Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây Dây thìa canh

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:203

Thêm vào BST

Báo xấu

77
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định cấu trúc hóa học các thành phần hóa học chính của lá Dây thìa canh Việt Nam. Xác định sự thay đổi hàm lượng một số hoạt chất chính theo thời gian thu hái trong năm của lá Dây thìa canh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây Dây thìa canh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HOÀNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R. Br. EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HOÀNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R. Br. EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Văn Ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu HÀ NỘI - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Văn Ơn và PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu. Các số liệu, kết quả trình bày trong Luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Luận án NCS. Hoàng Minh Châu
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các tập thể thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn và PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Dược liệu, các thầy cô trong Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và hàn thành luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: - GS Oh Wen Keun, Khoa Dược, trường ĐH Quốc Gia Seoul, Hàn Quốc - Thạc sỹ Phạm Hà Thanh Tùng, Giáo viên bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, Nghiên cứu sinh tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc. - GS.TS Nguyễn Thanh Kỳ, nguyên Hiệu trưởng trường Đại học Dược Hà Nội - PGS.TS Đỗ Thị Hà, phó trưởng khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu. - PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh, trưởng Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội. Đã tạo điều kiện giúp đỡ,hướng dẫn và đóng góp ý kiến quý báu cho tôi hoàn thiện Luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, đến những người đồng nghiệp trong công ty Nam Dược đã luôn ủng hộ, gánh vác công việc và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. NCS. Hoàng Minh Châu
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic ALP : Alkaline Phosphatase ALAT : Chỉ số men gan ASAT : Chỉ số men gan ARN : Acid ribonucleic AUC : Diện tích dƣới đƣờng cong (Area under the curve) COSY : Phổ Cosy (Correlation Spectroscopy) DMSO : Dimethyl sulfoxid DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's medium DTT : Dithiothreitol DTC : Dây thìa canh Gymnema sylvestre ĐTĐ : Đái tháo đƣờng EA : Ethyl acetat EDTA : Acid ethylene diamin tetraacetic Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray ESI- MS : Ionization Mass Spectrometry) EtOH : Ethanol GAPDH : Glyceraldehyd 3- phosphate dehydrogenase Thực hành trồng trọt, thu hái, chế biến tốt dƣợc liệu theo GACP – WHO : tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới G.albiflorum : Gymnema albiflorum G. alterfolium : Gymnema alterfolium G.griffithii : Gymnema griffithii G. hirsutum : Gymnema hirsutum G. inodorum : Gymnema inodorum G.latifolium : Gymnema latifolium G.sylvestre : Gymnema sylvestre G.yunnansense : Gymnema yunnansense G. montanum : Gynema montanum Gla : Acid glucuronic Glc : Glucose GM : Gymnemagenin GS : Gymnema sylvestre
GS3 : Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh GS4 : Một phân đoạn chiết xuất của Dây thìa canh G3PDH : Glycerol - 3- phosphate dehydrogenase HBA1C : Chỉ số gắn kết của đƣờng trên hemoglobin hồng cầu HDL : High density lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao HE x 400 : Nhuộm Hematoxylin – Eosin, độ phóng đại 400 lần HFD : Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet) Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HMBC : (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High- performance liquid HPLC : chromatography) Phổ khối lƣợng phun mù điện tử phân giải cao (High HRESI MS : resolution Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua 1 liên kết (Heteronuclear HSQC : Single Quantum Connectivity) IR : Insulin receptor MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol NFD : Chế độ ăn bình thƣờng (Nomal fat diet) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic NMR : resonance Spectrometry) NOESY : Phổ Noesy (Nuclear Overhause Effect Spectroscopy) NP : Pha thƣờng (Normal phase) LDL : Low density lipoprotein- Lipoprotein tỷ trọng thấp LOL : Giới hạn tuyến tính ( Limit of Linear) LOD : Giới hạn phát hiện ( Limit of Detection) LOQ : Giới hạn định lƣợng ( Limit of Qualification) OA : Acid oleanolic OVL : Chồng lấn (Overlap) PBS : Phosphate buffered saline PTP1B : Protein tyrosine phosphatases p-NPP : p-nitrophenyl phosphate RP : Pha đảo (Reverse phase) SD : Độ lệch chuẩn (Standard deviation) STZ : Streptozocin TG : Triglycerid TLC : Sắc ký lớp mỏng
TLTK : Tài liệu tham khảo UA : Acid ursolic Xyl : Xylose 1 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear H NMR : Magnetic Resonance Spectrometry) Glucose fluorescent 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol- 2-NBDG : 4- yl)Amino)-2-Deoxyglucose Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 2 chiều (Two – dimension 2D-NMR : Nuclear magnetic resonance Spectrometry) 13 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 C -NMR : Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry)
