Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài Hippeastrum reticulatum (L’Hér.) Herb. ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:267

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Dược học "Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài Hippeastrum reticulatum (L’Hér.) Herb. ở Việt Nam" trình bày các nội dung chính sau: Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Hippeastrum Herb; Xây dựng quy trình định lượng 2-methoxy pancracin trong thân hành cây Hippeastrum reticulatum bằng HPLC.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài Hippeastrum reticulatum (L’Hér.) Herb. ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA LOÀI HIPPEASTRUM RETICULATUM (L’HÉR.) HERB. Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA LOÀI HIPPEASTRUM RETICULATUM (L’HÉR.) HERB. Ở VIỆT NAM NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62720406 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. NGUYỄN THỊ HOÀI TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2024
i LỜI CÁM ƠN Trong suốt hành trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và hỗ trợ to lớn từ rất nhiều cá nhân và tổ chức. Với tất cả lòng biết ơn và sự kính trọng, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến những người đã đồng hành cùng tôi trên chặng đường đầy thử thách nhưng cũng rất ý nghĩa này. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Cô GS. TS. Nguyễn Thị Hoài, người hướng dẫn khoa học của tôi. Cô không chỉ chia sẻ những kiến thức chuyên môn sâu rộng, mà còn luôn tận tình hướng dẫn, động viên và truyền cảm hứng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Những ý kiến đóng góp, sự chỉ bảo tận tình và tinh thần làm việc nghiêm túc, yêu khoa học của Cô đã giúp tôi không ngừng nỗ lực hoàn thiện bản thân cũng như nâng cao chất lượng của luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Hồ Việt Đức - Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế, PGS. TS. Lê Văn Quân - Học viên Quân Y, TS. Đặng Vũ Lương - Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm và hoàn thiện luận án Tôi xin cảm ơn Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, nơi đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình tôi học tập và nghiên cứu tại trường. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Khoa Dược, Bộ môn Bộ môn Dược liệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học đã luôn nhiệt tình hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong các thủ tục hành chính, cung cấp thông tin và các tài liệu cần thiết. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy Cô trong Hội đồng Khoa học, đặc biệt là các Thầy Cô của Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã dành thời gian quý báu để xem xét, đánh giá và đóng góp những ý kiến xây dựng vô cùng giá trị cho công trình nghiên cứu của tôi. Sự tận tâm và kinh nghiệm của Thầy Cô đã giúp tôi hoàn thiện hơn nữa luận án của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cơ quan nơi tôi đang công tác, Trường ĐH Y - Dược, Đại học Huế, đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Sự linh hoạt trong công việc, sự thấu hiểu và ủng hộ của ban lãnh đạo cùng đồng nghiệp đã giúp tôi có thể cân bằng giữa trách nhiệm công việc và nhiệm vụ học tập, nghiên cứu. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các đồng nghiệp trong Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền - Thực vật dược – Hoá hữu cơ đã luôn chia sẻ, động viên và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình này.
