cụ SwissADME và pkCSM ...................................................................................................................................... 87 Bảng 3.22. Tỷ lệ liên kết H giữa 6 phối tử tiềm năng với các acid amin quan trọng của IL6 tại vị trí IIIa trong mô phỏng MD 100 ns ...................................................................................... 90 Bảng 4.1. Tóm tắt các mô hình 3D-pharmacophore được truy vấn dựa trên PPIs trong các nghiên cứu trước và trong nghiên cứu này ............................................................................... 95 Bảng 4.2. Tóm tắt các mô hình docking nhằm tìm kiếm các chất ức chế IL6, IL6R được công bố trong các nghiên cứu trước và trong nghiên cứu này .......................................................... 99 Bảng 4.3. Kết quả đánh giá khả năng gắn kết quercetin với IL6R tại vị trí I qua các mô hình sàng lọc in silico ..................................................................................................................... 109 Bảng 4.4. Tóm tắt các nghiên cứu đánh giá IC50 dựa trên Kit thử nghiệm ELISA cạnh tranh của các nghiên cứu trước và nghiên cứu này.......................................................................... 111 Bảng 4.5. Tóm tắt các nghiên cứu tăng sinh tế bào LNCaP, HepG2, Hu7, SW480 và HT-29 qua trung gian IL6 ngoại sinh ở các nghiên cứu trước và nghiên cứu này............................. 114 Bảng 4.6. Tóm tắt các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế của imatinib trên các dòng tế bào khác nhau và trong nghiên cứu này ........................................................................................ 117 Bảng 4.7. Tóm tắt các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế của dacomitinib trên các dòng tế bào khác nhau và trong nghiên cứu này ................................................................................. 119 Bảng 4.8. Tóm tắt các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào của quercetin trên các nghiên cứu khác và nghiên cứu này. ......................................................................... 121 Bảng 4.9. Tóm tắt các mô hình docking nhằm tìm kiếm các chất ức chế IL6 tại vị trí IIIa được công bố trong nghiên cứu của Li và trong nghiên cứu này .................................................... 125 Bảng 4.10. Kết quả đánh giá gắn kết ZINC01183742 với IL6 tại vị trí IIIa qua các mô hình sàng lọc in silico ..................................................................................................................... 129
xii DANH MỤC HÌNH Hình Hình 1. 1. Sự kết hợp giữa interleukin họ IL6 với thụ thể đặc hiệu và thụ thể chung gp130 ..... 3 Hình 1.2. Chức năng sinh học của interleukin 6 đối với các tế bào liên quan ............................ 4 Hình 1.3. Cấu trúc không gian ba chiều IL6 (A) và vị trí tương tác của IL6 với thụ thể (B) ..... 5 Hình 1.4. Cấu trúc 2D vùng ngoại bào IL6R (A) và các vị trí tương tác tương ứng (B) ............ 6 Hình 1.5. Cơ chế tạo thành sIL6R từ mIL6R và các ghép nối thay thế mRNA .......................... 7 Hình 1.6. (A) Cấu trúc 2D của gp130, (B) miền tương tác của gp130 với các cytokin họ IL6 .. 8 Hình 1.7. Các con đường tín hiệu khác nhau được kích thích bởi IL6...................................... 10 Hình 1.8. Quy trình thiết kế thuốc in silico ............................................................................... 19 Hình 1.9. Nguyên lý hoạt động của bộ KIT thử nghiệm HTRF® ức chế tương tác IL6/IL6R. . 28 Hình 1.10. Nguyên lý hoạt động của Kit thử nghiệm gắn kết RayBio® IL6/IL6R. .................. 