Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác động dược lý hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:272

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung của Luận án này là phân tích thực vật và định danh loài Bí kỳ nam thu hái tại Vườn quốc gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang. Chiết xuất và sàng lọc các cao toàn phần Bí kỳ nam. Lựa chọn và khảo sát chất lượng cao chiết. Chiết xuất các cao phân đoạn từ cao toàn phần và phân lập chất. 3. Khảo sát các tác dụng dược lý in vitro và in vivo theo hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác động dược lý hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH MAI NGUYỄN NGỌC TRÁC NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG DƯỢC LÝ HƯỚNG BẢO VỆ GAN, THẬN CỦA BÍ KỲ NAM (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH MAI NGUYỄN NGỌC TRÁC NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG DƯỢC LÝ HƯỚNG BẢO VỆ GAN, THẬN CỦA BÍ KỲ NAM (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae) NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 62720405 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI 2. PGS. TS. NGUYỄN PHƯƠNG DUNG TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2020
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iii DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... iv DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ......................................................................................... v MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................1 1.1. BÍ KỲ NAM..........................................................................................................1 1.2. STRESS OXY HÓA ...........................................................................................10 1.3. GAN VÀ TRESS OXY HÓA .............................................................................20 1.4. THẬN VÀ STRESS OXY HÓA ........................................................................23 1.5. CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN ..........................26 1.6. CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN ........................35 1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ...................................................................41 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................45 2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU .................................................................................45 2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................46 2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.....................................................46 2.4. DUNG MÔI , HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ .......................47 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................50 2.6. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ .............................69 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ..........................................................................................70 3.1. ĐỊNH DANH LOÀI BÍ KỲ NAM ......................................................................70 3.2. CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC CÁC CAO TOÀN PHẦN BÍ KỲ NAM ..........76 3.3. CHIẾT XUẤT VÀ KHẢO SÁT CHẤT LƯỢNG CAO CỒN 50% ....................80 3.4. CÁC CAO PHÂN ĐOẠN VÀ HOẠT TÍNH CAO PHÂN ĐOẠN ....................82 3.5. ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG CỦA CAO CỒN 50% ................................84 3.6. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN CỦA BÍ KỲ NAM ................................................85
3.7. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN CỦA BÍ KỲ NAM..............................................98 3.8. ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ĐƯỜNG UỐNG CỦA CAO CỒN 50% BÍ KỲ NAM ..........................................................................................................111 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ......................................................................................117 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................148
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án Mai Nguyễn Ngọc Trác
ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADH Alcohol dehydrogenase Dehydrogenase rượu AND Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic AIN Acute intersititial nephritis Viêm ống thận mô kẽ cấp AKI Acute kidney injury Tổn thương thận cấp ALD Alcoholic liver disease Bệnh gan do rượu ALDH Aldehyde dehydrogenase Aldehyd dehydrogenase ALT Alanine aminotransferase Alanin aminotransferase AO Acridine orange Acridin cam ARE Antioxidant response element Yếu tố đáp ứng chống oxy hóa ARF Acute renal failure Suy thận cấp ARN Ribonucleic acid Acid ribonucleic AST Aspartate aminotransferase Aspartat aminotransferase ATN Acute tubular necrosis Hoại tử ống thận cấp BSA Bovine Serum Abumin Albumin huyết thanh bò CAT Catalase Catalase CCl4 Carbon tetrachloride Cacbon tetraclorua CKD Chronic kidney disease Bệnh thận mãn CYP Cytochrome Cytochrom DAMPS Damage-associated molecular patterns Thành phần phân tử đi kèm tổn thương DCM Dichloromethane Dichloromethan DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxit DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DTNB 5,5’-Dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) Acid 5,5’-dithio-bis-(2- nitrobenzoic) EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid Acid Ethylen Diamin Tetracetic
ii EGCG Epigallocatechin gallate Epigallocatechin gallat EMEM Eagle's Minimum Essential Medium Môi trường thiết yếu tối thiểu của Eagle EPO Erythropoietin Erythropoietin ERA-EDTA European Renal Association - Tổ chức cấy ghép, lọc thận – Hiệp European Dialysis and Transplant hội thận Châu Âu Association ERK Extracellular signal-regulated kinase Kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat GPx Glutathione peroxidase Glutathion peroxidase GSH Glutathione Glutathion GGT Gamma-glutamyl transpeptidase Gamma-glutamyl transpeptidase Hb Hemoglobin Hemoglobin HCC Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan HE Hematoxylin Eosin Hematoxylin Eosin HO-1 Heme oxygenase-1 Heme oxygenase-1 HSOS Hepatic sinusoidal obstruction Hội chứng tắc nghẽn xoang gan syndrome HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IL Interleukin Interleukin iNOS Inducible nitric oxide synthase Cảm ứng tổng hợp nitric oxid I.P. Intraperitoneal injection Tiêm phúc mô ISN International Society of Nephrology Hiệp hội thận quốc tế Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1 Protein liên kết với ECH giống như Kelch 1 LDH Lactate dehydrogenase Lactat dehydrogenase MAPK Mitogen-activated protein kinase Protein kinase hoạt hóa phân bào MDA Malondialdehyde Malondialdehyd
ii MTT 3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- 3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazolium bromide Diphenyltetrazolium bromid) NAC N-acetyl cysteine N-acetyl cystein NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu NADH Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamid adenin dinucleotid NALFD Nonalcoholic fatty liver disease Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu NAPQ1 N-acetyl-p-benzoquinone imine N-acetyl-p-benzoquinon imin NF-κB Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NOQ1 NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 NAD(P)H-quinon oxidoreductase 1 Nrf2 Nuclear erythroid 2-related factor Yếu tố liên quan nhân erythroid 2 NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drug Thuốc kháng viêm không steroid OD Optical Density Mật độ quang P.O. Per os Đường uống PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PEG Polyethylene glycol Polyethylen glycol PVDF Polyvinylidene difluoride Polyvinyliden difluorid rbcL Ribulose-1,5-biphosphate carboxylate Gen ribulose-1,5- biphosphat carboxylat RNS Reactive nitrogen species Các gốc chứa ni tơ hoạt động ROS Reactive oxygen species Các gốc chứa oxy hoạt động S.C. Subcutaneous Dưới da SOD Superoxide Superoxid TAA Thioacetamide Thioacetamid TGF Transforming growth factor Yếu tố tăng trưởng TNB 5'- Thio - 2-nitrobenzoic acid Acid 5'- Thio - 2-nitrobenzoic TNF-α Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u WHO World Health Organisation Tổ chức Y tế Thế giới
iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nguyên tố vô cơ có trong Bí kỳ nam ....................................................4 Bảng 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của Bí kỳ nam ........................................................7 Bảng 1.3 Một số mô hình in vitro gây tổn thương gan bởi CCl4 tế bào HepG2 .......28 Bảng 1.4 So sánh các mô hình đánh giá tác động bảo vệ gan ..................................29 Bảng 1.5 Một số mô hình in vivo gây tổn thương gan bởi CCl4 ...............................32 Bảng 1.6 Một số nghiên cứu trên mô hình in vitro gây độc tế bào thận ...................36 Bảng 1.7 Một số nghiên cứu trên mô hình in vivo gây độc thận ..............................40 Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu ....................47 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị đã sử dụng trong nghiên cứu ........................................49 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi rbcL sử dụng trong phản ứng PCR ................................73 Bảng 3.