Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng Acetylcholinesterase của một số loài trong họ Thạch tùng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:253

Thêm vào BST

Báo xấu

47
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu so sánh đặc điểm thực vật học của một số loài thuộc họ Thạch tùng (Lycopodiaceae); thử nghiêm in vitro sàng lọc tác dụng kháng acetylcholinesterase của cao chiết của một số loài Thạch tùng;... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng Acetylcholinesterase của một số loài trong họ Thạch tùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG HỌ THẠCH TÙNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG HỌ THẠCH TÙNG Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN TS TRẦN MẠNH HÙNG TP. HỒ CHÍ MINH, năm 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án
i MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT ............................. iii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi DANH MỤC SƠ ĐỒ .............................................................................................. viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... viii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC ..........................................................3 1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ...........................................7 1.3. CÁC PHƯƠNG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÁP PHÂN TÍCH HUPERZIN A .......................................................................................................18 1.4. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................................20 1.5. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE ............................................................................22 1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM VỀ TRÍ NHỚ ..............................23 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỌ THẠCH TÙNG ..............................25 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................27 2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU ...........................................................................27 2.2. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU ........................................................................27 2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................28 2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...............................................29 2.4. CỠ MẪU ........................................................................................................29 2.5. XÁC ĐỊNH CÁC BIẾN SỐ...........................................................................30 2.6. DUNG MÔI - HÓA CHẤT - TRANG THIẾT BỊ .........................................30 2.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................31 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................51 3.1. KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC .....................................................................51 3.2. TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG ..........................................................................................58 3.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC ............................................................................61 3.4. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................................82
ii 3.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CZE VÀ HPLC..................................................88 3.6. NGHIÊN CỨU IN VIVO TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA THẠCH TÙNG NGHIÊN .................................................................................................104 Chương 4. BÀN LUẬN .......................................................................................106 4.1. VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC ........................................................................106 4.2. VỀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG .........................................................110 4.3. VỀ MẶT HÓA HỌC ...................................................................................112 4.4. VỀ MẶT THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................119 4.5. VỀ MẶT XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC LIỆU .......................................................................................................121 4.6. VỀ MẶT THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC ....................................................125 KẾT LUẬN .............................................................................................................129 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................132 TÀI LIỆU THAM KHẢO
iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AChE Acetylcholinesterase AD Alzheimer's Disease Bệnh Alzheimer's BuChE Butylcholinesterase CC Column Chromatography Sắc ký cột COSY Correlation Spectroscopy DCM Dicloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam Distortionless Enhancement by DEPT Polarization Transfer DTNB 5,5ʹ-dithio-bis-nitro benzoic EtOAc Ethyl acetat Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thực phẩm FDA dược phẩm Hoa Kỳ HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC High Pressure Liquid Chromatography Sắc ký lỏng cao áp HRMS High Resolution Mass Spectrometry Khối phổ phân giải cao Heteronuclear Multiple Quantum HSQC Correlation IC Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế IR Infrared Hồng ngoại MS Mass Spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Ultraviolet Tử ngoại Primary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học sơ PCRS cấp Secondary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học thứ SCRS cấp LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng
iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ............................................................................29 Bảng 2.2. Thành phần một mẫu thử nghiệm theo phương pháp Ellman ..................32 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khác nhau của các chi trong họ Thạch tùng ..............55 Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm cao chiết MeOH và hiệu suất chiết các dược liệu ...................................................................................................................................58 Bảng 3.3. Kết quả tác động ức chế AChE của mẫu thử nghiệm ...............................59 Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật .....................................61 Bảng 3.5. Kết quả so sánh 2 quy trình phân lập alcaloid ..........................................62 Bảng 3.6. Các phân đoạn của cột Diaion HP-20.......................................................64 Bảng 3.7. Các phân đoạn của cột sắc ký MeOH 100 % ...........................................65 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 1 ........................................66 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 2 ........................................68 Bảng 3.10. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 3 ......................................70 Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 4................................72 Bảng 3.12. So sánh kết quả của PP1, PP2, PP3 ........................................................73 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5 ...........................................................77 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 6................................78 Bảng 3.15. Kết quả tác động ức chế AChE của các hợp chất phân lập được ...........80 Bảng 3.16. Các phân đoạn của cột R-1 .....................................................................81 Bảng 3.17. Các phân đoạn của cột R-2 .....................................................................81 Bảng 3.18. Kết quả khảo sát hàm ẩm và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết ...........82 Bảng 3.19. Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết sắc ký của huperzin A .................................................................................................................83 Bảng 3.20. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu thiết lập CĐC ...................................................................................................................................84 Bảng 3.21. Kết quả phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA........................87 Bảng 3.22. Kiểm tra tính phù hợp hệ thống và kết quả xác định hàm lượng huperzin A tại 2 phòng thí nghiệm (n = 6) ...............................................................................87 Bảng 3.23. Xác định giá trị công bố .........................................................................87 Bảng 3.24. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn .......................92 Bảng 3.25. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử ............................92
v Bảng 3.26. Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong Thạch tùng răng....................................................................................................................93 Bảng 3.27. Tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của huperzin A ................................................................................................................................94 Bảng 3.28. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng huperzin A .....95 Bảng 3.29. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn huperzin A ....97 Bảng 3.30. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong Râu rồng ....................................................................................................................98 Bảng 3.31. Kết quả tính toán hàm lượng huperzin A trong cây Râu rồng ...............99 Bảng 3.32. Tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của huperzin A .........................99 Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng ......................100 Bảng 3.34. Kết quả xác định hàm lượng huperzin A của 10 loài trong họ Thạch tùng .................................................................................................................................103 Bảng 4.1. Các hệ thống phân loại họ Thạch tùng ...................................................107
vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của bốn nhóm Lycopodium alcaloid .............................................8 Hình 1.2. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycodin ................................8 Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycopodin ............................9 Hình 1.4. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung fawcettimin .........................9 Hình 1.5. Cấu trúc của một số Lycopodium alcaloid trong cây Thạch tùng răng .....10 Hình 1.6. Cấu trúc của một số acid phenolic được phân lập từ loài Lycopodium clavatum ....................................................................................................................11 Hình 1.7. Cấu trúc một số terpenoid được phân lập từ loài Lycopodium japonicum ...................................................................................................................................11 Hình 1.8. Cấu trúc của một số flavonoid trong chi Lycopodium ..............................12 Hình 1.9. Cấu trúc của một số alcaloid trong cây Thạch tùng nghiên ......................14 Hình 1.10. Cấu trúc của huperzin A..........................................................................15 Hình 3.1. Các loài Thạch tùng nghiên cứu ...............................................................54 Hình 3.2. So sánh đặc điểm vi phẫu rễ của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 56 Hình 3.3. So sánh đặc điểm vi phẫu thân của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng ...................................................................................................................................57 Hình 3.4. So sánh đặc điểm vi phẫu lá của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 58 Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết alcaloid từ quy trình 1 và quy trình 2 ......................62 Hình 3.6. Sắc ký đồ các phân đoạn MeOH 100 % ...................................................64 Hình 3.7. Công thức cấu tạo của huperzin A ............................................................67 Hình 3.8. Công thức cấu tạo của một số hợp chất khung cấu trúc Phlegmariurin B 68 Hình 3.9. Công thức cấu tạo của hợp chất 2 (Lycosquarosin A) ..............................69 Hình 3.10. Các tương tác xa của hợp chất 2 (lycosquarosin A) ...............................69 Hình 3.11. Công thức cấu tạo của acetylaposerratinin .............................................71 Hình 3.12. Công thức cấu tạo của huperzinin ...........................................................72 Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn alcaloid ...........................................................75 Hình 3.14. Sắc ký đồ các phân đoạn cột Diaion .......................................................75 Hình 3.15. Công thức cấu tạo của lycocernuin .........................................................76 Hình 3.16. Khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid .........................79 Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác của lycocernuasid A.........................80 Hình 3.18. Sắc ký đồ các phân đoạn cột R-1 ............................................................81
vii Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn huperzin A ..........................................83 Hình 3.20. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát dung dịch đệm ....................................88 Hình 3.21. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát nồng độ dung dịch đệm ......................88 Hình 3.22. Khảo sát nồng độ đệm đến (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển, (c) thời gian xuất hiện pic chuẩn nội ..............................................................................89 Hình 3.23. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát sự ảnh hưởng của pH .........................89 Hình 3.24. Khảo sát pH theo độ phân giải (a) và theo cường độ dòng (b) ...............90 Hình 3.25. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát điện thế ...............................................90 Hình 3.26. Khảo sát điện thế theo (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển ........90 Hình 3.27. Diện di đồ của mẫu thử khảo sát phương pháp chiết ..............................91 Hình 3.28. Điện di đồ mẫu thử chiết huperzin A trong Thạch tùng răng bằng MeOH lần thứ 4 .....................................................................................................................91 Hình 3.29. Phổ UV huperzin A trong mẫu thử và mẫu chuẩn ..................................92 Hình 3.30. Điện di đồ các mẫu trắng (a), chuẩn (b), thử (c), thử thêm chuẩn (d) ....93 Hình 3.31. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của huperzin A .................................................................................................................94 Hình 3.32. Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn khảo sát pha động MeOH - acid phosphoric 0,1 % (18:82) ..........................................................................................96 Hình 3.33. Sắc ký đồcủa mẫu thử khảo sát dung môi chiết ......................................96 Hình 3.34. Sắc ký đồ dịch chiết MeOH lần thứ 4 của mẫu thử ................................97 Hình 3.35. Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn khảo sát tính chọn lọc .................98 Hình 3.36. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của huperzin A ..........99 Hình 3.37. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia phlegmaria .......................................101 Hình 3.38. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia carinata ............................................101 Hình 3.39. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia fordii ................................................101 Hình 3.40. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia tetrasticha ........................................102 Hình 3.41. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia serrata ..............................................102 Hình 3.42. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium complanatum...............................102 Hình 3.43. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium clavatum ......................................102 Hình 3.44. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium casuarinoides ..............................103 Hình 3.45. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodiella cernua ........................................103 Hình 4.1. Công thức cấu tạo của huperzin A và huperzinin ...................................115 Hình 4.2. Công thức cấu tạo của lycosquarosin A và acetylaposerratinin .............117