ii Tôi xin dành những lời tri ân chân thành nhất đến gia đình – ba mẹ, chồng và con yêu quý. Ba mẹ đã luôn là điểm tựa vững chắc, truyền cho tôi niềm tin, sự động viên và những lời khuyên quý báu trong cuộc sống. Người bạn đời của tôi đã chia sẻ những khó khăn, gánh vác trách nhiệm gia đình và luôn là nguồn động lực lớn lao để tôi kiên trì theo đuổi con đường học vấn này và con tôi, với tình yêu thương ngây thơ và đáng yêu, đã tiếp thêm sức mạnh để tôi vượt qua những thời điểm khó khăn nhất. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả những ai, dù không thể nhắc tên cụ thể trong lời cảm ơn này, nhưng đã đóng góp vào hành trình nghiên cứu và học tập của tôi. Mỗi sự hỗ trợ, dù lớn hay nhỏ, đều có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp tôi đạt được thành quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người. TP. Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 12 năm 2024 Tác giả (Ký tên và ghi rõ họ tên)
iii LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Hoàng Xuân Huyền Trang, là Nghiên cứu sinh ngành/chuyên ngành Dược học cổ truyền, khóa 2017 – 2020, xin cam đoan: (1) Luận án là do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS. Nguyễn Thị Hoài; (2) Các tài liệu tham khảo được tôi xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng, trích dẫn và liệt kê tài liệu tham khảo đầy đủ; (3) Kết quả trình bày trong luận án được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của bản thân tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ đề tài cùng cấp nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 12 năm 2024 Người hướng dẫn Tác giả thực hiện (Ký tên và ghi rõ họ tên) (Ký tên và ghi rõ họ tên)
iv MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn .................................................................................................................. i Lời cam đoan ............................................................................................................. iii Danh mục các chữ viết tắt và thuật ngữ Anh-Việt .................................................... vi Danh mục các bảng ................................................................................................. viii Danh mục các hình ..................................................................................................... x ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Hippeastrum Herb. ................... 3 1.2. Thành phần hoá học chi Hippeastrum Herb. ..................................................................... 5 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cây Hippeastrum reticulatum (L.Hér.) Herb. ............... 26 1.4. Tổng quan về thuốc điều trị Alzheimer............................................................................ 27 1.5. Tổng quan một số mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm và phương pháp đánh giá trong nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer ............................................................................. 29 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 34 2.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................................................... 34 2.2. Quy trình nghiên cứu ......................................................................................................... 34 2.3. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................................ 35 2.4. Cỡ mẫu nghiên cứu ............................................................................................................ 36 2.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 36 2.6. Hoá chất, thiết bị nghiên cứu............................................................................................. 37 2.7. Phương pháp nghiên cứu, thu thập số liệu ....................................................................... 39 2.8. Phương pháp phân tích dữ liệu ......................................................................................... 54 Chương 3. KẾT QUẢ ............................................................................................. 55 3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật ........................................................................................ 55 3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học ..................................................................... 63 3.3. Xây dựng quy trình định lượng 2-methoxy pancracin trong thân hành cây Hippeastrum reticulatum bằng HPLC............................................................................................................ 98