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học dược liệu Bí kỳ nam ...........74 Bảng 3.3 Độ ẩm và độ tro của dược liệu Bí kỳ nam .................................................75 Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol toàn phần của dược liệu Bí kỳ nam .....................76 Bảng 3.5 Phương trình tuyến tính, IC50 của các cao Bí kỳ nam (DPPH) .................77 Bảng 3.6 Phương trình tuyến tính, IC50 của các cao Bí kỳ nam (MDA) ..................77 Bảng 3.7 Hoạt tính của cao Bí kỳ nam đối với sự tăng trưởng các dòng tế bào .......78 Bảng 3.8 Giá trị hồi quy đa thức và IC50 các cao toàn phần Bí kỳ nam....................80 Bảng 3.9 Độ ẩm và độ tro của cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam ..........................81 Bảng 3.10 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (DPPH) ...........................82 Bảng 3.11 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (MDA)............................82 Bảng 3.12 Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào gan HepG2 .......85 Bảng 3.13 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do CCl4 gây ra .....................................................................................................85 Bảng 3.14 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa tình trạng hoại tử tế bào gan HepG2 do CCl4 gây ra .....................................................................................................89 Bảng 3.15 Trọng lượng chuột trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam ..91 Bảng 3.16 Hoạt tính TNF-α trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam .....93 Bảng 3.17 Kết quả vi thể gan chuột trong thử nghiệm bảo vệ gan của Bí kỳ nam...96
iii Bảng 3.18 Tác động của cisplatin ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau lên tế bào HEK 293 nuôi cấy ở các mật độ khác nhau .................................................98 Bảng 3.19 Tác động của cisplatin 25 µM sau 24 giờ xử lý lên tế bào HEK 293....100 Bảng 3.20 Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào HEK 293 ........101 Bảng 3.21 Tác động phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào thận HEK 293 do cisplatin gây ra ..................................................................................................102 Bảng 3.22 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa hoại tử tế bào thận HEK 293 do cisplatin gây ra ..................................................................................................104 Bảng 3.23 Trọng lượng cơ thể chuột trong tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam ..106 Bảng 3.24 Nồng độ ure và creatinin máu trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam ..............................................................................................................107 Bảng 3.25 Hàm lượng GSH thận trong khảo sát tác động bảo vệ thận in vivo ......110 Bảng 3.26 Vi thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam .111 Bảng 3.27 Trọng lượng chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ............112 Bảng 3.28 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số hồng cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ......................................................................113 Bảng 3.29 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số bạch cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ......................................................................114 Bảng 3.30 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số tiểu cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ......................................................................114 Bảng 3.31 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số chức năng gan và thận trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ......................................................115
iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Các chi Tổ kiến thuộc họ Rubiaceae ............................................................1 Hình 1.2 Vị trí phân loại của Bí kỳ nam .....................................................................2 Hình 1.3. Bí kỳ nam (H. formicarum).........................................................................3 Hình 1.4. Bí kỳ nam (H. formicarum Jack.) và Kỳ nam gai (M. tuberosa) ...............3 Hình 1.5. Một số hợp chất phân lập từ Bí kỳ nam ......................................................5 Hình 1.6 Stress oxy hóa ............................................................................................14 Hình 1.7 Mối tương quan giữa stress oxy hóa và viêm ............................................17 Hình 1.8. Cấu