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br trên thế giới 4 Bảng 1.2. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam 6 Bảng 1.3. Các hợp chất saponin có khung olean trong DTC G. sylvestre 10 (Retz.) R. Br. ex Schult Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học các hợp chất alternosid phân lập từ 16 G.alternifolium (Lour.) Merr Bảng 1.5. Cấu trúc hóa học một số saponin khung olean của Gymnema 17 inodorum (Lour.) Decne Bảng 1.6. Một số hợp chất saponin khung dammaran phân lập từ 19 Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult Bảng 1.7. Tổng hợp một số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi 26 Gymnema R.Br Gymnema R.Br Bảng 1.8. Hàm lƣợng Gymnemagenin các mẫu DTC thu theo tháng với 30 các cách làm khô khác nhau Bảng 2.1. Thời gian thu mẫu DTC G.sylvestre R. Br. ex Schult 33 Bảng 2.2. Chế độ ăn NFD và HFD tính trên 100g thức ăn 40 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của chất 1 49 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của chất 2 53 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của chất 3 57 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của chất 4 59 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR chất 5 63 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của các chất 6,7 67 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của các chất 8 72 Bảng 3.8. Sự biến đổi nồng độ glucose máu của chuột sau 8 tuần ăn 77 thức ăn giàu chất béo Bảng 3.9. Vi thể tụy của chuột sau 2 tuần uống mẫu 80 Bảng 3.10. Hoạt tính ức chế enzyme PTP1B của các chất 1-8 86 Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của TCNH, aglycon chất 93 5 và gymnemagenol tham khảo Bảng 3.12. Tính thích hợp của của hệ thống 101 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu chất 101 đối chiếu
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu thực 102 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phƣơng pháp 102 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát tính đúng của phƣơng pháp 103 Bảng 3.17. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp 105 Bảng 3.18. Hàm lƣợng gymnemagenol các mẫu dịch chiết thuỷ phân 105 DTC theo các tháng Bảng 4.1. Danh sách các chất phân lập từ Dây thìa canh 111 Bảng 4.2. Sinh khối DTC vùng trồng Nam Định tại các thời điểm thu 120 hoạch
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc khung olean của các hợp chất trong G. sylvestre 8 (Retz.) R. Br. ex Schult Hình 1.2. Cấu trúc các nhóm thế của hợp chất saponin khung olean 9 trong Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult Hình 1.3. Cấu trúc hóa học chung của các alternosid phân lập từ loài 15 G.alternifolium (Lour.) Merr Hình 1.4. Cấu trúc các nhóm thế trong các hợp chất alternosid phân lập 16 từ G. Alternifolium (Lour.) Merr Hình 1.5. Cấu trúc của một số hợp chất saponin có khung olean phân 17 lập từ Gymnema inodorum (Lour.) Decne Hình 1.6. Cấu tạo của gymnemasid VI và gymnemasid VII 18 Hình 1.7. Cấu tạo chung của các gymnemasid I-V 18 Hình 1.8. Cấu trúc các nhóm thế trong các gymnemasid phân lập từ G. 19 sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult Hình 1.9. Sự thay đổi hàm lƣợng ginsenosid Rg1, Re và Ro trong rễ 30 nhân sâm theo tuổi thu hái Hình 1.10. Hàm lƣợng gymnemic acid II tại tại các bộ phận của 31 Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult Hình 2.1. Lá và hoa cây Dây thìa canh tại vùng trồng Hải Hậu, Nam 34 Định Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu trên chuột nhắt 41 ĐTĐ typ 2 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất, phân lập các chất từ Dây thìa canh 47 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học chất 1 49 Hình 3.3. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) trong chất 51 1 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học chất 2 53 Hình 3.5. Các tƣơng tác HMBC (H C) và COSY (H-H) của chất 2 55 Hình 3.6. Cấu trúc hóa học chất 3 56 Hình 3.7. Các tƣơng tác HMBC (H C) và COSY (H-H) của chất 3 56 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học chất 4 59
Hình 3.9. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) trong chất 62 4 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học chất 5 62 Hình 3.11. Các tƣơng tác HMBC (H C) và COSY (H-H) của chất 5 63 Hình 3.12. Cấu trúc hóa học chất 6 66 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học chất 7 66 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học chất 8 71 Hình 3.15. Các tƣơng tác HMBC (H C) và COSY (H-H) của chất 8 72 Hình 3.16. Sự thay đổi khối lƣợng chuột tại các thời điểm nghiên cứu 76 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của mẫu thử lên nồng độ glucose máu của chuột 78 nhắt trắng ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần uống mẫu thử Hình 3.18. Trọng lƣợng gan tƣơng đối của chuột ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần 79 điều trị Hình 3.19. Trọng lƣợng tụy của chuột ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần điều trị 80 Hình 3.20. Hình thái vi thể tụy chuột lô chứng (chuột số 2) (HE x 400) 82 Hình 3.21. Hình thái vi thể tụy chuột lô mô hình (chuột số 18) (HE x 82 400) Hình 3.22. Hình thái vi thể tụy chuột lô mô hình (chuột số 21) (HE x 83 400) Hình 3.23. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột 83 số 27) (HE x 400) Hình 3.24. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột 84 số 29) (HE x 400) Hình 3.25. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 2,88 g dƣợc liệu 84 khô/kg (chuột số 78) (HE x 400) Hình 3.26. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 2,88 g dƣợc liệu 85 khô/kg (chuột số 79) (HE x 400) Hình 3.27. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu 85 khô/kg (chuột số 71) (HE x 400) Hình 3.28. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu 86 khô/kg (chuột số 74) (HE x 400) Hình 3.29. Nồng độ ức chế 50% (IC50) của chất 5 trên enzyme PTP1B 87 Hình 3.30. Ảnh hƣởng của các chất 1-5 trên khả năng hấp thu glucose 88 fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1
Hình 3.31. A. Ảnh hƣởng của chất 5 trên khả năng hấp thu glucose fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1; B. Ảnh hƣởng 88 của chất 5 ở điều kiện nồng độ khác nhau trên khả năng hấp thu glucose fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 Hình 3.32. Cấu trúc của gymnemagenol 90 Hình 3.33. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) của 97 TCNH Hình 3.34. So sánh phổ của chất 4 có CH2OH-29 và chất tham khảo có 98 cấu hình CH2OH-29𝛽 Hình 3.35. Cấu trúc của TCNH 99 Hình 3.36. Sắc ký đồ của chất đối chiếu gymnemagenol và các mẫu thử 100 Hình 3.37. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng gymnemagenol 103 Hình 3.38. Dãy nồng đồ xác định giới hạn tuyến tính của phƣơng pháp 104 Hình 3.39. Tỷ lệ % gymnemagenol trong các mẫu dịch chiết thuỷ phân 107 theo các tháng Hình 4.1. Mẫu DTC lƣu giữ tại Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Paris, Pháp 109 Hình 4.2. Cơ chế giảm tác dụng kháng insulin của chất ức chế enzym 117 PTP1B
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1. THỰC VẬT HỌC ........................................................................................... 3 1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R. Br. ............ 3 1.2. Chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài ................ 6 2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R. Br. .................................................................................................... 7 2.1. Nhóm hợp chất saponin................................................................................. 7 2.2. Các nhóm chất khác .................................................................................... 19 3. TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT VÀ CHỐNG TĂNG LIPID HUYẾT CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R. Br..................................... 20 3.1. Tác dụng hạ đƣờng huyết ............................................................................ 20 3.2. Tác dụng chống tăng lipid huyết ................................................................. 25 4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT SAPONIN TRONG MỘT SỐ DƢỢC LIỆU ....................................................... 28 4.1. Phƣơng pháp định lƣợng và đánh giá động thái tích lũy hoạt chất .................. 28 4.2 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo tuổi cây........................................................... 28 4.3. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời gian thu hái trong năm. .......................... 29 4.4. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời điểm sinh trƣởng và bộ phận của cây. ... 30 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 33 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................... 33
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ................................................................................. 33 2.1.2. Vật liệu, dung môi, hóa chất .......................................................................... 34 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu ................................................... 35 2.1.4. Động vật thực nghiệm dùng trong nghiên cứu .............................................. 37 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 38 2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học..................................................................... 38 2.2.1.2.Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập ............................................... 38 2.2.2. Nghiên cứu tác dụng sinh học ........................................................................ 38 2.2.2.1. Phƣơng pháp điều chế mẫu dịch chiết DTC cho thử tác dụng hạ đƣờng huyết ............................................................................................................................. 39 2.2.2.2.Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột của dịch chiết Dây thìa canh .............................................................................................................................. 39 2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập đƣợc ............. 41 2.2.2.3.1. Phƣơng pháp xác định khả năng ức chế enzym PTP1B của hoạt chất. ... 41 2.2.2.3.2. Phƣơng pháp biệt hóa tế bào mô mỡ 3T3-L1 .......................................... 