viii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Vị trí phân loại của Lycopodiaceae……………………………………….3 Sơ đồ 2.1. Quy trình nghiên cứu ...............................................................................28 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ thử nghiệm mô hình mê cung bơi..................................................50 Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Râu rồng .........63 Sơ đồ 3.2. Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Thạch tùng nghiên ...................................................................................................................................74 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Kết quả thử nghiệm tránh né thụ động (n = 5) ...................................104 Biểu đồ 3.2. So sánh thời gian chuột tìm đến chân đế (n = 5) ................................105 Biểu đồ 3.3. So sánh thời gian chuột bơi trong vùng có chân đế (n = 5)................105
1 MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer là một chứng suy giảm trí nhớ phổ biến nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến cuộc sống của người lớn tuổi. Vì bệnh không thể chữa khỏi, người bệnh cần được chăm sóc bởi người thân. Đây quả thực là áp lực rất lớn về mặt xã hội, tâm lý, sức khỏe, kinh tế đối với cuộc sống của những người trong gia đình. Do đó, bệnh Alzheimer trở thành một thách thức lớn cho xã hội trong thế kỷ này [21] [95] [111]. Alzheimer được xem như một triệu chứng của quá trình lão hoá mà đặc trưng của bệnh là sự suy thoái trí nhớ và sự mất trí nhớ toàn bộ xảy ra khi bệnh tiến triển. Những nghiên cứu về căn bệnh đã xác định mối tương quan đáng kể giữa sự hiện diện của chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholin, vốn cần cho việc hình thành và lưu giữ trí nhớ, với sự tiến triển của bệnh Alzheimer. Acetylcholin tồn tại càng lâu trong não thì các tế bào não có thể gợi nhắc trí nhớ càng lâu. Ngày nay, phương pháp hiệu quả nhất là sử dụng các chất có tác dụng ức chế acetylcholinesterase như tacrin, donepezil, galantamin và rivastigmin [33] [94] [112]. Huperzin A được chiết xuất từ cây Thạch tùng răng đã gây được rất nhiều chú ý bởi các công dụng của nó trong điều trị chứng bệnh mất trí nhớ. Các nghiên cứu khoa học hiện đại đã chỉ ra rằng huperzin A có khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase, loại enzym quan trọng trong quá trình gây ra bệnh mất trí nhớ. Huperzin A đã được công nhận là một loại thuốc điều trị mất trí nhớ hiệu quả ở Trung Quốc và hiện nay đã được cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) công nhận là 1 loại thực phẩm chức năng cho các bệnh nhân bị Alzheimer [9] [17]. Huperzin A đã được chứng minh bởi nhiều công trình nghiên cứu rằng nó có thể làm tăng khả năng ghi nhớ và lưu trữ thông tin của não cũng như cải thiện sự sa sút về trí tuệ của các bệnh nhân ở Trung Quốc [35] [49] [136]. Huperzin A cũng có khả năng bảo vệ khác như điều chỉnh tiền chất beta-amyloid protein, qua đó chống lại sự oxi hóa, sự tự chết của tế bào thần kinh theo quá trình apoptosis, rối loạn chức năng của ti thể và có khả năng chống viêm nhiễm. Những khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh của huperzin A đã giúp ích rất nhiều cho các bệnh nhân Alzheimer [57] [117] [124] [125]. Thạch tùng răng có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trevis thuộc họ Thạch tùng (Lycopodiaceae). Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Thạch tùng được sử dụng để điều trị sưng phù nề tâm thần phân liệt [9]. Theo các tài liệu cổ, Thạch tùng được sử dụng trong dân gian ở Việt Nam dùng để điều trị các tổn thương, nôn ra máu, trĩ, đinh nhọt, viêm da, và rắn cắn [2].
2 Ở Trung Quốc, cùng với Huperzia serrata, các thực vật khác thuộc họ Lycopodiaceae có thể chứa hợp chất huperzin A như là Huperzia crispata (Ching) Ching, Huperzia miyoshiana (Makino) Ching và một số loài khác [67] [70]. Trong khi đó ở Việt Nam, một số cây thuộc họ Lycopodiaceae cũng có thể là nguồn thực vật cung cấp các hợp chất tự nhiên theo hướng tác dụng sinh học cải thiện trí nhớ như Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis (Râu rồng), Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm. (Thạch tùng nghiên ) và nhiều loài khác. Thực tế hiện nay chưa có những đánh giá chi tiết và hoàn chỉnh về tác động ức chế enzym acetylcholinesterase và hàm lượng các thành phần Lycopodium alcaloid trong thực vật có thể chứa những hợp chất thuộc dạng này. Với những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase của một số loài trong họ Thạch tùng” được thực hiện với những mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu so sánh đặc điểm thực vật học của một số loài thuộc họ Thạch tùng (Lycopodiaceae). 2. Thử nghiệm in vitro sàng lọc tác dụng kháng acetylcholinesterase của cao chiết của một số loài Thạch tùng. 3. Phân lập một số hợp chất tự nhiên trong cây Râu rồng (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis.), Thạch tùng nghiên (Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm.) và đánh giá tác dụng kháng acetylcholinesterase của các chất phân lập được. 4. Thiết lập chất chuẩn hợp chất kháng enzym acetylcholinesterase phân lập được. 5. Xây dựng phương pháp định lượng hợp chất có tác dụng kháng enzym acetylcholinesterase trong các loài Thạch tùng bằng phương pháp điện di mao quản và HPLC. 6. Thử nghiệm in vivo tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết alcaloid của loài Thạch tùng nghiên có trữ lượng lớn và tiềm năng. .