v 3.4. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp .................................................................................... 109 3.5. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học ...................................................................... 110 Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 119 4.1. Về đặc điểm thực vật ....................................................................................................... 119 4.2. Về thành phần hoá học loài Hippeastrum reticulatum ................................................. 122 4.3. Về quy trình định lượng 2-methoxy pancracin trong cây Hippeastrum reticulatum . 127 4.4. Về độc tính cấp của loài Hippeatrum reticulatum ........................................................ 130 4.5. Về tác dụng sinh học........................................................................................................ 132 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 147 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 149 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt AChE Acetylcholinesterase ACTI Acetylthiocholin iodide APG Angiosperm phylogeny group brs Broad singlet Đỉnh đơn doãn rộng BuChE Butyrylcholinesterase COSY Correlation spectroscopy d Doublet Đỉnh đôi DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid DTNB 5,5’-dithiobis-nitrobenzoic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid Axit Ethylenediaminetetraacetic ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Phép thử miễn dịch liên kết Assay enzym EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm GSH-Px Glutathion peroxidase HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác dị hạt nhân coherence qua nhiều liên kết HR-ESI-MS Phổ khối Phổ khối ion hoá bụi điện tử phân giải cao HSQC Heteronuclear single quantum Phổ tương tác trực tiếp H- coherence C IC50 Half maximal inhibitory Nồng độ ức chế 50% concentration LD50 Median lethal dose Liều gây chết 50% LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng m Multiplet Đỉnh đa MDA Malondialdehyd MeOH Methanol Methanol MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu NMDA N-methyl-D-aspartate
vii NOESY Nuclear overhauser effect Phổ cộng hưởng hạt nhân spectroscopy hiệu ứng Overhauser ROS Reactive Oxygen Species Các loại oxy phản ứng RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối s Singlet Đỉnh đơn SOD Superoxid dismutase t Triplet Đỉnh ba TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilan tRNA Transfer Ribonucleic Acid ARN vận chuyển
viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các alcaloid thuộc khung lycorin được phân lập từ chi Hippeastrum ....... 7 Bảng 1.2. Alcaloid khung homolycorin được phân lập từ chi Hippeastrum ............. 9 Bảng 1.3. Các alcaloid khung haemanthamin phân lập từ chi Hippeastrum ........... 11 Bảng 1.4. Alcaloid khung crinin phân lập từ chi Hippeastrum ................................ 13 Bảng 1.5. Alcaloid khung pretazettin phân lập từ chi Hippeastrum ........................ 14 Bảng 1.6. Alcaloid khung narciclasin phân lập từ chi Hippeastrum ........................ 15 Bảng 1.7. Alcaloid khung montanin phân lập từ chi Hippeastrum .......................... 16 Bảng 1.8. Alcaloid khung galantamin phân lập từ chi Hippeastrum ....................... 17 Bảng 1.9. Các alcaloid có khung cấu trúc khác phân lập từ chi Hippeastrum ......... 18 Bảng 1.10. Một số test hành vi thường dùng trong đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của thuốc .................................................................................................................. 31 Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp phản ứng đánh giá hoạt tính ức chế AChE ............ 46 Bảng 3.1. Kết quả một số chỉ tiêu khảo sát bột thân hành Hippeastrum reticulatum .. 63 Bảng 3.2. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học ....................... 63 Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế AChE của các mẫu cao chiết từ thân hành của loài Hippeastrum reticulatum.......................................................................................... 66 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của trans-dihydronarciclasin và hợp chất 1 ................ 75 Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 ............................................................. 