32 Hình 1.11. Quá trình khử hóa MTT thành formazan................................................................. 33 Hình 1.12. Cấu trúc 2D của 8 chất ức chế IL6/IL6R/gp130 từ các nghiên cứu liên quan ........ 35 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ...................................................................................... 36 Hình 2.2. Cấu trúc 3D phức hợp IL6 với thụ thể và kháng thể. (A) Phức hợp IL6 /IL6R/VHH6 (PBD ID: 5FUC), (B) Phức hợp IL6/6F82 (PDB ID: 4ZS7), (C) Phức hợp IL6/Olokizumab (PDB ID: 4CNI) ....................................................................................................................... 38 Hình 2.3. Quy trình mô phỏng động lực học phân tử ............................................................... 47 Hình 2.4. Phần trăm ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R ......................................................... 51 Hình 2.5. Sự tăng sinh tế bào sống trong thử nghiệm MTT ..................................................... 52 Hình 3.1. Các mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng dựa trên PPIs được ánh xạ trên các cấu trúc IL6 (Ph-IL6-1a, A) và IL6R (Ph-IL6R, B). ................................................................ 56 Hình 3.2. Mô hình 3D-pharmacophore (Ph-IL6-1b) dựa trên PPIs với kháng thể 6F82 được ánh xạ lên cấu trúc IL6. ............................................................................................................ 57 Hình 3.3. Mô hình gắn kết docking phân tử cho chất gắn kết IL6 tại vị trí I (A) dựa trên tương tác với IL6R (D-IL6-1a, B) và với kháng thể 6F82 (D-IL6-1b, C). ......................................... 58 Hình 3.4. Mô hình gắn kết docking phân tử cho chất gắn kết IL6R (D-IL6R) tại vị trí I ........ 59
xiii Hình 3.5. Tỷ lệ phân bố điểm số docking của 3 CSDL DB, ZINC15 và NCI trên 3 mô hình gắn kết docking phân tử (D-IL6-1a, D-IL6-1b, D-IL6R) ......................................................... 60 Hình 3.6. Phân tích PLIF cho các chất DB, ZINC15và NCI qua 3 mô hình gắn kết docking phân tử (D-IL6-1a, D-IL6-1b, D-IL6R) ................................................................................... 61 Hình 3.7. Cấu trúc 2D của 28 chất tiềm năng tương tác tại khoang gắn kết IL6 ..................... 64 Hình 3.8. Biểu đồ RMSF của các phối tử với IL6a (a1, a2, a3) và IL6b ................................. 67 Hình 3.9. Tỷ lệ liên kết hydro giữa 38 phối tử với các acid amin quan trọng tại khoang gắn kết của IL6 ở vị trị I ........................................................................................................................ 68 Hình 3.10. Năng lượng tự do gắn kết giữa 23 phối tử tiềm năng với IL6 tại vị trí I ................ 69 Hình 3.11. Biểu đồ RMSF của các phối tử với IL6R. .............................................................. 71 Hình 3.12. Tương tác giữa 15 phối tử tiềm năng với các ―điểm nóng‖ của IL6R ................... 72 Hình 3.13. Kết quả sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu ....................................................................................................................................... 74 Hình 3.14. Biểu đồ IC50 ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R của quercetin, dabigatran và dacomitinib ............................................................................................................................... 76 Hình 3.15. Tỷ lệ tế bào sống (TBS2) khi có 6 chất ức chế imatinib, dacomitinib, entospletinib, dabigatran, quercetin, rhamnetin được hoạt hóa bởi IL6. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng với *P
