Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:196

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi; Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG THEO HƯỚNG ĐIỀU TRỊ ALZHEIMER TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA ĐAN SÂM DI THỰC (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG THEO HƯỚNG ĐIỀU TRỊ ALZHEIMER TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA ĐAN SÂM DI THỰC (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ - DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ : 62720405 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đào Thị Vui PGS.TS. Nguyễn Thành Hải HÀ NỘI, NĂM 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được công bố bởi bất kỳ tác giả hoặc ở bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Trần Thị Loan
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía các thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: PGS.TS. Đào Thị Vui – Trưởng bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội và PGS.TS. Nguyễn Thành Hải – Giảng viên bộ môn Dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội, là những người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình dìu dắt, chỉ bảo, trang bị cho tôi những kiến thức khoa học quý giá và luôn động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược lực, Bộ môn Dược lâm sàng, Bộ môn Dược liệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm tạo điều kiện, cho tôi được học tập và nghiên cứu. Ban Giám đốc Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, Khoa Dược và các Phòng chức năng - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên đã luôn động viên tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. PGS.TS. Phương Thiện Thương cùng khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu; PGS.TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng cùng khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu ; PGS.TS. Bùi Thanh Tùng và ThS. Đặng Kim Thu – Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội; ThS. Trần Danh Việt – Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian hoàn thành luận án. DS. Ngô Thị Dịu – sinh viên khóa 68 và DS. Nguyễn Thị Thanh – sinh viên khóa 69 đã đồng hành cùng tôi trong thời gian nghiên cứu. Cuối cùng, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết đã luôn ở bên động viên và là chỗ dựa tinh thần để tôi vượt qua những khó khăn vất vả trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Trần Thị Loan
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU .......................................................................... iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ..................................................................v ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer ............................................................................3 1.1.1. Khái niệm ..........................................................................................................3 1.1.2. Dịch tễ ...............................................................................................................3 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng .............................................................4 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh và các đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh .........................5 1.2. Tổng quan về thuốc điều trị bệnh Alzheimer và hợp chất đang nghiên cứu .13 1.2.1. Tổng quan về thuốc điều trị bệnh Alzheimer ..................................................13 1.2.2. Tổng quan về các hợp chất đang nghiên cứu trong điều trị bệnh Alzheimer .15 1.3. Tổng quan một số mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm và phương pháp đánh giá trong nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer ....................................17 1.3.1. Các mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm .............................................17 1.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng thông qua các test hành vi ...........................22 1.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer ...........................................................................................25 1.4. Tổng quan về Đan sâm .....................................................................................28 1.4.1. Tên khoa học ...................................................................................................28 1.4.2. Đặc điểm thực vật và phân bố .........................................................................28 1.4.3. Bộ phận dùng ..................................................................................................29 1.4.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ Đan sâm .................................29 1.4.5. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý liên quan đến điều trị bệnh Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm ..................................................................................29 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................................33