77 Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 và narciprimin .................................... 79 Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và narciclasin-4-O-β-D-xylopyranosid 81 Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 và 2-methoxy pancracin ..................... 83 Bảng 3.9. Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 6 và N-methyltyramin ...................... 85 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 và 3β,11α-dihydroxy-1,2-dehydrocrinan 86 Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 8 và brunsvigin .................................... 88 Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất 9 và pancracin ..................................... 90 Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất 10 và 8-O-demethylmaritidin .............. 91 Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất 11 và cycasinden ................................. 92 Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất 12 và 2,3-cis-guibourtinidol ................ 94 Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất 13 và 8-methylkaempferol .................. 95
ix Bảng 3.17. Các hợp chất phân lập từ thân hành của loài Hippeastrum reticulatum 96 Bảng 3.18. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của 2-methoxy pancracin ...................... 99 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát dung môi chiết .......................................................... 101 Bảng 3.20. Kết quả khảo sát thời gian chiết ........................................................... 102 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết ............................................................ 102 Bảng 3.22. Kết quả khảo sát số lần chiết ............................................................... 103 Bảng 3.23. Kết quả khảo sát tính tương tích hệ thống ........................................... 104 Bảng 3.24. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của 2-methoxy pancracin. .. 106 Bảng 3.25. Kết quả khảo sát độ lặp lại trong ngày và liên ngày của phương pháp định lượng....................................................................................................................... 107 Bảng 3.26. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng...................... 107 Bảng 3.27. Hàm lượng 2-methoxy pancracin có trong thân hành cây Hippeastrum reticulatum thu hái ở Thừa Thiên Huế ................................................................... 108 Bảng 3.28. Kết quả của bước dò liều độc tính ....................................................... 109 Bảng 3.29. Số chuột chết sau 72 giờ uống cao phân đoạn alcaloid cây Hippeastrum reticulatum ở các liều khác nhau ............................................................................ 109 Bảng 3.30. Hoạt tính ức chế AChE của các hợp chất phân lập được ..................... 110 Bảng 3.31. Kết quả đánh giá tác dụng của cao phân đoạn alcaloid của loài Hippeastrum reticulatum trên thử nghiệm mê lộ chữ Y ........................................ 111 Bảng 3.32. Tỷ lệ thời gian khám phá các đồ vật ở pha luyện tập .......................... 112 Bảng 3.33. Tỷ lệ thời gian khám phá các đồ vật ở pha kiểm tra ............................ 112 Bảng 3.34. Thời gian tiềm từ ngày 1 đến ngày 6 ................................................... 113 Bảng 3.35. Quãng đường chuột bơi đến bến đỗ từ ngày 1 đến ngày 6 .................. 114 Bảng 3.36. Thời gian bơi trong góc phần tư đặt bến đỗ trước đó ở ngày 7 ........... 115 Bảng 3.37. Hoạt độ của AChE ở hồi hải mã .......................................................... 115 Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái của Lan huệ mạng và Lan huệ đỏ ở Việt Nam. ...... 120 Bảng 4.2. Phân loại độc tính của Hodge và Sterner143 ........................................... 131