xiv Hình 3.22. Sơ đồ tương tác chi tiết của các nhóm cấu trúc trong phối tử với các acid amin quan trọng của IL6. Trong đó, các hình A, B, C, D lần lượt tương ứng với DB00619, DB15187, ZINC13348421 và ZINC01182742 ........................................................................ 91 Hình 3.23. Biểu đồ năng lượng tự do gắn kết giữa IL6 và 4 phối tử tiềm năng. ...................... 92 Hình 3.24. Kết quả sàng lọc in silico chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu 92 Hình 4.1. Ánh xạ của 3 chất DB gắn kết tiềm năng trong 3 mô hình gắn kết docking phân tử lên 3 mô hình pharmacophore .................................................................................................. 98 Hình 4.2. Biểu đồ dao động RMSD_protein của 12 phức hợp protein-phối tử tiềm năng có biên độ dao động thấp nhất ..................................................................................................... 102 Hình 4.3. Biểu đồ dao động RMSD_phối tử của 4 phức hợp protein-phối tử tiềm năng có biên độ dao động thấp nhất............................................................................................................. 103 Hình 4.4. Cấu trúc 2D của 8 hợp chất hàng đầu gắn kết tiềm năng với IL6 tại vị trí I trong mô MD 100 ns mô phỏng ............................................................................................................. 104 Hình 4.5. Cấu trúc 2D của 8 phối tử không tương tác được với các acid amin quan trọng trong khoang gắn kết của IL6R tại vị trí I ........................................................................................ 105 Hình 4.6. Cấu trúc 2D của 4 hợp chất DB14726, DB11986, quercetin và chrysin cho tương tác tốt nhất với IL6R tại khoang gắn kết vị trí I trong mô phỏng MD 100 ns ........................ 106 Hình 4.7. Cấu trúc 2D được tối ưu hóa của phối tử có thể cho tương tác tốt với các acid amin quan trọng tại khoang gắn kết của IL6R................................................................................. 107 Hình 4.8. Cấu trúc 2D của dacomitinib và hình ảnh tương tác tại khoang gắn kết IL6R ...... 112 Hình 4.9. Cấu trúc 2D và hình ảnh tương tác của entospletinib tại khoang gắn kết IL6, IL6R. ................................................................................................................................................ 118 Hình 4.10. Tương tác protein-protein giữa IL6 và kháng thể Olokizumab. (A) Cấu trúc tinh thể tia X của phức hợp Olokizumab/IL6 và các vị trí gắn kết. (B) và (C) Các acid amin quan trọng của IL6 (màu đỏ) và chuỗi nặng (xanh lam) và chuỗi nhẹ (màu xám) của Olokizumab. ................................................................................................................................................ 123 Hình 4. 11. Ánh xạ của 3 chất NCI, ZINC15, DB tiềm năng của mô hình gắn kết docking phân tử D-IL6-3a lên mô hình 3D-pharmacophore Ph-IL6-3a1 ............................................ 124 Hình 4.12. Cấu trúc 2D của 4 chất tiềm năng trong tương tác với các acid amin quan trọng của IL6 tại vị trí IIIa trong mô phỏng MD 100 ns ........................................................................ 127