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ....................................................................................33 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ......................................................................................33 2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu .........................................................................34 2.1.3. Động vật nghiên cứu .......................................................................................36 2.1.4. Tế bào nghiên cứu ...........................................................................................36 2.2. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu............................................................36 2.2.1. Hóa chất nghiên cứu........................................................................................36 2.2.2. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ......................................................................37 2.3. Địa điểm nghiên cứu .........................................................................................38 2.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................38 2.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................40 2.5.1. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi ............................40 2.5.2. Phương pháp đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer ................................................48 2.6. Xử lý số liệu .......................................................................................................58 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................59 3.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua các test hành vi ..........................................................................59 3.1.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin ................................................................................................................59 3.1.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35 ............................................................................................................65 3.1.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin ................................................................................................................68 3.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer ................................................................................72 3.2.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết cholinergic...72 3.2.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid ....78
3.2.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa ...................................................................................................................................81 Chương 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................87 4.1. Đối tượng nghiên cứu và liều dùng của cao rễ Đan sâm trong nghiên cứu .87 4.1.1. Dược liệu nghiên cứu ......................................................................................87 4.1.2. Chiết xuất mẫu nghiên cứu .............................................................................88 4.1.3. Liều dùng của cao rễ Đan sâm trong nghiên cứu ............................................89 4.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua các test hành vi ..........................................................................90 4.2.1. Các test hành vi sử dụng trong nghiên cứu .....................................................90 4.2.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin ................................................................................................................93 4.2.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35 ............................................................................................................97 4.2.4. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin ..............................................................................................................102 4.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer ..............................................................................105 4.3.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên đích liên quan đến giả thuyết cholinergic ...............................................................................................................105 4.3.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid ..110 4.3.