x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Phân loại họ Amaryllidaceae ................................................................................. 3 Hình 1.2. Các khung cấu trúc của alcaloid phân lập từ chi Hippeastrum. .......................... 6 Hình 1.3. Các alcaloid khung lycorin phân lập từ chi Hippeastrum.................................... 9 Hình 1.4. Các alcaloid khung homolycorin phân lập từ chi Hippeastrum. .......................11 Hình 1.5. Các alcaloid khung haemanthamin phân lập từ chi Hippeastrum.....................12 Hình 1.6. Alcaloid khung crinin phân lập từ chi Hippeastrum ..........................................13 Hình 1.7. Alcaloid khung pretazettin phân lập từ chi Hippeastrum ..................................15 Hình 1.8. Alcaloid khung narciclasin phân lập từ chi Hippeastrum ..................................16 Hình 1.9. Alcaloid khung montanin phân lập từ chi Hippeastrum ....................................16 Hình 1.10. Alcaloid khung galantamin phân lập từ chi Hippeastrum ...............................18 Hình 1.11. Các alcaloid phân lập từ chi Hippeastrum ........................................................19 Hình 1.12. Các hợp chất phân lập từ chi Hippeastrum.......................................................21 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thực hiện của luận án .................................................................35 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thực hiện các thử nghiệm hành vi.............................................48 Hình 2.3. Mê lộ chữ Y ..........................................................................................................49 Hình 2.4. Hộp nhận thức đồ vật ...........................................................................................50 Hình 2.5. Mê lộ nước Morris ...............................................................................................51 Hình 3.1. Ảnh cây Hippeastrum reticulatum. .....................................................................55 Hình 3.2. Các đặc điểm hình thái của cây Hippeastrum reticulatum. ...............................56 Hình 3.3. Hoa đồ cây Hippeastrum reticulatum. ................................................................57 Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá cây Hippeastrum reticulatum. ...........................................58 Hình 3.5. Cấu tạo giải phẫu thân hành loài Hippeastrum reticulatum ..............................59 Hình 3.6. Cấu tạo giải phẫu rễ cây Hippeastrum reticulatum. ...........................................60 Hình 3.7. Đặc điểm bột lá Hippeastrum reticulatum..........................................................61 Hình 3.8. Đặc điểm bột thân hành của loài Hippeastrum reticulatum. .............................62 Hình 3.9. Đặc điểm bột rễ của loài Hippeastrum reticulatum ...........................................63 Hình 3.10. Sơ đồ chiết xuất phần thân hành của cây Hippeastrum reticulatum ...............66
xi Hình 3.11. Sơ đồ phân lập hợp chất 1, 2, 10 và 11. ............................................................68 Hình 3.12. Sơ đồ phân lập hợp chất 3 và 9..........................................................................69 Hình 3.13. Sơ đồ phân lập hợp chất 4 và 5..........................................................................70 Hình 3.15. Sơ đồ phân lập hợp chất 7 và 8..........................................................................72 Hình 3.16. Sắc ký đồ phân lập hợp chất 12 .........................................................................73 Hình 3.17. Sơ đồ phân lập hợp chất 12................................................................................73 Hình 3.18. Sơ đồ phân lập hợp chất 13................................................................................74 Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 .......................................................................76 Hình 3.20. Tương tác HMBC chính của hợp chất 1 ...........................................................76 Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 .......................................................................78 Hình 3.22. Tương tác HMBC, COSY, NOESY chính của hợp chất 2 .............................78 Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của hợp chất 3. ......................................................................80 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 .......................................................................82 Hình 3.25. Tương tác HMBC chính của hợp chất 4 ...........................................................82 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 .......................................................................84 Hình 3.27. Tương tác HMBC chính của hợp chất 5 ...........................................................84 Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 .......................................................................85 Hình 3.29. Cấu trúc hóa học của hợp chất 7. ......................................................................87 Hình 3.30. Các tương tác NOESY chính của hợp chất 7. ..................................................87 Hình 3.