Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:221

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là chiết xuất, phân lập, tinh chế và thiết lập được 2 chất chuẩn monotropein, nystose từ dược liệu rễ Ba kích. Định danh được dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đoàn Cao Sơn PGS. TS. Bùi Hồng Cường HÀ NỘI, NĂM 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và là một phần của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16- 18, thuộc Chương trình “Khoa học và công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020” mà tôi có tham gia và được sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài. NCS. PhạmVăn Kiền
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và có hiệu quả của nhiều cá nhân, tập thể, của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS. TS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS. TS. Bùi Hồng Cường – Phó trưởng Bộ môn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo Sau đại học, GS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, cùng các thầy, cô của Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm để tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Công thương đã cấp kinh phí cho Đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16-18; PGS. TS. Trần Việt Hùng – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh, chủ nhiệm đề tài và các anh, chị, em đồng nghiệp của Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực nghiệm để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cả ơn gia đình tôi và những người bạn, đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, động viên khích lệ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 NCS. Phạm Văn Kiền
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ............................................................................ iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ.................................................................... vii ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) .............................................3 1.1.1. Vị trí phân loại của Ba kích ..............................................................................3 1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................3 1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến .................................................................................4 1.1.4. Thành phần hoá học ..........................................................................................4 1.1.5. Tác dụng dược lý ...............................................................................................5 1.1.6. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích .....................................................5 1.2. Monotropein và nystose .......................................................................................6 1.2.1. Monotropein ......................................................................................................6 1.2.2. Nystose ..............................................................................................................8 1.3. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose ....................................12 1.3.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose trên thế giới và tại Việt Nam ...........................................................................................................................12 1.3.2. Phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ Ba kích ...................................13 1.4. Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh loài Morinda officinalis How ...........................................................................................................................15 1.4.1. Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật .............................................15 1.4.2. Phương pháp khuếch đại gen (PCR) ..............................................................16 1.4.3. Các trình tự gen thường dùng cho thực vật ....................................................18
1.4.4. Nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Morinda officinalis How ....................22 1.6. Tính cấp thiết của luận án ..................................................................................23 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................25 2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................25 2.2. Phương tiện nghiên cứu .....................................................................................25 2.2.1. Chất chuẩn và dược liệu chuẩn.......................................................................25 2.2.2. Hóa chất và thuốc thử .....................................................................................25 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ ..............................................................................................26 2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................27 2.3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose .......27 2.3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích ...................................................................................................................................37 2.3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose .................................................39 2.3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN.....44 2.3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng ...............................................................................48 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...............................................................49 3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose ..........49 3.1.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein .........................49 3.1.2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose .................................54 3.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ..................................................................................59 3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích60 3.2.1. Chiết xuất cao chiết toàn phần chứa monotropein và nystose .......................60 3.2.2. Phân lập và tinh chế monotropein ..................................................................61 3.2.3. Phân lập và tinh chế nystose ...........................................................................63 3.2.4. Xác định bộ dữ liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn...................65