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa .................................................................................................................................113 4.4. Bàn luận chung ...............................................................................................118 4.5. Đóng góp và hạn chế của đề tài......................................................................120 4.5.1. Đóng góp của đề tài.......................................................................................120 4.5.2. Hạn chế của đề tài .........................................................................................121 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................122 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng việt/ tiếng anh AChE Acetylcholinesterase APP Protein tiền chất của amyloid/ Amyloid precursor protein ATCI Acetylthiocholin iodid BACE Enzym phân cắt vị trí APP beta /beta-site APP-cleaving enzyme BDNF Yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não/ Brain-derived neurotrophic factor BuChE Butyrylcholinesterase CAT Catalase ChAT Choline acetyltransferase CYP P450 Cytochrom P450 DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DTNB Acid 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic EĐS Cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm FDA Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Hoa Kỳ/ Food and Drug Administration GPx Glutathion peroxidase/ Glutathione peroxidase GSH-Px Glutathione peroxidase GT Giả thuyết HĐS Cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao/ High performance liquid chromatography I.c.v Tiêm vào bên trong não thất/ Intracerebroventricularly I.p Tiêm phúc mạc/ Intraperitoneal i
Chữ viết tắt Tên tiếng việt/ tiếng anh IC50 Nồng độ ức chế 50%/ 50% inhibitory concentration Km Hằng số Michalis Menten LD50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm/ Lethal dose 50 MDA Malondialdehyde MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazolium bromid NaCMC Natri carboxymetyl cellulose NBT Nitro blue tetrazolium NFTs Đám rối sợi thần kinh / Neurofbrillary tangles NG108-15 Dòng tế bào u nguyên bào thần kinh chuột cống N18TG2 lai với dòng tế bào u thần kinh đệm chuột nhắt C6BU-1/ Neuroblastoma x glioma hybrid cell NMDA N-methyl-D-aspartat PC-12 Tế bào PC12/Pheochromocytoma 12 SC50 Nồng độ có khả năng dọn 50% gốc tự do/ 50% scavenging concentration SH-SY5Y Tế bào u nguyên bào thần kinh SH-SY5Y/ SH-SY5Y human neuroblastoma cells SGTN Suy giảm trí nhớ SKD Sinh khả dụng SOD Superoxid dismutase/ Superoxide dismutase T1/2 Thời gian bán thải TBA Acid thiobarbituric Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương TNF-α Yếu tố hoại tử khối u α/ Tumor Necrosis Factor-α v Tốc độ phản ứng Vd Thể tích phân bố vmax Tốc độ phản ứng cực đại ii
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Alzheimer ..................................5 Bảng 1.2. Một số test hành vi thường dùng trên chuột nhắt .....................................23 Bảng 1.3. Một số nghiên cứu đánh giá tác dụng thông qua các test hành vi trên chuột nhắt bị gây suy giảm trí nhớ ............................................................................24 Bảng 1.4. Tổng hợp các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Đan sâm liên quan đến điều trị bệnh Alzheimer trên thực nghiệm ................................................................30 Bảng 2.1. Thành phần trong mỗi mẫu để xác định khả năng ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro ...........................................50 Bảng 2.2. Thành phần trong mỗi mẫu để xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro ................................51 Bảng 2.3. Thành phần trong các mẫu để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào NG108-15 khỏi độc tính gây ra bởi β-amyloid25-35 của cao rễ Đan sâm di thực ........................54 Bảng 2.4. Thành phần trong giếng để xác định khả năng dọn gốc DPPH của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro ........................................................56 Bảng 2.5. Thành phần trong giếng để xác định khả năng dọn gốc superoxid của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro ........................................................57 Bảng 3.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trong test mê lộ chữ Y trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin .....................................................................59 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian khám phá đồ vật trong pha luyện tập của test nhận diện đồ vật trên mô hình scopolamin ..................61 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian khám phá đồ vật trong pha kiểm tra của test nhận diện đồ vật trên mô hình scopolamin....................62 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian tiềm tàng vào buồng tối trên mô hình scopolamin ......................................................................................64 Bảng 3.5. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trong test mê lộ chữ Y trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35 .................................................................66 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian tiềm tàng vào buồng tối trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35.......................................67 iii