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất 8 .......................................................................89 Hình 3.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 .......................................................................90 Hình 3.33. Cấu trúc hóa học của hợp chất 10 .....................................................................92 Hình 3.34. Cấu trúc hóa học của hợp chất 11 .....................................................................93 Hình 3.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất 12 .....................................................................94 Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13 .....................................................................96 Hình 3.37. Tương tác HMBC chính của hợp chất 13 .........................................................96 Hình 3.38. Phổ UV của 2-methoxy pancracin. ...................................................................99 Hình 3.39. Sắc ký đồ của một số hệ dung môi pha động đã khảo sát .............................101 Hình 3.40. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu........................................................................105
xii Hình 3.41. Đường tuyến tính chuẩn 2-methoxy pancracin. .............................................106 Hình 3.42. Nồng độ MDA huyết tương ............................................................................116 Hình 3.43. Nồng độ SOD huyết tương ..............................................................................117 Hình 3.44. Nồng độ GSH-Px huyết tương ........................................................................118 Hình 4.1. Đặc điểm vi phẫu ở một số loài thuộc chi Hippeastrum..................................121 Hình 4.2. Cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được từ cây Hippeastrum reticulatum ..............................................................................................................................................124
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Alzheimer là bệnh lý phổ biến nhất trong các hội chứng sa sút trí tuệ, thường gặp ở người cao tuổi. Theo số liệu thống kê năm 2019 của World Alzheimer Report, có 50 triệu người mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới, trong đó 60-80% trường hợp mắc bệnh Alzheimer1. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm, ước tính sẽ có khoảng 115 triệu người mắc bệnh vào năm 20502. Tổng chi phí cho việc chăm sóc và điều trị bệnh Azheimer vào khoảng 345 tỉ USD, con số này sẽ tăng lên 1 nghìn tỉ vào năm 2050. Các con số này cho thấy sự gia tăng và mức độ đe dọa đáng kể của bệnh Azheimer đối với xã hội hiện nay. Mặc dù đây là căn bệnh có mức độ phổ biến cao và nguy hiểm như vậy nhưng từ khi bệnh này được phát hiện và mô tả vào năm 1906, cho đến nay, chỉ có 6 thuốc được FDA chấp thuận sử dụng trong điều trị Alzheimer. Do đó, nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị bệnh Alzheimer là nhu cầu cấp thiết hiện nay. Các thuốc từ tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị Alzheimer hiện nay. Nổi bật là các hợp chất rivastigmin, galatamin và huperzin A. Trong đó, rivastigmin và galantamin đã được FDA chấp thuận sử dụng làm thuốc và huperzin A sử dụng làm thực phẩm chức năng trong điều trị bệnh Alzheimer 3. Các hợp chất này đều có tác dụng điều trị bệnh Alzheimer dựa trên cơ chế ức chế acetylcholinesterase (AChE). Chính vì vậy, việc tìm kiếm các hợp chất có tác dụng ức chế AChE từ tự nhiên được xem là một hướng đi tiềm năng trong việc nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer. Theo đánh giá của các nhà khoa học, các alcaloid thực vật đặc biệt từ họ Amaryllidaceae (nơi cung cấp galantamin) là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc phát hiện và khai thác các thuốc mới trong việc phòng và hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer. Hippeastrum Herb. là một chi lớn trong họ Amaryllidaceae với khoảng 111 loài đã được ghi nhận4. Chi này đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây với nhiều công bố cho thấy nhiều loài trong chi