42 2.2.2.3.3. Phƣơng pháp đo độ hấp thu glucose trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các chất phân lập. ............................................................................................................... 43 2.2.2.3.2.4. Phƣơng pháp chụp ảnh tế bào phát huỳnh quang ................................. 43 2.2.2.3.5. Phƣơng pháp phân tích kết quả ................................................................ 43 2.2.3. Nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất trong lá Dây thìa canh ................... 44 2.2.3.1. Phƣơng pháp thủy phân và xác định cấu trúc aglycon ............................... 44 2.2.3.2.Phƣơng pháp định lƣợng aglycon và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất 44 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 46 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ...................... 46 3.1.1. Chiết xuất và phân lập các chất tinh khiết từ Dây thìa canh .......................... 46 3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học các chất đã phân lập đƣợc ................................... 48
3.1.2.1. Chất 1 .......................................................................................................... 48 3.1.2.2. Chất 2 .......................................................................................................... 52 3.1.2.3. Chất 3 .......................................................................................................... 55 3.1.2.4. Chất 4 .......................................................................................................... 58 3.1.2.5. Chất 5 .......................................................................................................... 61 3.1.2.6. Chất 6 .......................................................................................................... 65 3.1.2.7. Chất 7 .......................................................................................................... 66 3.1.2.8. Chất 8 .......................................................................................................... 69 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ......................... 74 3.2.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột............................ 74 3.2.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập ......... 85 3.3.2.1.Hoạt tính ức chế enzym PTP1B ................................................................... 85 3.2.2.2.Hoạt tính hấp thu glucose trong tế bào 3T3-L1 của các chất ...................... 86 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT ....... 88 3.3.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc aglycon gymnemagenol............... 88 3.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng gymnemagenol và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất trong DTC. .............................................................................................. 96 3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu dƣợc liệu và khảo sát điều kiện phân tích ........................... 96 3.3.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.......................................................... 98 3.3.2.3. Độ lặp lại của phƣơng pháp ........................................................................ 98 3.3.2.4. Khảo sát khoảng tuyến tính của phƣơng pháp ............................................ 99 3.3.2.5. Độ đúng của phƣơng pháp ........................................................................ 100 3.3.2.6. Giới hạn của phƣơng pháp ........................................................................ 101 3.3.2.7. Định lƣợng gymnemagenol các mẫu Dây thìa canh theo các tháng thu hái102 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 106 4.1. VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 106
4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................................ 107 4.3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ..................................................................... 112 4.3.1. Về tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết Dây thìa canh .......................... 112 4.3.2. Về tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập từ Dây thìa canh ......... 115 4.4. VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT ............................................. 117 4.5. BÀN LUẬN CHUNG .................................................................................... 119 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 121 1. Về thành phần hóa học .................................................................................... 121 2. Về tác dụng sinh học ........................................................................................ 122 3. Về động thái tích lũy hoạt chất ....................................................................... 122 ĐỀ XUẤT .................................................................................................................. 