trúc vùng của Keap1 ..........................................................................18 Hình 1.9. Cấu trúc vùng của Nrf2 .............................................................................18 Hình 1.10 Vai trò của Nrf2 trong cơ chế điều hòa stress oxy hóa ............................19 Hình 1.11 Cấu tạo gan ...............................................................................................20 Hình 1.12 Cấu trúc thận và nephron .........................................................................23 Hình 1.13 Stress oxy hóa và viêm trong cơ chế tổn thương gan do CCl4 ................32 Hình 1.14 Tế bào HEK 293 nhuộm miễn dịch huỳnh quang và trong môi trường .37 Hình 1.15 Stress oxy hóa và viêm trong tổn thương thận do cisplatin .....................38 Hình 2.1 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu ........................................................................45 Hình 3.1 Bí kỳ nam ..................................................................................................70 Hình 3.2 Cấu tạo giải phẫu rễ Bí kỳ nam ..................................................................71 Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân Bí kỳ nam ..............................................................72 Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu lá Bí kỳ nam ..................................................................72 Hình 3.5 Bột thân củ Bí kỳ nam ................................................................................73 Hình 3.6 Kết quả điện di ADN mẫu lá tươi Bí kỳ nam và sản phẩm PCR ...............73 Hình 3.7 Kết quả định tính polyphenol dược liệu Bí kỳ nam ...................................75 Hình 3.8 Các cao toàn phần từ thân củ Bí kỳ nam....................................................76 Hình 3.9 Cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam............................................................81 Hình 3.10 Cấu trúc của hợp chất BK1 (a) và BK2 (b) ..............................................84 Hình 3.11 Tế bào HepG2 sau 24 giờ xử lý ...............................................................87
iv Hình 3.12 Tác động phòng ngừa tăng sinh gốc tự do tế bào gan HepG2 gây ra bởi CCl4 của các mẫu thử Bí kỳ nam ........................................................................88 Hình 3.13 Tác động của Bí kỳ nam kích hoạt protein Nrf2 ở tế bào HepG2 ...........90 Hình 3.14 Hoạt tính AST, ALT trong tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam..............92 Hình 3.15 Hoạt tính LDH trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam ........93 Hình 3.16 Hàm lượng GSH gan trong khảo sát tác động bảo vệ gan in vivo của Bí kỳ nam do CCl4 gây ra .............................................................................................95 Hình 3.17 Hàm lượng MDA gan trong khảo sát tác động bảo vệ gan in vivo của Bí kỳ nam do CCl4 gây ra ........................................................................................95 Hình 3.18 Đại thể gan chuột trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam ....96 Hình 3.19 Vi thể mô gan trong khảo sát tác động bảo vệ gan Bí kỳ nam (40X) ......97 Hình 3.20 Tỷ lệ ức chế tế bào HEK 293 ở các nồng độ cisplatin, thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào khác nhau ..............................................................................100 Hình 3.21 Tế bào HEK 239 sinh lý và sau 24 giờ xử lý với cisplatin 25 µM ........101 Hình 3.22 Tế bào HEK 293 sau 24 giờ xử lý..........................................................103 Hình 3.23 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa tăng sinh gốc tự do của tế bào thận HEK 293 do cisplatin gây ra ............................................................................105 Hình 3.24 Tác động của Bí kỳ nam kích hoạt protein Nrf2 ở tế bào HEK 293 ......105 Hình 3.25 Nồng độ LDH trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam ......108 Hình 3.26 Hoạt tính TNF-α trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam...108 Hình 3.27 Đại thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam 110 Hình 3.28 Vi thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận Bí kỳ nam ........111 Hình 3.29 Hình ảnh gan và thận chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn của Bí kỳ nam..........................................................................................................112 Hình 3.30 Hình ảnh vi thể gan chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn .116 Hình 3.31 Hình ảnh vi thể thận trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn của cao cồn 50% Bí kỳ nam ..........................................................................................116
v DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất các cao phân đoạn Bí kỳ nam .................................. 57 Sơ đồ 2.2. Quy trình phân lập chất từ cao phân đoạn Bí kỳ nam ............................. 58
MỞ ĐẦU Gan và thận đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa và bài tiết của cơ thể. Do là cửa ngõ tiếp xúc đồng thời là nơi chuyển hóa, bài tiết các chất nên gan và thận cũng là hai cơ quan chịu sự ảnh hưởng của nhiều tác nhân gây tổn thương. Các bệnh về gan và thận chiếm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong lớn trên thế giới. Theo báo cáo về gánh nặng bệnh tật thế giới năm 2019, bệnh gan chiếm khoảng 2 triệu ca tử vong mỗi năm [32]. Trong khi đó, theo báo cáo năm 2018 của Hiệp hội thận quốc tế (International Society of Nephrology, ISN) và Tổ chức cấy ghép, lọc thận – Hiệp hội thận Châu Âu (European Renal Association - European Dialysis and Transplant Association, ERA - EDTA), ước tính khoảng 850 triệu người trên toàn thế giới mắc các bệnh về thận [323], con số này gần gấp đôi số người mắc bệnh đái tháo đường (422 triệu, [234]) và gấp 20 lần số người nhiễm HIV/AIDS (37,9 triệu [327]). Stress oxy hóa đã được chứng minh là một trong các cơ chế chính dẫn đến tổn thương gan, thận cấp và mạn tính [20], [131], [205]. Nhiều hợp chất polyphenol từ dược liệu với tiềm năng chống oxy hóa tốt đã chứng minh tác động bảo vệ gan như silymarin từ cây Kế sữa (Silybum marianum L.) [290], curcumin từ Nghệ (Curcuma longa) [102], andrographolid và neoandrographolid từ Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees), phyllanthin và glycyrrhizin từ Diệp hạ châu (Phyllanthus niruri L.) [185]; bảo vệ thận như ginsenoside Rb3 từ lá Sâm (Panax quonthefolius) [306]; ginsenoside Rh4 và Rk3 từ Nhân sâm (Panax ginseng) [34], hesperidin trong trái cây họ Cam quýt [240]; isoliquiritigenin từ loài Glycyrrhiza [151]... Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ước tính khoảng 60 – 90% dân số các nước đang phát triển sử dụng y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu [300]. Xu hướng sử dụng y học cổ truyền trong hỗ trợ và điều trị bệnh thúc đẩy các nhà khoa học tiến hành nhiều nghiên cứu trên các loại dược liệu và hợp chất chiết xuất thiên nhiên với các hoạt tính sinh học tiềm năng khác nhau. Với khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, có bề dày kinh nghiệm trong việc sử dụng cây thuốc để chữa bệnh, đây là kho tàng giúp phát triển nghiên cứu tạo ra các sản phẩm từ thiên nhiên phục vụ công tác
chăm sóc sức khỏe và phát triển kinh tế. Một trong những loài dược liệu quý ở Việt Nam đã được biết đến là Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.), một loài thuộc nhóm cây “Tổ kiến” (ant-plants), họ Cà phê (Rubiaceae). Một vài loài cây Tổ kiến có giá trị chữa bệnh như H. formicarum Jack., Myrmecodia pendens, M. tuberosa Jack. [123], [165]. Bí kỳ nam (H. formicarum) thuộc chi Hydnophytum thường phân bố các nước châu Á như Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam. Một số nghiên cứu bước đầu cho thấy loài cây này có các thành phần polyphenol, có tác dụng chống oxy hóa in vitro [223], kháng khuẩn [222], ức chế α-glucosidase [84], ức chế sự tăng trưởng của tế bào u xơ HT1080 [285], tế bào ung thư cổ tử cung Hela [248] và bảo vệ tế bào thần kinh [97]. Tại Việt Nam, Bí kỳ nam được tìm thấy ở Vườn quốc gia Phú Quốc, một trong những trung tâm đa dạng sinh học của cả nước. Đây là nơi có hệ động thực vật phong phú và chứa nhiều nguồn gen quý hiếm cần lưu trữ, phát triển và bảo tồn [10]. Từ xa xưa, dân gian Việt Nam đã dùng Bí kỳ nam chữa viêm gan, vàng da, đau nhức gân xương, bong gân, thấp khớp, đau bụng, tiêu chảy… bằng cách sắc hoặc nấu cao uống [5]. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về tác động dược lý cũng như tính an toàn của dược liệu này. Với mong muốn nghiên cứu một cách khoa học công dụng dân gian, các tác dụng dược lý cũng như tính an toàn của dược liệu từ đó góp phần tạo cơ sở cho việc bảo tồn, phát triển, sản xuất sản phẩm thiên nhiên có chất lượng và gia tăng giá trị sử dụng của Bí kỳ nam, “Nghiên cứu tác động dược lý hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)” được thực hiện với các nội dung cụ thể: 1. Phân tích thực vật và định danh loài Bí kỳ nam thu hái tại Vườn quốc gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang. 2. Chiết xuất và sàng lọc các cao toàn phần Bí kỳ nam. Lựa chọn và khảo sát chất lượng cao chiết. Chiết xuất các cao phân đoạn từ cao toàn phần và phân lập chất. 3. Khảo sát các tác dụng dược lý in vitro và in vivo theo hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam. 4. Khảo sát độc tính cấp và độc tính bán trường diễn đường uống của cao Bí kỳ nam.