2 cũng như các hợp chất được phân lập có hoạt tính sinh học tốt, đặc biệt là tác dụng ức chế AChE. Theo Thực vật chí Việt Nam, chi Hippeastrum ở Việt Nam có 2 loài là Hippeastrum equestre và Hippeastrum reticulatum5. Kết quả sàng lọc ban đầu của nhóm nghiên cứu cho thấy cả hai loài Hippeastrum equestre và Hippeastrum reticulatum đều có tác dụng ức chế AChE với giá trị IC50 tương ứng là 59,09 ± 2,43 và 39,85 ± 0,94 µg/ml. Từ kết quả sàng lọc này có thể thấy loài Hippeastrum reticulatum có tác dụng tốt hơn. Cho đến thời điểm luận án được thực hiện (năm 2017), trên thế giới mới chỉ có 3 công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài Hippeastrum reticulatum. Như vậy, việc nghiên cứu loài Hippeastrum reticulatum (L'Hér.) Herb. ở Việt Nam để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính ức chế AChE có khả năng đạt được kết quả mới và là một bước khởi đầu cần thiết cho việc nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer từ nguồn tài nguyên trong nước. Chính vì những lý do đó chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài Hippeastrum reticulatum (L'Hér.) Herb. ở Việt Nam” với các mục tiêu sau: Mục tiêu 1. Nghiên cứu thành phần hoá học của loài Hippeastrum reticulatum theo định hướng hoạt tính ức chế acetylcholinesterase. Mục tiêu 2. Xây dựng quy trình định lượng hợp chất có trong loài Hippeastrum reticulatum. Mục tiêu 3. Xác định độc tính cấp và đánh giá tác dụng sinh học của các cao toàn phần, cao phân đoạn và các hợp chất phân lập được theo hướng điều trị bệnh Alzheimer.
3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Hippeastrum Herb. 1.1.1. Vị trí phân loại Họ Amaryllidaceae bao gồm ba phân họ: Agapanthoideae, Allioideae và Amaryllidoideae. Trong đó, Agapanthoideae là phân họ đặc hữu của Nam Phi và chỉ gồm 1 chi Agapanthus. Phân họ Allioidieae gồm 4 tông: Allieae (gồm 1 chi Allium với gần 1000 loài trên khắp Bắc bán cầu), Gilliesieae (gồm 5-7 chi ở miền Nam Nam Mỹ), Leucocoryneae (gồm 6 chi chủ yếu ở miền Nam Nam Mỹ) và Tulbaghieae (gồm 1 chi với khoảng 30 loài đặc hữu của Nam Phi). Phân họ Amaryllidoideae là phân họ lớn nhất trong họ Amaryllidaceae, phân bố phổ biến trên khắp thế giới nhưng chủ yếu ở vùng nhiệt đới gồm 13 tông. Phân họ này được đặc trưng bởi các đặc điểm như bầu dưới, số nhiễm sắc thể n = 11, sự hiện diện của nhóm hợp chất alcaloid đặc trưng và nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học6. Dựa trên các phân tích về trình tự DNA, tông Hippeastreae chia thành 2 nhánh chính gồm phân tông Hippeastrinae và Traubiinae. Trong phân tông Hippeastrinae có 2 chi được xác định là Hippeastrum và Zephyranthes7,8. Agapanthoideae Amaryllideae Cyrtantheae Amaryllidoideae Calostemmateae Amaryllidaceae Haemantheae Griffinieae Hippeastreae Nhánh Mỹ Eustephieae Hymenocallideae Clinantheae Eucharideae Allieae Nhánh Á-Âu Allieae Pancratieae Narcisseae Allioideae Allieae Galantheae Tulbaghieae Leucocoryneae Hình 1.1. Phân loại họ Amaryllidaceae “Nguồn: Meerow, 20238”
4 Trước đây, có một số nhầm lẫn về mặt phân loại giữa chi Amaryllis và chi Hippeastrum do các loài thuộc 2 chi này có hình dạng tương tự nhau. Năm 1753, Carl Linnaneus đã đặt tên cho 1 loài là Amaryllis belladona, loài điển hình của chi Amaryllis, cùng với 8 loài Amaryllis khác. Đến đầu thế kỷ 19, chi này có khoảng 50 loài. Tuy nhiên, sau đó, các nhà thực vật học đã tìm cách phân chia lại chi này. Reverend William Herbert, nhà thực vật học người Anh, đã bắt đầu công việc này vào năm 1819 và báo cáo trong tạp chí Curtis's Botanical Magazine. Dựa vào các đặc điểm hình thái, ông đã xác định 14 loài thuộc chi mới là Hippeastrum và chỉ để lại 3 loài trong chi Amaryllis. Các loài còn lại của chi Amaryllis được chuyển sang các chi khác. Herbert tiếp tục điều chỉnh mô tả về Hippeastrum trong công trình về Amaryllidaceae của ông vào năm 18379. Các tranh cãi về 2 chi này tiếp tục nảy sinh trong giai đoạn 1938 đến 1984 về cái tên Amaryllis và Hippeastrum. Đến năm 1984, theo thảo luận tại Đại hội Thực vật Quốc tế lần thứ 14, dựa trên việc phân tích các đặc tính của protein và acid nucleic của các loài được nghiên cứu, Meerow và cộng sự đã đưa ra công bố chính thức về 42 loài chuyển từ Amaryllis sang Hippeastrum10. Đến nay, Amaryllis vẫn còn được sử dụng như tên gọi thông dụng của các loài hoa thuộc chi Hippeastrum nhưng Hippeastrum được sử dụng trong các công bố khoa học liên quan đến chi này. Tóm lại, theo phân loại của Meerow và cộng sự (2023)8, vị trí phân loại của chi Hippeastrum như sau: Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Liliopsida Phân lớp Liliidae Liên bộ Lilianae Bộ Asparagales Họ Amaryllidaceae Phân họ Amaryllidoideae Tông Hippeastreae Phân tông Hippeastrinae Chi Hippeastrum Herb.