3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose ....................................................67 3.3.1. Thiết lập chất chuẩn monotropein ..................................................................67 3.3.2. Thiết lập chất chuẩn nystose ...........................................................................75 3.3.3. Định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích....83 3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN .......85 3.4.1. Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu ..........................................................85 3.4.2. Nhân bản đoạn gen .........................................................................................86 3.4.3. Giải trình tự gen và định danh dược liệu ........................................................87 3.4.4. Phân tích trình tự gen .....................................................................................89 3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng ................................................................................93 3.5.1. Bổ sung các chỉ tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam.................................................................................93 3.5.2. Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam VI .....94 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ......................................................................................101 4.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose ........101 4.1.1. Phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích .........................................................................................................101 4.1.2. Phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích .....................................................................................................................103 4.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu bằng TLC ........105 4.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích .................................................................................................................................105 4.2.1. Chiết cao toàn phần ......................................................................................105 4.2.2. Phân lập, tinh chế monotropein ....................................................................106 4.2.3. Phân lập, tinh chế nystose .............................................................................107 4.2.4. Xác minh cấu trúc monotropein và nystose tinh chế được ...........................108
4.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose ..................................................109 4.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN .....112 4.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng ..................................................................................118 4.5.1. Bổ sung chỉ tiêu định tính..............................................................................118 4.5.2. Bổ sung chỉ tiêu định lượng ..........................................................................120 4.6. Những đóng góp mới của luận án ....................................................................122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................123 Kết luận ...................................................................................................................123 Kiến nghị .................................................................................................................123 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic : Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài các AFLP đoạn được nhân bản chọn lọc : Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng loài APG II thực vật hạt kín ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN CBOL : Consortium for the Barcode of Life cpDNA : Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp ptDNA : Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể DĐVN : Dược điển Việt Nam DNA : Deoxyribo Nucleic Acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphate dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay hơi EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu ETS : External transcribed spacer – Vùng sao mã ngoài gene : Diễn đàn hòa hợp về thuốc thảo dược của các nước Tây Thái Bình FHH Dương HPLC-DAD : Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector mảng diod HPLC-ELSD : Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector tán xạ bay hơi FOS : Fructo Oligo Saccharid ICRS : Chất chuẩn Dược điển Quốc tế i
IGS : Intergenic spacer – vùng chen giữa các gene IR : Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản giữa ITS : Internal transcribed spacer KNV : Kiểm nghiệm viên LDL : Low density lipoprotein LSC : large single copy – vùng đơn gen lớn matK : Maturase K MeOH : Methanol mRNA : Messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information PTN : Phòng thử nghiệm PCR : Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen QTL : Quantiative Trait loci RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rbcL : Rubisco large subunit gene SKLM : Sắc ký lớp mỏng SSC : Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ TBE : Tris/Borate/EDTA TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng TLC : Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng TIS : Transcription start site – Điểm khởi đầu sao chép TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane USPRS : USP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Mỹ UV-VIS : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến WHO : World health organization - Tổ chức Y tế thế giới ii