1 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. BÍ KỲ NAM 1.1.1. Vị trí phân loại Bí kỳ nam có tên khoa học Hydnophytum formicarum Jack. là một loài thuộc chi Hydnophytum, thuộc nhóm cây ‘Tổ kiến’ (ant-plants), họ Cà phê (Rubiaceae). Tên gọi ‘Tổ kiến’ tượng trưng cho nhóm thực vật sống phụ sinh trên các loài cây cổ thụ, có thân phình to tạo các khoang chằng chịt, là nơi cộng sinh của các loài kiến. Các cây ‘Tổ kiến’ cung cấp môi trường sống, chất dinh dưỡng cho kiến; đổi lại, kiến cung cấp chất dinh dưỡng cho cây bằng cách để lại chất thải trong các đường hầm bên trong tổ. Sự cộng sinh này cũng cho phép thực vật thu thập các chất dinh dưỡng hiệu quả từ một diện tích lớn hơn nhiều so với rễ cây có thể che phủ [82]. Hydnophytum là chi lớn nhất trong năm chi của nhóm cây Tổ kiến, bốn chi còn lại là Anthorrhiza, Myrmecodia, Myrmephytum và Squamellaria (Hình 1.1) [126]. Hình 1.1 Các chi Tổ kiến thuộc họ Rubiaceae “Nguồn: Jebb và Huxley, 2009” [126] Trong các chi của cây Tổ kiến, chi lớn nhất được biết đến là Hydnophytum gồm 94 loài, có phân bố rộng nhất, kéo dài từ quần đảo Andaman, Nam Thái Lan, Myanmar, Campuchia, Việt Nam, Malaysia, Indonesia, Philippines, Papua và các đảo, quần đảo Solomon, Vanuatu, Fiji và Peninsula ở Úc. Người dân Sumatra gọi những cây Tổ kiến
2 là rumah semut; ở Jawa: ulek-ulek polo; Papua: Lokon; Malaysia: periok hantu; Thái Lan: Hua roi roo và Việt Nam: Bí kỳ nam, Kì nam kiến [114]. Ở Việt Nam, Bí kỳ nam thường phân bố ở các tỉnh: Kontum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đồng Nai, Lâm Đồng, Quảng Ngãi, Bà Rịa - Vũng Tàu, Vườn quốc gia Bù Gia Mập, Bình Phước, Vườn quốc gia Phú Quốc (Kiên Giang). Vị trí phân loại của Bí kỳ nam: Giới thực vật Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa môi (Lamiidae) Bộ Long Đởm (Gentianales) Họ Cà Phê (Rubiaceae) Chi Hydnophytum Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.) Hình 1.2 Vị trí phân loại của Bí kỳ nam “Nguồn: Jebb và Huxley, 2009” [126] 1.1.2. Đặc điểm thực vật Bí kỳ nam có thân nhỏ, sống phụ sinh bám trên cành cây gỗ cao. Thân phình thành củ lớn, dày và to đến 30 cm, mặt ngoài sần sùi, màu nâu xám bên trong có những lỗ hổng chằng chịt do kiến sống cộng sinh hình thành nhiều lỗ như tổ ong (Hình 1.3a). Từ thân củ mọc ra những rễ nhỏ phía dưới và một vài cành mang lá ở phía trên. Cành ngắn mập, màu nâu. Lá mọc đối, phiến dày, dai, mép nguyên, gốc
3 thuôn, đầu tù, hai mặt có màu lục nhạt, mặt trên nhẵn bóng, hình bầu dục hoặc hình trái xoan dài 6 - 10 cm, rộng 2,5 - 6 cm, gân bên 8 - 10 đôi, lá kèm rụng sớm. Hoa không cuống, tập hợp 4 - 5 cái ở nách lá, màu trắng, đài có ống hình trụ - trứng, cụt ở đầu; tràng 4 cánh thuôn nhọn, dài bằng nửa ống tràng, có 4 túm lông ở họng, nhị 4, đính ở đáy ống tràng, chỉ nhị rất ngắn, bầu 2 ô, đầu nhị xẻ đôi. Hoa mẫu 4. Quả hạch nhỏ, hình thuôn, khi chín màu da cam hay đỏ, bóng, chứa hai hạt, dài 1 - 1,5 cm (Hình 1.3b). Bí kỳ nam (H. formicarum) thường dễ nhầm lẫn với Kỳ nam gai (M. tuberosa) thuộc chi Myrmecodia. với thân củ có gai xếp thành hàng, cành mọc dài và lá to hơn (Hình 1.4) [123]. a b. Hình 1.3. Bí kỳ nam (H. formicarum) (a) Bí kỳ nam bổ đôi (b) Hoa và quả Bí kỳ nam “Nguồn: Cactus Jungle, 2020” [322] Hình 1.4. Bí kỳ nam (H. formicarum Jack.) “Nguồn: Alchetron, 2018” [328] và Kỳ nam gai (M. tuberosa) “Nguồn: Leonardo, 2011” [329] 1.1.1. Bộ phận dùng Bộ phận dùng của Bí kỳ nam thường là phần thân củ với những hốc nhỏ do kiến đục làm tổ. Thân củ Bí kỳ nam được thu hái, thái mỏng, phơi đến gần khô, thì phơi tiếp trong bóng râm. Khi dùng, đem tẩm qua nước đang sôi, rồi sao vàng.