3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Tổng quan về họ Lycopodiaceae 1.1.1.1. Vị trí phân loại Họ Thạch tùng hay còn được gọi là họ Thông đất (Lycopodiaceae) bao gồm hơn 400 loài cổ thực vật có mạch, tồn tại từ cuối kỷ Silur cách đây khoảng 400 triệu năm, phân bố rộng rãi khắp nơi trên thế giới. Đây là họ thực vật thuộc lớp Thông đất, theo hệ thống phân loại của Øllgaard năm 1989, họ Thạch tùng được phân loại theo Sơ đồ 1.1 [2] [82] . Lycopodiophyta (Ngành Thông đất) Lycopodiopsida (Lớp Thông đất) Lycopodiales (Bộ Thông đất) Lycopodiaceae (Họ Thông đất) Chi Lycopodium L. Chi Lycopodiella Chi Huperzia Chi Phyloglossum Holub Bernh. Kunze Sơ đồ 1.1. Vị trí phân loại của Lycopodiaceae “Nguồn: Øllgaard Benjamin, (1989)” [82] Thực tế hiện nay, họ Lycopodiaceae còn có nhiều hệ thống phân loại khác được đề xuất bởi các nhà khoa học trên thế giới. Phổ biến nhất là hệ thống phân loại của Øllgaard 1989 phân chia bộ Thông đất chỉ có 1 họ Thạch tùng và trong đó có 4 chi như trên. Đối với hệ thống phân loại của Holub 1985 thì phân chia bộ Thông đất thành 2 họ
4 là Huperziaceae và Lycopodiaceae, trong đó có 11 chi [40] [144]. Tác giả Ching cũng đề xuất phân chia bộ Thông đất thành 2 họ là Huperziaceae có 2 chi (Huperzia và Phlegmariurus) và họ Lycopodiaceae có 5 chi (Lycopodium, Diphasiastrum, Palhinhaea, Lycopodiella và Lycopodiostrum) [40] [69] [81]. Chính vì thế mà vẫn còn tồn tại nhiều tên đồng danh xuất phát từ một loài. Cụ thể như cây Râu rồng có tên khoa học là Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis., tên đồng danh của nó là Lycopodium squarrosum Forst. hay Thạch tùng nghiên có tên khoa học là Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm., tên đồng danh là Lycopodium cernuum (L.), Palhinhaea cernua (L.) Franco & Vasc., Lepidotis cernua (L.) P.Beauv [145]. Ngành Thông đất (Lycopodiophyta) có thể bào tử, có rễ thật. Thân phát triển mạnh, phân nhánh rẽ đôi, mang nhiều lá nhỏ dạng vảy hay hình kim, xếp xoắn ốc, có mạch dẫn. Lá bào tử hợp thành bông lá bào tử ở đầu cành. Ngành Thông đất được chia thành 2 lớp: Lớp Thông đất – Lycopodiopsida và lớp Thủy phỉ – Isoetopsida. Trong đó, lớp Thông đất có đặc điểm: Thân đứng hoặc bò trên mặt đất, không có lóng và mắt, phân nhánh theo lối rẽ đôi. Lá nhiều, nhỏ, nguyên, một gân. Lá bào tử tụ thành bông ở ngọn. Túi bào tử đính ở gốc các lá bào tử và chỉ có một ô. Cây đẳng bào tử hay dị bào tử. Lớp Thông đất được chia thành 2 bộ, mỗi bộ có 1 họ: Bộ Thông đất (Lycopodiales) đẳng bào tử, họ Thông đất (Lycopodiaceae) và bộ Quyển bá (Selaginellales) dị bào tử, họ Quyển bá (Selaginellaceae). Các loài trong họ Thông đất thuộc thân thảo đa niên, sinh sản bằng bào tử, phân bố ở nhiều nước châu Á và vùng Trung Mỹ, được phát hiện ở trong các khu rừng nhiệt đới ẩm ướt. Ở Việt Nam, phát hiện được 3 chi là Lycopodium L., Lycopodiella Holub, Huperzia Bernh và có khoảng 16 loài, phân bố ở những vùng núi cao trên 1000 m thuộc các tỉnh Lâm Đồng, Kon Tum, Quảng Nam, Nghệ An, Lào Cai, Cao Bằng, bao gồm [1] [2]: Chi Huperzia: • Huperzia chinense (Christ) Ching (Thạch tùng Trung Quốc) • Huperzia serrata (Thunb.) Trevis (Thạch tùng răng) • Huperzia cancellata (Spring.) Trevis (Thạch tùng bôi) • Huperzia carinata (Poir.) Trevis (Thạch tùng sóng) • Huperzia hamiltonii (Spring.) Trevis (Thạch tùng hamilton) • Huperzia subdisticha Mak (Thạch tùng song đính) • Huperzia obovalifolia (Bon.) (Thạch tùng xoan ngược) • Huperzia phlegmaria (L.) Roth (Thạch tùng đuôi ngựa)