Bảng 3.7. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trong test mê lộ chữ Y trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin .....................................................................69 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ trong test mê lộ nước Morris trên mô hình trimethyltin................................70 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến thời gian chuột ở góc phần tư đích trong test mê lộ nước Morris trên mô hình trimethyltin ...................................71 Bảng 3.10. Nồng độ của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực có tác dụng ức chế 50% hoạt độ enzym AChE in vitro.....................................................................76 Bảng 3.11. Nồng độ của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và quercetin có tác dụng dọn 50% gốc tự do DPPH in vitro ..............................................................85 Bảng 3.12. Nồng độ của của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và quercetin có tác dụng dọn 50% gốc tự do superoxid in vitro ...................................86 iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Quá trình tổng hợp và thủy phân acetylcholin ...............................................6 Hình 1.2. Cơ chế bệnh sinh theo giả thuyết glutamat....................................................7 Hình 1.3. Cơ chế bệnh sinh theo giả thuyết β-amyloid ...............................................9 Hình 1.4. Cơ chế bệnh sinh theo giả thuyết tau ........................................................10 Hình 1.5. Cơ chế bệnh sinh theo giả thuyết stress oxy hóa ......................................11 Hình 1.6. Các hợp chất điều trị bệnh Alzheimer đang được nghiên cứu ..................16 Hình 1.7. Cơ chế tác dụng của các hợp chất trong thử nghiệm pha 3 ......................17 Hình 1.8. Đặc điểm mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin .......................18 Hình 1.9. Nguyên tắc định lượng hoạt độ enzym AChE ..........................................26 Hình 1.10. Nguyên tắc xác định tỷ lệ tế bào sống sót ...............................................27 Hình 1.11. Nguyên tắc định lượng hàm lượng MDA trong mô não chuột ...............27 Hình 1.12. Nguyên tắc phương pháp đánh giá tác dụng dọn gốc DPPH ..................28 Hình 1.13. Phản ứng tạo gốc superoxid ....................................................................28 Hình 2.1. Cây Đan sâm di thực thu hái tại xã Tân Lập, huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La ...............................................................................................................................33 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất cao toàn phần ethanol và cao phân đoạn n- hexan rễ Đan sâm di thực ..........................................................................................35 Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ..........................................................................39 Hình 2.4. Quy trình đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin ............................................................................41 Hình 2.5. Minh họa mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng tiêm β-amyloid25-35 vào não thất phải (Hình chụp từ thực nghiệm) .......................................................................42 Hình 2.6. Quy trình chuẩn hóa trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng tiêm β- amyloid25-35 vào não thất ............................................................................................43 Hình 2.7. Quy trình đánh giá tác dụng cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35 ...............................................................................43 Hình 2.8. Quy trình đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin ............................................................................45 v
Hình 2.9. Minh họa các test hành vi (hình chụp từ thực nghiệm) ............................48 Hình 3.1. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến chỉ số phân biệt đồ vật trong test nhận diện đồ vật trên mô hình scopolamin .........................................................63 Hình 3.2. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột trên mô hình scopolamin ....................................................................73 Hình 3.3. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột trên mô hình trimethyltin....................................................................74 Hình 3.4. Tỷ lệ ức chế hoạt độ enzym AChE của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và donepezil in vitro......................................................................................75 Hình 3.5. Đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất ATCI của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực ............................77 Hình 3.6. Đồ thị Dixon biểu thị mối tương quan giữa các nồng độ của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và vận tốc phản ứng ............................................78 Hình 3.7. Độc tính của cao rễ Đan sâm di thực trên tế bào NG108-15 ....................79 Hình 3.8. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến tỷ lệ tế bào NG108-15 sống sót sau khi bị gây độc bằng β-amyloid25-35 ................................................................80 Hình 3.9. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hàm lượng MDA trong mô não chuột trên mô hình β-amyloid25-35 ..............................................................................82 Hình 3.10. Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm di thực đến hàm lượng MDA trong mô não chuột trên mô hình trimethyltin ...........................................................................83 Hình 3.11. Tỷ lệ dọn gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực in vitro ...............................................................................................................84 Hình 3.12. Tỷ lệ dọn gốc tự do superoxid của cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực và quercetin in vitro ..........................................................................................85 Hình 4.1. Sơ đồ tóm tắt các kết quả chính của luận án ...........................................119 vi
ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ, thường gặp ở người cao tuổi. Số lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao [20], [182]. Theo số liệu thống kê năm 2019 của World Alzheimer Report, có 50 triệu người mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới, trong đó 60-80% trường hợp là bệnh Alzheimer [16], [20]. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm, ước tính khoảng 115 triệu người mắc bệnh vào năm 2050 [182]. Bệnh Alzheimer được xác định là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu tại Hoa Kỳ, cùng với chi phí điều trị lớn đang trở thành gánh nặng đối với xã hội [20], [21]. Cho đến nay, mới chỉ có bốn thuốc được chấp thuận trong điều trị triệu chứng rối loạn nhận thức của bệnh Alzheimer [51], [60], [138]. Trong đó, ba thuốc có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase là donepezil, galantamin và rivastigmin liên quan đến giả thuyết cholinergic về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Một thuốc còn lại có tác dụng ức chế thụ thể NMDA là memantin liên quan đến giả thuyết glutamat [51]. Tuy nhiên, đích tác dụng hiện nay không chỉ hướng tới giả thuyết cholinergic hay giả thuyết glutamat đơn lẻ mà còn hướng đến các giả thuyết khác như giả thuyết β-amyloid, giả thuyết protein tau hay giả thuyết stress oxy hóa [18], [42]. Do đó, nghiên cứu và phát triển các thuốc trong điều trị bệnh Alzheimer đang được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm. Trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc, các hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu giữ vai trò rất quan trọng trong điều trị bệnh Alzheimer. Điều này có thể được minh chứng thông qua một nửa số thuốc được cấp phép trong điều trị bệnh Alzheimer hiện nay có nguồn gốc từ dược liệu [157]. Ưu điểm của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu là ít tác dụng phụ và đem lại lợi ích kinh tế đối với bệnh mạn tính như Alzheimer [163]. Vì vậy, nghiên cứu và phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu trong điều trị bệnh Alzheimer đang là hướng đi phù hợp tại các nước có thế mạnh về nguồn thực vật như Việt Nam. Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà (Lamiaceae), được sử dụng hơn 1000 năm qua ở rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là khu vực châu Á để điều trị các bệnh thần kinh; các bệnh tim mạch; ung thư; 1
tiểu đường, suy thận và một số bệnh khác [163], [196]. Một số nghiên cứu trên thế giới bắt đầu ghi nhận các hoạt chất phân lập từ rễ Đan sâm có nhiều tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer [95], [178], [239]. Các hoạt chất này thể hiện tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ in vivo trong các test hành vi thông qua khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase, bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid hay chống stress oxy hóa [137], [163]. Tại Việt Nam, Đan Sâm mới được di thực từ Trung Quốc và trồng tại một số tỉnh phía bắc như Lào Cai, Sơn La cho kết quả cây phát triển rất tốt [10]. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước mới chỉ ghi nhận cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và chống oxy hóa in vitro [8]. Hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ nào về tác dụng dược lý của Đan sâm di thực theo hướng điều trị bệnh Alzheimer. Câu hỏi đặt ra là: Liệu Đan sâm di thực có tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer hay không và tác dụng trên những đích nào? Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae)” với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi. 2. Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Kết quả của đề tài sẽ góp phần định hướng cho thử nghiệm lâm sàng để phát triển dược liệu Đan sâm di thực thành sản phẩm được dùng rộng rãi trong cộng đồng để điều trị bệnh Alzheimer. 2
Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer 1.1.1. Khái niệm Bệnh Alzheimer được mô tả lần đầu tiên vào năm 1906 bởi một bác sỹ người Đức là Alois Alzheimer. Tuy nhiên phải đến năm 1984, một khái niệm tương đối hoàn chỉnh về bệnh Alzheimer mới được đưa ra dưới sự đồng thuận của Viện quốc gia về đột quỵ và các rối loạn thần kinh, giao tiếp và Hiệp hội bệnh Alzheimer và các rối loạn liên quan. Trong đó, Alzheimer là một bệnh rối loạn về não đặc trưng bởi trạng thái mất trí nhớ tiến triển xảy ra ở giai đoạn giữa và cuối đời. Các đặc điểm của bệnh bao gồm thoái hóa một số tế bào thần kinh, xuất hiện các mảng β- amyloid ngoại bào và đám rối nội thần kinh; rối loạn cơ chế truyền tin trong hệ cholinergic ở não trước, đôi khi ảnh hưởng đến cả hệ noradrenegic và somatostatinergic [144]. 1.1.2. Dịch tễ Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ và số lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao, ước tính tăng gấp ba lần vào năm 2050 [15]. Số lượng người mắc bệnh Alzheimer chiếm 60-80% trong 50 triệu ca mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới [16], [20]. Bệnh gặp chủ yếu ở người cao tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh chiếm khoảng 4% dân số trên 60 tuổi và 20-40% dân số trên 85 tuổi [83], [89]. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm [182]. Tỷ lệ mắc bệnh ở nữ nhiều hơn nam [16]. Thời gian sống trung bình sau khi khởi phát sa sút trí tuệ dao động từ 3,3 đến 11,7 năm [79]. Ở Mỹ, số người trên 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer là 5,8 triệu, chiếm 10% dân số trên 65 tuổi. Ước tính đến năm 2050 số lượng bệnh nhân sẽ tăng lên 13,8 triệu. Đây là một trong 6 nguyên nhân tử vong hàng đầu tại Mỹ với 122.000 người chết vào năm 2018 [20], [21], [51]. Ở Châu Âu, tỷ lệ hiện mắc Alzheimer chiếm 5,1% dân số [243]. Ở Châu Phi, tỷ lệ hiện mắc là 57,1% dân số trên 50 tuổi. Với khu vực Châu Á, tỷ lệ hiện mắc ở Hàn Quốc là 4,8% dân số trên 65 tuổi; tại Trung Quốc là 1,9% dân số trên 60 tuổi. Đáng chú ý là tỷ lệ mắc bệnh ở các nước đang phát triển cao hơn các nước phát triển [181]. 3
Tại Việt Nam, chưa có báo cáo mang tính đại diện cho thực trạng bệnh Alzheimer trong cả nước. Tuy nhiên, một số nghiên cứu dịch tễ đã tiến hành đánh giá tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ ở một số tỉnh và ghi nhận ở Ba Vì, thành phố Hà Nội, tỷ lệ người trên 60 tuổi bị sa sút trí tuệ chiếm 4,5% dân số vào năm 2010 [7]; ở Đống Đa và Sóc Sơn, thành phố Hà Nội chiếm 4,2% dân số vào năm 2014 [9]. 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng 1.1.3.1. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng của bệnh Alzheimer biểu hiện qua các rối loạn liên quan đến nhận thức và không liên quan đến nhận thức. Một số triệu chứng liên quan đến nhận thức như suy giảm trí nhớ, suy giảm sử dụng động tác, suy giảm thị giác không gian, suy giảm ngôn ngữ và suy giảm chức năng điều hành. Trong số đó, suy giảm trí nhớ là dấu hiệu lâm sàng điển hình nhất, thường xuất hiện sớm và mức độ tăng dần theo thời gian. Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển trải qua ba giai đoạn gồm tiền lâm sàng, suy giảm nhận thức nhẹ và sa sút trí tuệ [42], [195]. Trong giai đoạn tiền lâm sàng, người bệnh có thể xuất hiện một số biểu hiện của rối loạn nhận thức như giảm trí nhớ ngắn hạn và ngôn ngữ. Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ, người bệnh thường có biểu hiện giảm cả trí nhớ ngắn hạn và dài hạn kèm theo giảm chức năng điều hành, ngôn ngữ và thị giác không gian. Giai đoạn sa sút trí tuệ tiến triển theo ba mức độ: nhẹ, trung bình và nặng. Trong giai đoạn sa sút trí tuệ mức độ nặng, người bệnh có biểu hiện mất trí nhớ kèm theo suy giảm nặng nề hoặc mất chức năng điều hành, sử dụng động tác, ngôn ngữ và thị giác không gian nên phải phụ thuộc hoàn toàn vào người chăm sóc [14], [145], [195]. Ngoài ra, bệnh Alzheimer cũng biểu hiện qua triệu chứng không liên quan đến nhận thức bao gồm rối loạn hành vi, tâm thần và cảm xúc như thờ ơ, kích động, gây hấn, không hợp tác, đi lang thang; hoang tưởng, ảo giác, co giật, động kinh; thay đổi tính khí, lo âu, rối loạn giấc ngủ và trầm cảm [42], [195]. Trong giai đoạn tiền lâm sàng, người bệnh chưa có biểu hiện rối loạn hành vi, tâm thần hay cảm xúc. Những rối loạn này bắt đầu xuất hiện ở giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ và trở nên trầm trọng ở giai đoạn sút trí tuệ mức độ nặng [14], [15], [51], [80], [145], [195]. 4