124 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (DTC) (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.), thuộc chi Gymnema R.Br, phân bố rất rộng từ Tây Châu Phi sang Châu Úc, Châu Á. DTC đã đƣợc sử dụng trong nền Y học cổ truyền Ấn Độ từ hơn 2000 năm để điều trị Đái tháo đƣờng (ĐTĐ), cho đến nay có hàng trăm nghiên cứu tại Ấn Độ và nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Ấn Độ, Nhật Bản, M , Trung Quốc …liên quan đến DTC, tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, trong đó chủ yếu là tác dụng hạ đƣờng huyết cũng nhƣ một số bệnh lý chuyển hóa khác. Tại Việt Nam, Dây thìa canh bắt đầu đƣợc tập trung nghiên cứu từ năm 2008, trên các khía cạnh đa dạng sinh học, phân bố, độc tính, tác dụng hạ đƣờng huyết, từ đó nghiên cứu phát triển tạo ra nhiều sản phẩm hạ đƣờng huyết dƣới dạng viên nang, viên nén, dạng trà túi lọc và cả dạng dƣợc liệu khô đóng gói để sắc uống. Nhằm bảo đảm nguồn nguyên liệu, DTC cũng đã đƣợc nghiên cứu nhân giống, trồng trọt. Đến năm 2015, đã có 2 vùng trồng đạt tiêu chuẩn GACP - WHO của công ty Nam Dƣợc tại Hải Hậu (Nam Định) và của công ty DK Natura tại Phú Lƣơng (Thái Nguyên). Trong quá trình phát triển và ứng dụng trong thực tiễn DTC có nguồn gốc tự nhiên ở Việt Nam, xuất hiện nhiều vấn đề chƣa đƣợc làm sáng tỏ nhƣ thành phần hóa học khác so với DTC ở Ấn Độ, khó đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu dựa trên hàm lƣợng hoạt chất, xác định thời gian thu hái cho chất lƣợng tốt nhất trong trồng trọt,... Lý do chính là thiếu các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các chất trong DTC. Từ những lý do trên, đề tài ‖Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.)‖ đƣợc thực hiện với 2 mục tiêu chính: 1. Xác định cấu trúc hóa học các thành phần hóa học chính của lá Dây thìa canh Việt Nam. 1
2. Xác định sự thay đổi hàm lƣợng một số hoạt chất chính theo thời gian thu hái trong năm của lá Dây thìa canh. Để đạt được mục tiêu trên, Luận án tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau: Về thành phần hóa học: - Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các thành phần hóa học chính trong lá Dây thìa canh. Về thử tác dụng sinh học: - Thử tác dụng in vivo tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết toàn phần lá Dây thìa canh. - Thử tác dụng in vitro tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập đƣợc từ lá Dây thìa canh. Về nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất: - Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hoạt chất chính trong lá Dây thìa canh. - Theo dõi sự thay đổi hàm lƣợng hoạt chất của các mẫu lá Dây thìa canh thu hái trong năm. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1. THỰC VẬT HỌC 1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R. Br.  Vị trí phân loại Có hai quan điểm khác nhau về vị trí phân loại của chi Gymnema R. Br. Quan điểm thứ nhất cho rằng chi Gymnema R. Br. thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Đa số các tài liệu phân loại thực vật kinh điển đều theo quan điểm này [19]. Một số tài liệu về thực vật ở Việt Nam cũng xếp chi Gymnema R. Br. vào họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [2], [7],[8]. Tuy nhiên, năm 2009 Takhtajan đã công bố hệ thống phân loại trong đó xếp Gymnema R. Br. là một chi trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là Apocynaceae [17]. Cho đến nay, quan điểm này đƣợc thừa nhận rộng rãi trong các hệ thống phân loại quốc tế [32],[79]. Theo đó, Gymnema R. Br. là một chi thuộc phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae), họ Trúc đào (Apocynaceae), bộ Long đởm (Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [17].  Đặc điểm hình thái chung của chi Gymnema R. Br. Cây leo, không có rễ phụ trên thân. Lá mọc đối, không nạc. Cụm hoa xim, tán hoặc chùm. Hoa nhỏ. Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến. Tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai hoa vặn phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính ở tràng, thƣờng có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau; bao phấn 2 ô, thƣờng có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót dính và 2 chuôi; khối phấn hƣớng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị- nhụy hình ống nhọn đầu [20],[32]. 3
 Các loài thuộc chi Gymnema R. Br. và sự phân bố của chúng trên thế giới Có nhiều nhận định khác nhau về số lƣợng loài của chi Gymnema R. Br, một số tài liệu cho rằng chi này có khoảng 25 loài trên toàn thế giới [7], [20], [32]. Tuy nhiên, sau khi tổng hợp các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới, các tác giả thuộc dự án ―The plant list‖ đã xác định đƣợc 144 tên loài thuộc chi Gymnema R. Br. trong đó có 51 tên khoa học đƣợc chấp nhận (35,4%), 66 tên đƣợc xác định là tên đồng nghĩa (45,8%) và 27 tên chƣa xác định đƣợc chính xác thông tin (18,8%) [80]. Bảng 1.1. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br trên thế giới STT Tên các loài thuộc chi Gymnema R. Phân bố Br. đƣợc chấp nhận [50] 1 Gymnema acuminatum Wall. Nepal, Ấn Độ, Malaysia [80] 2 Gymnema albidum Decne. Timor [80] 3 Gymnema albiflorum Costantin Việt Nam [91] 4 Gymnema brevifolium Benth. Úc [80] 5 Gymnema calycinum Schltr. Luzon [80] 6 Gymnema chalmersii Schltr. New Guinea [80] 7 Gymnema cumingii Schltr. Philippin [80] 8 Gymnema cuspidatum (Thunb.) Kuntze 9 Gymnema decaisneanum Wight Tamil Nadu [80] 10 Gymnema dissitiflorum Ridl. Malaysia [80] 11 Gymnema dunnii (Maiden & Betche) Úc [80] P.I.Forst. 12 Gymnema elegans Wight & Arn. Tamil Nadu [80] 13 Gymnema erianthum Decne. New Caledonia [80] 14 Gymnema foetidum Tsiang Việt Nam [1], Trung Quốc [20] 4