5 • Huperzia salvinoides (Herter) Alston (Thạch tùng bèo) • Huperzia fordii (Baker) R. D. Dixit (Thạch tùng Ford) • Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis (Râu rồng) Chi Lycopodium: • Lycopodium complanatum L (Thạch tùng dẹp) • Lycopodium annotinum L (Thạch tùng nhiều bông) • Lycopodium carsuarinoides L (Thạch tùng dương) • Lycopodium clavatum L (Thạch tùng dùi) Chi Lycopodiella: • Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm. (Thạch tùng nghiên ) 1.1.1.2. Đặc điểm Phân bố, sinh thái Họ Lycopodiaceae bao gồm các loài thân thảo đa niên sống trên mặt đất hay sống phụ sinh. Nhóm sống trên mặt đất có thể phát triển trên các vùng đất bạc màu ẩm hay trong và xung quanh vùng đầm lầy, áp suất thấp. Do đó, chúng thường được tìm thấy trên các vùng núi cao và vùng phụ cận núi cao. Nhóm phụ sinh thường phát triển trên các thân cây to hay mọc trên các vách đá. Chúng thường được tìm thấy ngày càng nhiều trong các khu rừng ẩm ướt và rừng nhiệt đới ở độ cao, ở trong và giữa rêu và thực vật biểu sinh khác [2]. Bốn chi thuộc họ Lycopodiaceae phân bố ở các vùng khác nhau. Chi Lycopodium và chi Lycopodiella gồm các loài mọc trên mặt đất hoặc leo bám lên thân cây khác, mỗi chi gồm khoảng 40 loài. Chi Lycopodium phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và ôn đới. Còn chi Lycopodiella phân bố rộng ở các vùng ẩm ướt, ôn đới và nhiệt đới trên thế giới nhưng đặc biệt đa dạng ở châu Mỹ. Chi Phyloglossum bao gồm các loài thực vật nhỏ mọc ở đất. Đây là một chi đơn loài (Phyloglossum drummondii) đặc hữu của miền nam Australia và New Zealand. Chi Huperzia gồm hơn 200 loài sống phụ sinh hay mọc trên mặt đất có thể phát triển từ vùng nhiệt đới đến các vùng Bắc cực và từ mực nước biển tới môi trường núi cao [2] [66]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái thực vật Thân: Có nhánh hoặc không phân nhánh, nhánh đứng hoặc treo thõng xuống đất nhưng không bao giờ leo. Nếu thân cây được phân nhánh, các nhánh luôn luôn là phân đôi. Thông thường các phân đôi liên tiếp và phân đôi về góc bên phải với nhau. Lá: Lá nhỏ, đơn giản, không cuống, nhiều và bao phủ gần hết thân cây. Thông thường lá dài 2-10 mm và xếp theo hình xoắn ốc khép kín như ở loài Lycopodium clavatum và Lycopodium annotinum. Trong khi đó ở một số trường hợp khác lá xếp
6 theo hình vòng xoắn như Lycopodium verticillatum và Lycopodiella cernua. Ở một số loài khác lá lại xếp theo từng cặp đối diện nhau như Lycopodium alpinium, ở loài khác lá lại không sắp xếp theo bất kỳ quy tắc nào. Lá có dạng mũi mác. Các lá đều giống nhau về kích thước và hình dạng, nhưng trong một vài loài chẳng hạn như Lycopodium complanatum, Lycopodium volubile và Lycopodium chamaecyparissus có lá lưỡng hình và được xếp theo 4 hàng dọc trên thân, 2 hàng kích thước lớn hơn và 2 hàng kích thước nhỏ hơn [7]. Rễ: Phát sinh đơn lẻ hoặc theo nhóm hướng ngọn dọc theo phía dưới của thân cây. Ở một số loài, ví dụ Lycopodium selago, Lycopodium phlegmaria và một số loài khác rễ phát sinh