1.1.3.2. Đặc điểm cận lâm sàng Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Alzheimer được xác định thông qua các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh, xét nghiệm dịch não tủy hay sinh hóa. Trong giai đoạn tiền lâm sàng ghi nhận một số thay đổi trong xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh và dịch não tủy nhưng không ghi nhận sự thay đổi trong xét nghiệm sinh hóa. Trong giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ và giai đoạn sa sút trí tuệ ghi nhận những thay đổi trong các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh, dịch não tủy và sinh hóa, nhưng mức độ khác nhau [14], [80], [195]. Chi tiết được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Alzheimer [14], [80], [195] Đặc điểm cận Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ Giai đoạn tiền lâm sàng lâm sàng và sa sút trí tuệ - Có hoặc không có sự tích lũy - Có tích lũy mảng amyloid Xét nghiệm mảng amyloid - Có hiện tượng teo vùng thái dương chẩn đoán - Có hiện tượng mất chất xám, trung gian, giảm thể tích vùng hải hình ảnh mất một phần vỏ não hoặc teo mã, giảm tưới máu trong vỏ não. vùng hải mã. - Nồng độ protein tau hoặc tau - Nồng độ protein tau hoặc tau Xét nghiệm phosphoryl hóa tăng cao phosphoryl hóa tăng cao dịch não tủy - Nồng độ β-amyloid1-42 thấp - Nồng độ β-amyloid1-42 tăng cao - Nồng độ các chất đánh dấu sinh học liên quan đến phản ứng viêm, Xét nghiệm stress oxy hóa và các chất đánh dấu sinh hóa liên quan đến thoái hóa tế bào thần kinh như chết tế bào đều tăng cao. 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh và các đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh phức tạp. Cơ chế bệnh sinh của bệnh được mô tả dựa trên nhiều giả thuyết khác nhau. Một số giả thuyết chính được đề cập đến bao gồm giả thuyết cholinergic, giả thuyết glutamat, giả thuyết β- amyloid, giả thuyết tau và giả thuyết stress oxy hóa [106], [184]. 1.1.4.1. Giả thuyết cholinergic và các đích liên quan Giả thuyết cholinergic được đề xuất đầu tiên vào năm 1976 bởi Davies P. và Maloney A. J. [44]. Hệ cholinergic được biết đến là hệ thống dẫn truyền thần kinh quan trọng nhất trong não có vai trò điều hòa hoạt động trí nhớ [41]. Dẫn truyền tín 5
hiệu cholinergic diễn ra theo hai con đường chính. Con đường thứ nhất từ nhân nền Meynert đến khu vực não trước bao gồm cả vỏ não liên quan đến học nhớ và vận động. Con đường thứ hai từ nhân vách ngăn hải mã tới khu vực hải mã liên quan đến học nhớ ngắn hạn [169], [175], [204]. Trong các con đường truyền tin của hệ cholinergic, acetylcholin là chất dẫn truyền thần kinh quan trọng nhất, được tổng hợp dưới xúc tác của enzym cholin acetyltransferase (ChAT) và phân bố ở nhiều khu vực như não trước, não giữa, hồi hải mã và thân não. Sau khi gắn và hoạt hóa các receptor muscarinic hay nicotinic, acetylcholin bị thủy phân dưới tác dụng của enzym cholinesterase tạo thành cholin và acetat không có tác dụng dẫn truyền [85], [123]. Trong cơ thể, có hai dạng enzym cholinesterase là acetylcholinesterase (AChE) và butyrylcholinesterase (BuChE). Trong đó, enzym AChE chịu trách nhiệm chính trong thủy phân acetylcholin tại thần kinh trung ương, còn enzym BuChE chiếm ưu thế tại khu vực ngoại vi [91], [110]. Quá trình tổng hợp và thủy phân acetylcholin được trình bày trong hình 1.1. Hình 1.1. Quá trình tổng hợp và thủy phân acetylcholin [123] Trong trường hợp giảm tổng hợp acetylcholin và giảm biểu hiện của các receptor dẫn đến giảm nồng độ acetylcholin tại khu vực vỏ não và hải mã. Từ đó làm rối loạn quá trình truyền tin của hệ cholinergic dẫn đến thoái hóa, teo và chết các tế bào thần kinh, là những đặc trưng của bệnh Alzheimer [24], [37], [71], [106], [204]. Trên cơ sở giả thuyết cholinergic một số đích tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer đã và đang nghiên cứu, bao gồm: 6
- Ức chế enzym cholinesterase: Đặc biệt là ức chế enzym AChE làm bền vững và tăng nồng độ acetylcholin ở thần kinh trung ương nên có khả năng cải thiện trí nhớ. Đây là đích tác dụng quan trọng của các thuốc điều trị bệnh Alzheimer [85]. - Chủ vận receptor của acetylcholin: Bao gồm chủ vận receptor muscarinic và nicotinic làm kích thích thần kinh trung ương, giúp tăng cường tín hiệu acetylcholin nên có khả năng cải thiện trí nhớ [79], [91], [175]. 1.1.4.2. Giả thuyết glutamat và các đích liên quan Giả thuyết glutamat được hình thành vào năm 1988 bởi Simpson M.D.C [192]. Glutamat được biết đến là một chất dẫn truyền thần kinh kích thích trong hệ thần kinh trung ương, có vai trò trong học tập và trí nhớ [106]. Trong quá trình truyền tin, glutamat gắn và hoạt hóa các receptor trong hệ thần kinh trung ương mà phần lớn là thông qua receptor N-methyl-D-aspartat (NMDA). Khi quá trình khử cực diễn ra, receptor NMDA được hoạt hóa, dòng Ca2+ đi vào màng sau synap, glutamat được chuyển thành glutamin và dự trữ ở cúc tận cùng màng trước synap [106], [215]. Thông thường, yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF) có vai trò điều hòa cường độ tín hiệu của receptor NMDA thông qua kiểm soát dòng Ca2+ đi vào màng sau synap [112]. Trong trường hợp thiếu hụt BDNF và tích lũy glutamat ở ngoại bào làm kích thích quá mức receptor NMDA. Khi đó dòng Ca2+ tràn vào tế bào chất làm rối loạn chức năng ty thể dẫn đến thoái hóa, teo và chết tế bào thần kinh, là những đặc trưng của bệnh Alzheimer [85], [106], [112], [215]. Chi tiết được minh họa trong hình 1.2. Hình 1.2. Cơ chế bệnh sinh theo giả thuyết glutamat [112] 7