5 1.1.2. Đặc điểm thực vật chung của chi Hippeastrum Các cây thuộc chi Hippeastrum là cây cỏ sống lâu năm, thân hành có áo mỏng bao ở ngoài. Lá tập trung ở gốc gần như thành 2 dãy. Phiến lá hình dải, dai, cứng, có nhiều gân dọc song song và gân phụ ngang song song. Lá chủ yếu mọc dài, hiếm khi có cuống lá, thường rộng hơn 2 cm. Cụm hoa tán, hai hay nhiều hoa, trên 1 cuống hoa chung, hình trụ, thẳng đứng, rỗng. Hoa 2-13, thường lớn, dạng phễu. Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm 2 cái, mỏng. Hoa to, đều, lưỡng tính, màu sắc sặc sỡ, có cuống. Bao hoa hình phễu, nằm ngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, phần trên gồm 6 cánh, xếp 2 vòng, các cánh bằng nhau hoặc các cánh vòng trong hẹp hơn. Nhị 6, chỉ nhị rời nhau. Bao phấn 2 ô, đính lưng, hướng trong, mở bằng khe dọc. Bầu dưới, 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn. Vòi nhụy dài, mảnh, đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy. Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh. Hạt nhiều, dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ5,6. Các đặc điểm đặc trưng của chi Hippeastrum để phân biệt với các chi khác trong họ Amaryllidaceae bao gồm: lá thường rộng hơn 2 cm, cánh đài thường dài hơn 6 cm, lá đài tự do, số nhiễm sắc thể 2n = 22 và bội số của 1111. 1.1.3. Phân bố Trên thế giới, theo thống kê mới nhất của World Flora Online, chi này hiện có 99 loài4. Các loài này thuộc chi này phân bố phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới do nó dễ dàng thích nghi ở các khu vực khí hậu này9. Tuy nhiên, chi này có 2 khu vực đa dạng chính gồm miền đông Brazil và miền trung nam Andes của Peru, Bolivia và Argentina. Theo Thực vật chí Việt Nam đã công bố về chi Hippeastrum thì hiện chỉ có 2 loài ở Việt Nam đó là loài Hippeastrum equestre (Lan huệ đỏ) và loài Hippeastrum reticulatum (Lan huệ mạng). Phân bố ở một số địa phương. Cây được nhập vào Việt Nam trồng trong vườn hoa, trong chậu. Nhân giống bằng thân hành con5. 1.2. Thành phần hoá học chi Hippeastrum Herb. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Hippeastrum, tuy nhiên các công bố này đa số báo cáo về nhóm chất alcaloid. Các nghiên cứu hầu hết thực hiện ở những loài Hippeastrum thu hái ở Brazil cũng như một số nước thuộc khu vực Nam Mỹ và chủ yếu được phân lập từ phần thân hành.
6 1.2.1. Nhóm hợp chất alcaloid Alcaloid là nhóm hợp chất quan trọng của chi Hippeastrum. Các alcaloid này thường được gọi chung là Amaryllidaceae alcaloid. Đây là tên gọi dùng để chỉ các alcaloid được phân lập từ các loài thuộc họ Amaryllidaceae. Phần lớn các alcaloid này thuộc nhóm isoquinolin alcaloid, một trong hai nhóm alcaloid lớn bên cạnh indol alcaloid. Ban đầu, các Amaryllidaceae alcaloid được phân thành chín khung cấu trúc chính là norbelladin, lycorin, homolycorin, crinin, haemanthamin, narciclasin, pretazettin, montanin và galantamin. Tuy nhiên, ngày càng có nhiều khung cấu trúc được phát hiện trong họ Amaryllidaceae, nâng tổng số lên hiện nay là 42 khung cấu trúc12. Đối với chi Hippeastrum, các khung cấu trúc đã được phân lập bao gồm: lycorin, homolycorin, crinin, haemanthamin, montanin, narciclasin, pretazettin, galantamin và một số cấu trúc khác. Hầu hết các alcaloid được xác định trong Hippeastrum thuộc về khung lycorin (28%), tiếp theo là homolycorin (18%), haemanthamin (14%) và galantamin (14%). Các khung cấu trúc của alcaloid phân lập từ chi Hippeastrum được thể hiện ở Hình 1.2. OH MeN OH HO MeO O O MeO O MeO O N O NMe Khung lycorin Khung homolycorin Khung galantamin Lycorin Homolycorin Galantamin OMe OMe OH OH NMe O O O H H N N O O O O OH Khung haemanthamin Khung crinin Khung pretazettin haemanthamin crinin pretazettin OH OH OMe O OH O OH NH O OH O O N H Khung narciclasin Khung montanin Narciclasin Montanin Hình 1.2. Các khung cấu trúc của alcaloid phân lập từ chi Hippeastrum.