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, vai trò của các cytokin tiền viêm trong các đáp ứng miễn dịch ngày càng được quan tâm, hầu hết các phương pháp điều trị chống viêm mới đều hướng đến mục tiêu điều hòa mức độ các cytokin này. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, nồng độ interleukin 6 (IL6) trong máu tăng cao là nguyên nhân chính gây ra các triệu chứng liên quan đến các bệnh lý viêm như bệnh Crohn, viêm khớp dạng thấp (RA), suy hô hấp cấp trong COVID-19 và ung thư. Các liệu pháp điều trị bằng thuốc sinh học là các kháng thể đơn dòng có khả năng ức chế đường truyền tín hiệu của IL6 như tocilizumab, salirumab, olokizumab đã và đang được phát triển.1,2 Trong bệnh lý viêm, IL6 đóng vai trò quyết định trong sự chuyển đổi từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính bằng cách thay đổi bản chất sự tập trung bạch cầu tại ổ viêm từ bạch cầu trung tính đa nhân thành bạch cầu đơn nhân/đại thực bào.3 Ngoài ra, IL6 còn có tác dụng kích thích lên tế bào T và B, tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng viêm mạn tính. Đường truyền tín hiệu của IL6 được hình thành khi IL6 kết hợp với thụ thể đặc hiệu IL6R dạng hòa tan tại vị trí I và thụ thể truyền tin glycoprotein130 (gp130) tại vị trí IIIa, từ đó kích hoạt các tín hiệu xuôi dòng như JAK/STAT và gây ra các bệnh lý liên quan.4,5 Trong bệnh lý ung thư, cytokin này được xác định như một dấu ấn sinh học ung thư thông qua việc sàng lọc các chất trung gian gây viêm.6 Khi đường truyền tín hiệu IL6/JAK/STAT3 tăng hoạt động một cách bất thường dẫn đến thúc đẩy sự tăng sinh, sống sót, xâm lấn và di căn của các tế bào, đồng thời ngăn chặn phản ứng miễn dịch chống khối u.7 Thông qua việc điều chỉnh các yếu tố tác động đến đường truyền tín hiệu IL6, cụ thể là vị trí tương tác giữa IL6 với IL6R (vị trí I) và gp130 (vị trí IIIa), các nhà nghiên cứu hướng tới cải thiện kết quả điều trị của bệnh nhân ung thư bằng cách tăng cường các đáp ứng hướng đích hiệu quả.8 Có thể thấy rằng, chiến lược điều trị viêm và ung thư nhắm vào mục tiêu IL6 là hữu hiệu, đặc biệt là hướng phát triển các thuốc có cấu trúc phân tử nhỏ sử dụng đường uống đang trở thành hướng nghiên cứu tiềm năng. Trên đường truyền tín hiệu của IL6, các thế hệ thuốc cấu trúc phân tử nhỏ ức chế IL6 thông qua ức chế các janus kinase (JAKs) như tofacitinib, ruxolitinib,
2 baricitinib hay ức chế gp130 như bazedoxifen, raloxifen đã được phát triển,9 nhưng vẫn chưa có chất phân tử nhỏ nào ức chế thông qua gắn kết trực tiếp lên IL6 hoặc IL6R được công bố. Đa phần các nghiên cứu chỉ dừng lại ở thử nghiệm in vitro. Nguyên nhân có thể do các nghiên cứu trước thiếu thông tin về cấu trúc protein mục tiêu hoặc chọn protein không phù hợp, cũng như việc đánh giá ái lực gắn kết protein- phối tử chưa được chú trọng.10-12 Độc tính cũng như việc không thỏa các tiêu chí dược động học có thể là một trong những rào cản lớn cho các thuốc phân tử nhỏ. Sàng lọc in silico dựa trên cấu trúc protein mục tiêu kết hợp thử nghiệm lý sinh trên in vitro chính là nền tảng cho nghiên cứu tìm kiếm các các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế IL6. Bên cạnh đó, việc dự đoán các đặc tính dược động học giúp giảm thiểu được rủi ro cho các bước thử nghiệm tiền lâm sàng, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí cho nghiên cứu. Hiện nay, các cấu trúc 3D protein dạng đơn lẻ và phức hợp của IL6, IL6R đã được xác định và công bố trên ngân hàng dữ liệu protein (Protein databank – RCSB), theo đó mô hình hóa về sự tương tác giữa các protein này cũng ngày càng sáng tỏ.10-12 Thêm vào đó, sự phát triển của các thư viện cấu trúc phân tử nhỏ khiến cho hướng thiết kế thuốc ức chế IL6 dựa trên cấu trúc trở nên tiềm năng. Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu trước đây của Li,13 Zhou14 và Sato15 chỉ mới dừng lại ở giai đoạn docking, chưa tiến hành phân tích chi tiết tương tác linh động giữa protein-phối tử bằng phương pháp mô phỏng động lực học phân tử hoặc không tiến hành dự đoán các đặc tính dược động học cho thuốc phân tử nhỏ dùng đường uống như nghiên cứu của Sharma,16 điều này cũng có thể trở thành trở ngại lớn cho các thử nghiệm in vitro, in vivo. Vì vậy, để lấp đầy các khoảng trống của các nghiên cứu trước, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu ―Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL6, IL6R và đánh giá khả năng năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh‖, tập trung vào các nội dung cụ thể như sau: 1. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu 2. Đánh giá in vitro các chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R và khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6. 3. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu
3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Interleukin 6 và đƣờng truyền tín hiệu 1.1.1. Họ interleukin 6 Họ cytokin IL6 thuộc nhóm cytokin bốn vòng xoắn và là một trong những họ cytokin lớn nhất, bao gồm IL6, IL11, yếu tố ức chế bệnh bạch cầu (LIF), oncostatin M (OSM), yếu tố dinh dưỡng thần kinh thể mi (CNTF), cytokin giống cardiotrophin (CLC), cardiotrophin -1 (CT-1) và IL27. Các cytokin này sử dụng chung thụ thể truyền tín hiệu gp130 thông qua các homodimer hoặc heterodimer gp130. Hoạt tính sinh học riêng biệt của các cytokin thuộc họ IL6 được kiểm soát bởi sự biểu hiện giới hạn của các thụ thể đặc hiệu (thụ thể α) cho từng loại cytokin. Trong họ IL6, chỉ duy nhất IL11 có thể tạo thành với phức hợp hexameric IL11/IL11R/gp130 với 2 tiều đơn vị gp130 tương tự IL6, các cytokin còn lại chỉ liên kết với 1 tiểu đơn vị gp130 sau khi kết hợp với thụ thể đặc hiệu riêng cho từng cytokin.17,18 Hình 1.1 mô tả tương tác của các cytokin họ IL6 với các thụ thể với gp130 là thụ thể truyền tín hiệu chung. Hình 1. 1. Sự kết hợp giữa interleukin họ IL6 với thụ thể đặc hiệu và thụ thể chung gp130 1.1.2. Interleukin 6 IL6 lần đầu tiên được xác định vào năm 1986 bởi Harino và cộng sự như một yếu tố kích thích tế bào B (BSF-2) giúp tăng cường sự biệt hóa của tế bào B, tạo hiệu ứng cho các tế bào sản xuất kháng thể, còn được gọi là IFN-β2. IL6 được tạo ra từ nhiều loại tế
4 bào bao gồm tế bào T và B, bạch cầu đơn nhân, tế bào nội mô, nguyên bào sợi, tế bào sừng, tế bào trung mô, tế bào mỡ và một số tế bào khối u. IL6 liên kết với TGF-β (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta) tạo ra sự biệt hóa của các tế bào T CD4+ sơ cấp thành các tế bào Th17, nhưng IL6 lại ức chế sự phát triển của tế bào T điều hòa (Treg). Sự mất cân bằng giữa tế bào Th17 và tế bào Treg chính là nguyên nhân gây ra rối loạn điều hòa các phản ứng miễn dịch, phát triển các bệnh tự miễn và viêm. IL6 đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng viêm cấp tính, tạo máu, kiểm soát trao đổi chất, tái tạo gan, chuyển hóa xương và tiến triển ung thư thông qua việc tác động lên các tế bào tương ứng.19,20 Hình 1.2 mô tả hoạt tính sinh học của IL6 trên các tế bào khác nhau. Hình 1.2. Chức năng sinh học của interleukin 6 đối với các tế bào liên quan Trong phản ứng viêm cấp tính, IL6 kích thích tế bào gan sản xuất các protein giai đoạn cấp tính (APP) như protein phản ứng C (CRP), fibrinogen, amyloid huyết thanh A (SAA) và hepcidin. Nồng độ cao của amyloid A và hepcidin trong huyết thanh gây ra bệnh amyloidosis và thiếu máu do viêm. Trong tủy xương, IL6 tạo ra các tế bào megakaryocyte (tế bào nhân lớn) trưởng thành, chịu trách nhiệm sản xuất tiểu cầu và thúc đẩy hoạt hóa tế bào gốc tạo máu. Ngoài ra, IL6 còn thúc đẩy sự biệt hóa hủy cốt bào, tạo mạch, tăng sinh tế bào sừng, tế bào trung mô và sự phát triển u tủy.20