4 1.1.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa thực vật Thành phần hóa học vô cơ Nghiên cứu của nhóm tác giả Prachayasittikul (2012) cho thấy dựa trên kết quả phổ phát xạ nguyên tử plasma cao tầng cảm ứng, trong cao n-hexan, cao ethanol, cao methanol của Bí kỳ nam có chứa 22 nguyên tố kim loại, trong đó 6 nguyên tố thiết yếu (Mn, Fe, Ca, Zn, Cr và P) có trong cao n-hexan với nồng độ ở mức ppm. Nguyên tố trị liệu Li có trong cao cloroform. Một số kim loại nặng như Hg, Pb, Cd được tìm thấy trong cao cloroform. Đặc biệt các nguyên tố rất quan trọng cho cơ thể K, Ca, Mg, Fe, Zn cũng được tìm thấy trong Bí kỳ nam [223]. Bảng 1.1 Các nguyên tố vô cơ có trong Bí kỳ nam Mẫu Nguyên tố Cao hexan Be Al Ca Cr Mn Fe Zn Ba P (ppm) 0,15 1,47 0,74 0,23 0,14 0,20 0,05 0,09 7,57 Cao Li Sr Rb Hg Tl In Pb Cd As Cs chloroform (ppm) 0,34 0,03 8,31 1,18 9,67 9,42 2,59 0,08 4,99 1910,00 Cao methanol Na K Mg Mn Fe (ppm) 35,6 40,6 0,49 0,02 0,19 Thành phần hóa học hữu cơ Năm 2008, theo kết quả nghiên cứu của Prachayasittikul và cộng sự [222], 5 hợp chất đầu tiên đã được phân lập gồm: stigmasterol từ cao n-hexan, dicloromethan và 4 hợp chất phenol từ cao EtOAc: isoliquiritigenin, protocatechualdehyd, butin và butein (Hình 1.5). Isoliquiritigenin được tìm thấy lần đầu tiên trong tự nhiên vào năm 1953 từ Dahlia variabilis (Compositae). Hợp chất này cũng được phân lập từ Glycyrrhiza glabra (Cam thảo), Sinofranchetia chinensis và Broussonetia paccorifera. Các hoạt tính sinh học của isoliquiritigenin đã được báo cáo bao gồm tác dụng đối với tim mạch, chống kết tập tiểu cầu, vận mạch, chống oxy hóa, chống ung thư và khả năng ức chế yếu tố hoại tử khối u TNF-α [222].
5 Isoliquiritigenin Protocatechualdehyd Butin Butein Acid asperulosidic Acid deacetylasperulosidic Acid sinapinic β-Sitosterol acetat β-Sitosterol Stigmasterol 6α-Hydroxygeniposide 10-Hydroxyloganin Hình 1.5. Một số hợp chất phân lập từ Bí kỳ nam Procatechualdehyd được phân lập từ quả của Amomun tsao-ko, rễ của Salvia miltiorrhiza, Salvia officinalis và quả của Ganoderma applanatum. Hợp chất này có các hoạt tính sinh học đa dạng như ức chế tăng trưởng, chống oxy hóa và chống ung thư, giảm đường huyết và ức chế sao chép HIV-1 trong nhiễm trùng tế bào cấp tính [222]. Butin đã được phân lập từ hạt của Butea frondosa và được chứng minh có hoạt tính chống nhiễm trùng. Butin cũng được tìm thấy ở Vernonia antmusintica