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Morinda ................................................................3 Bảng 1.2. Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển ......................5 Bảng 1.3. Chương trình gradient dung môi định lượng nystose ..............................11 Bảng 1.4. Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose ...................13 Bảng 2.1. Danh mục mã hoá các mẫu Ba kích .........................................................25 Bảng 2.2. Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein [52] ..........................................................................................................................29 Bảng 2.3. Nội dung thẩm định phương pháp định lượng nystose [52] ....................34 Bảng 2.4. Chương trình gradient pha động sắc ký lỏng điều chế. ...........................38 Bảng 2.5. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng............................................45 Bảng 2.6. Các mồi chung cho các trình tự ITS và các gen trên chloroplast ............46 Bảng 2.7. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 [84] .............................46 Bảng 2.8. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS U4-ITS P5 [36] .....................46 Bảng 2.9. Chương trình PCR cho đoạn mồi của matK 1326R-390F [39] ...............47 Bảng 2.10. Chương trình PCR cho đoạn mồi của rcbLaF-rcbLaR [54], [56] .........47 Bảng 2.11. Chương trình PCR cho đoạn mồi của trnH-pbsA [48] ..........................47 Bảng 2.12. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng giải trình tự đoạn gen .....48 Bảng 3.1. Độ thích hợp hệ thống sắc ký phương pháp định lượng monotropein .....49 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng monotropein ..........................................................................................................................50 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu ..............................................................................................51 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein trong dược liệu BK5 .........................................................................................52 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu ........................................................................................................52 iii
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng monotropein trong dược liệu BK5 ...................................................................................................53 Bảng 3.7. Độ thích hợp hệ thống phương pháp định lượng nystose.........................54 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng nystose............56 Bảng 3.9. Kết quả độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu ........................................................................................................57 Bảng 3.10. Kết quả độ chính xác của phương pháp định lượng nystose trong dược liệu BK5 ............................................................................................................58 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu ....................................................................................................................58 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong dược liệu BK5 ............................................................................................................59 Bảng 3.13. Số liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) của chất phân tích và tham khảo * (D2O, 600 MHz) ..............................................................................................66 Bảng 3.14. Số liệu phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) của chất phân tích và tham khảo * (D2O, 100 MHz) ..............................................................................................67 Bảng 3.15. Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu monotropein ........68 Bảng 3.16. Kết quả xác định tạp chất trong nguyên liệu monotropein ....................69 Bảng 3.17. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein........................70 Bảng 3.18. Số lượng lọ chuẩn monotropein .............................................................70 Bảng 3.19. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn monotropein .......................71 Bảng 3.20. Kết quả đánh giá liên phòng chất chuẩn monotropein ..........................72 Bảng 3.21. Kết quả hàm lượng chất chuẩn monotropein .........................................72 Bảng 3.22. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng) .......73 Bảng 3.23. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (1 năm) .........74 Bảng 3.24. Kết quả xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng) ...........................................................................................................74 iv
Bảng 3.25. Kết quả xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein (1 năm) ..............................................................................................................74 Bảng 3.26. Tổng hợp kết quả nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn monotropein sau 1 năm ...................................................................................................................75 Bảng 3.27. Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu nystose ................76 Bảng 3.28. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn nystose ................................77 Bảng 3.29. Số lượng lọ chất chuẩn nystose ..............................................................78 Bảng 3.30. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn nystose ................................78 Bảng 3.31. Kết quả đánh giá liên phòng chất chuẩn nystose ...................................79 Bảng 3.32. Kết quả hàm lượng chất chuẩn nystose ..................................................79 Bảng 3.33. Kết quả định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (6 tháng) ..........................................................................................................................80 Bảng 3.34. Kết quả định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (1 năm) ..........................................................................................................................81 Bảng 3.35. Tổng hợp kết quả nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose sau 1 năm ..........................................................................................................................82 Bảng 3.36. Kết quả định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích ................83 Bảng 3.37. Kết quả định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích. ........................84 Bảng 3.38. Kết quả đo mật độ quang của dịch tách chiết ADN toàn phần ..............86 Bảng 3.39. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự ITS ................................87 Bảng 3.40. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự matK.............................88 Bảng 3.41. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự rbcL ..............................88 Bảng 3.42. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự trnH-pbsA ....................88 Bảng 3.43. Kết quả so sánh độ tương đồng và độ phủ của các mẫu Ba kích so với M. officinalis KR869730 và M. officinalis AY551330 ...........................................89 Bảng 3.44. Khoảng cách di truyền của các mẫu trên trình tự ITS ...........................90 Bảng 3.45. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự matK .......................91 Bảng 3.46. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự rbcL ........................92 v
Bảng 3.47. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự trnH-psbA ..............93 Bảng 3.48. Tóm tắt các chỉ tiêu bổ sung vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của Dược điển Việt Nam. ........................................................................................94 vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của monotropein [14] ...................................................6 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của nystose [85] ...........................................................8 Hình 1.3. Sơ đồ và các chu kỳ của phản ứng chuỗi polymerase [15] ......................17 Hình 1.4. Vị trí các vùng ITS trên cụm đa gen 18S–5.8S–26S rRNA [70] ...............19 Hình 1.5. Vị trí các gen trên cpDNA của Trifolium subterraneum [88] ..................21 Hình 1.6. Vị trí tương đối của matK so với trnK trên cpDNA [75] ..........................22 Hình 3.1. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phương pháp định tính, định lượng monotropein ......................................................................................................50 Hình 3.2. Sắc ký đồ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của monotropein ......................................................................................................54 Hình 3.3. Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu ............55 Hình 3.4. Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích ..........................................................................................................................56 Hình 3.5. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu phương pháp định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích ...................................................................................................60 Hình 3.6. Quy trình chiết xuất dịch chiết toàn phần .................................................61 Hình 3.7. Sơ đồ phân lập, tinh chế monotropein từ cao chiết MeOH ......................63 Hình 3.8. Sơ đồ phân lập, tinh chế nystose từ cao chiết nước ..................................65 Hình 3.9. Công thức cấu tạo của monotropein .........................................................66 Hình 3.10. Công thức cấu tạo của nystose................................................................67 Hình 3.11. Sắc ký đồ tạp chất liên quan monotropein ..............................................69 Hình 3.12. Chất chuẩn monotropein, SKS: 0119.C005.01 .......................................73 Hình 3.13. Sắc ký đồ SKLM thử tạp chất liên quan nguyên liệu nystose .................76 Hình 3.14. Chất chuẩn nystose, SKS: 0119.C006.01 ................................................80 vii
Hình 3.15. Kết quả thử tạp chất liên quan nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose ..........................................................................................................................82 Hình 3.16. Kết quả điện di tách chiết ADN toàn phần .............................................85 Hình 3.17. Kết quả khuếch đại đoạn ITS với đoạn mồi ITS P5- ITS U4 và ITS4-ITS1 ..........................................................................................................................86 Hình 3.18. Kết quả khuếch đại đoạn gen trên chloroplast .......................................87 Hình 3.19. Kết quả gióng hàng trên trình tự ITS ......................................................89 Hình 3.20. Kết quả gióng hàng trên trình tự matK ...................................................90 Hình 3.21. Kết quả gióng hàng trên trình tự rbcL ....................................................91 Hình 3.22. Kết quả gióng hàng trên trình tự trnH-psbA...........................................92 viii
ĐẶT VẤN ĐỀ Ba kích (Morinda officinalis) là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng trong Y học cổ truyền, được biết đến với nhiều tác dụng: Bổ thận, tráng dương, mạnh gân cốt, tăng lực, tăng sức đề kháng, chống viêm [10], [12], [16], [18]… Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng của dược liệu rễ Ba kích và các chế phẩm từ dược liệu rễ Ba kích ngày một tăng. Thị trường dược liệu rễ Ba kích cũng rất đa dạng, bao gồm các nguồn cung cấp dược liệu được nhập khẩu từ Trung Quốc, được trồng theo quy hoạch phát triển vùng trồng dược liệu [13], và nguồn thu hái tự nhiên. Do đa dạng về nguồn cung cấp nên chất lượng của dược liệu rễ Ba kích chưa được kiểm soát chặt chẽ. Hiện nay, dược liệu rễ Ba kích hay bị nhầm lẫn do hình dáng, trong khi việc định danh dược liệu bằng hình thái học là một công tác khó khăn vì sau khi thu hái và xử lý thì không thể thu thập đầy đủ thông tin về đặc điểm thực vật của mẫu dược liệu. Cần có một phương pháp bổ trợ trong định danh dược liệu để đảm bảo tính đúng của dược liệu rễ Ba kích, và phương pháp định danh dược liệu bằng giải trình tự ADN là một phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt ra. Để kiểm soát được chất lượng dược liệu rễ Ba kích, cần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu trong đó kiểm soát được đầy đủ các chỉ tiêu về hình thái cũng như một số “marker” (những chất có hoạt tính sinh học hoặc có hàm lượng cao có trong dược liệu [86]). Đồng thời, phải thiết lập được những chất chuẩn của “marker” này để cung cấp cho hệ thống kiểm nghiệm nhằm giảm chi phí cũng như thời gian kiểm nghiệm so với việc phải mua những chất chuẩn này từ nước ngoài. Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, hiện nay Dược điển Trung Quốc, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam có chuyên luận dược liệu rễ Ba kích. Trong đó, chuyên luận Ba kích trong Dược điển Việt Nam V mới chỉ có một số chỉ tiêu cơ bản về mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, chưa có chỉ tiêu định lượng thành phần hóa học [3]. Dược điển Trung Quốc và Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông đã có chỉ tiêu định lượng “marker” - nystose [37], [47]. Về “marker” trong dược liệu rễ Ba kích: Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về một số hợp chất trong rễ Ba kích có tác dụng sinh học như: Monotropein có tác dụng chống viêm [12], [38], oligosaccharid (nystose) có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron [59], hay nhóm anthraquinon và polysaccharid có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu 1
xương [89]. Một số công trình khoa học đã công bố hàm lượng các chất monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích cũng ở mức tương đối cao (monotropein: 0,046 % [91], nystose:  3,0% [11]). Do vậy, monotropein và nystose đủ điều kiện là “marker” của dược liệu rễ Ba kích, cần được kiểm soát hàm lượng và thiết lập chất chuẩn để phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích. Xuất phát từ những vấn đề cấp thiết ở trên, luận án: “Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) của Việt Nam” được thực hiện với 3 mục tiêu chính: 1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và thiết lập được 2 chất chuẩn monotropein, nystose từ dược liệu rễ Ba kích. 2. Định danh được dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN. 3. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) 1.1.1. Vị trí phân loại của Ba kích Theo “Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta, Angiospermae) ở Việt Nam” [1] và các tài liệu phân loại thực vật khác: Hệ thống của Takhtajan năm 2009 [79] và hệ thống APG II [55], vị trí phân loại chi Morinda trong giới thực vật được trình bày trong Bảng 1.1. Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Morinda Phân giới Cormobionta (Thực vật bậc cao) Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan) Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan) Phân lớp Lamiidae (Phân lớp Bạc hà) Bộ Gentianales (Bộ Long đởm) Họ Rubiaceae (Họ Cà phê) Chi Morinda Tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê Rubiaceae. Tên gọi khác: Ba kích thiên, Ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thao tày cáy (Tày), Ba kích nhục, Liên châu Ba kích [10]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái Cây dây leo bằng thân cuốn, dài từ 3 - 5m. Rễ phình to thành củ, hình trụ, mập, vặn vẹo. Củ thường hơi thắt lại tạo thành các đốt có chiều dài từ 1 - 3 cm, trông giống ruột gà. Vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng, tím hay trắng, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi cứng có tỷ lệ so với đường kính củ khác nhau [4]. Thân hình tròn, chia nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau. Thân non nhẵn, phủ lông ngắn-cứng hay lông dài, có cạnh, màu xanh, tím đậm hoặc tím nhạt, sau nhẵn, chuyển từ màu xanh sang nâu [1], [2], [5]. Lá đơn, mọc đối. Phiến lá hình mác hoặc bầu dục thuôn nhọn. Gốc lá hơi lệch, nhọn, tròn hoặc hơi hình tim; mép phẳng hay lượn sóng, hơi uốn mặt sau; ngọn lá tròn hay nhọn; mặt trên nhẵn hay phủ lông dài; mặt dưới nhẵn hay phủ lông. Lá non màu tím sau chuyển sang xanh, có thể có hoặc không hốc Domatia hốc giữa gân chính và phụ có phủ lông. Gân lá hình lông chim, gồm 4 - 9 cặp gân bên, nổi mặt dưới, lõm ở mặt trên. Gân chính có lông hoặc nhẵn ở mặt dưới. Lá kèm 2, dính nhau, ôm lấy 3
thân, mỏng, mỗi lá có 2 thùy nhọn hoặc hàn liền ở dưới, trên chia làm 2 thùy, dài 2 – 4 mm, màu trắng, nâu hay tím nhạt, ôm sát vào thân, dài 4 mm [4]. Cụm hoa dạng tán, gồm 1-8 tán ở nách lá hay đầu cành, mỗi tán mang 1-14 hoa. Hoa nhỏ, khi mới nở màu trắng, sau hơi vàng hay tím đen. Đài 3-4, hơi dính nhau ở dưới, đều hay không đều nhau. Tràng 3-4, có phần móng dính nhau tạo thành ống hình chum hoặc hình trụ, nhẵn hay phủ lông ở mặt ngoài; phần phiến rời, hình tam giác, mặt ngoài nhẵn hay phủ lông, mặt trong có một vòng lông dày đặc, thẳng, màu trắng. Quả hình cầu, từ 1-8 quả/1 tán, rời hoặc dính với nhau thành quả kép ở các mức độ khác nhau. Bề mặt quả nhẵn hoặc phủ lông, xanh khi non và chuyển màu cam khi chín, mang 3 đài còn lại trên đỉnh quả, có hình dạng và kích thước không đều nhau [8]. 1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến - Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang; một số tỉnh miền Trung và Tây Nguyên (Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum) [18]. - Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay [4], [5], [10]. - Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae) [5], [10]. - Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi không dính tay, đập nhẹ cho bẹp, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô [10], [16], [19]. 1.1.4. Thành phần hoá học Một số nhóm chất trong rễ Ba kích gồm: - Iridoid: Monotropein (0,042%), acid desacetyl asperulosidic (0,0038%), asperulosid (0,0003%), morindolid (0,0002%) , morofficinalosid (0,0001%), acid asperulosidic (0,0001%) [91]. - Oligosaccharid: Nystose ( 3,0%) [21], l-borneol-6-o-β-D-apiosyl-β-D- glucosid (0,0001%) [91], 1F-fructofuranosylnystose, inulin-type hexasaccharid, heptasaccharid [19], [59], [94]. - Ngoài ra còn có 6 hợp chất Anthraquinon [58], [89], [91], [93]; 2 hợp chất sterol; 1 hợp chất saponintriterpen (acid rotugenic 0,0007%) [91], một hợp chất lacton [91], [94], và một số acid amin [16], [19]. 4