bên ngoài trung trụ không xuyên qua khu vực vỏ của thân. Những rễ này chuyển xuống dưới và xuyên qua vùng vỏ giữa và cuối cùng nó chỉ xuất hiện ở thân cây. Rễ như vậy được gọi là rễ vỏ hay rễ bên trong. Ở một số loài như Lycopodium obscurum và Lycopodium lucidulum điểm nổi bật của quá trình phân nhánh ở rễ là phân đôi. Quá trình phân đôi theo hướng về bên phải của lần phân nhánh trước đó. Ở nhiều loài sự phân nhánh không rõ [24]. Nhánh mang bào tử: Lá thường và lá bào tử giống nhau hoặc khác nhau về hình dạng và kích thước. Nhánh mang bào tử rất đa dạng ở các loài khác nhau. Các nhánh bào tử nằm khắp chiều dài của thân cây. Ở một số loài khác, trên nhánh bào tử có mang lá bào tử. Lá bào tử có thể giống hay khác lá dinh dưỡng về kích thước, độ đậm nhạt trong màu sắc và mép răng cưa. Trong một số loài như Lycopodium clavatum và Lycopodium complanatum nhánh mang bào tử thường sinh ra trên thân cứng dài, và vẫn còn được phủ với một lượng nhỏ lá. Trong một số loài nhánh mang bào tử không cuống ví dụ Lycopodium inundatum, Lycopodium alpinum [116]. Bào tử: Các loài có bào tử nhỏ. Bông bào tử mang nhiều lá bào tử xếp xoắn ốc trên một trục. Mỗi túi bào tử có dạng hình cầu hay hình thận nằm ở nách lá bào tử. Cây sinh sản bằng bào tử. Khi bào tử nảy mầm cho nguyên tản hình tim mang túi tinh và túi noãn, noãn cầu thụ tinh tạo ra hợp tử và phát triển trên nguyên tản tạo thành cây mới [24]. Đặc điểm vi phẫu của rễ: Tiết diện cắt ngang của rễ cho thấy cấu tạo của rễ gồm những phần sau: Rễ bao gồm lớp biểu bì, vùng vỏ và trung trụ như thực vật có mạch khác. Lớp biểu bì là lớp duy nhất làm phát sinh lông hút. Các lông hút được hình thành theo cặp. Lông hút được hình thành do sự phân chia xiên hoặc nếp lồi của tế bào biểu bì non. Nằm ngay dưới lớp biểu bì là vùng vỏ rộng, bao gồm một số tế bào vách dày. Vùng trung trụ gồm tiền mộc chiếm đa số trong tổng thể. Thông thường rễ có 1 khối libe nằm xen giữa khối gỗ hình chữ C hoặc hình chữ U [7].
7 Đặc điểm giải phẫu thân: Vi phẫu cắt ngang của thân cây trưởng thành của Lycopodium clavatum cho thấy: Biểu bì là một lớp tế bào dày, bên ngoài có phủ lớp cutin. Vùng vỏ là khá rộng và thay đổi rất nhiều trong độ dày tương đối từ loài này sang loài khác. Ở một số loài độ dày gấp nhiều lần so với trung trụ, ở các loài khác hai vùng này là tương đương nhau. Vỏ có ba vùng. Các vùng bên ngoài và trung tâm bao gồm các tế bào hóa mô cứng dày trong khi vùng giữa bao gồm các tế bào lớn hơn và mỏng có chứa một vài lục lạp. Vùng trung trụ chiếm khoảng một nửa diện tích của phần này, bao gồm các tế bào có hình dạng không đều, gồm gỗ xen kẽ với libe. Gỗ bao gồm: chủ yếu là quản bào hình thang, không có mạch và tế bào mô mềm. Mỗi bó gỗ được bao quanh bởi duy nhất một lớp mô mềm. Libe chỉ gồm các ống rây và mô mềm. Sự phát triển của cả libe và gỗ hướng tâm. Các tiền mộc gồm các quản bào xoắn ốc. Các tiền mộc nằm ở cạnh ngoài của bó gỗ. Ở mặt trong của vùng vỏ có thể có một lớp nội bì, ít nhất là ở vùng thân non có thành xuyên tâm dày đặc. Các nội bì của của các loài thuộc Lycopodium được cho là có nguồn gốc từ vùng trung trụ, không phải từ vùng vỏ. Bên trong nội bì là lớp trụ bì gồm nhiều lớp. Lớp trụ bì thường có từ 3-6 lớp tế bào dày [7]. Đặc điểm giải phẫu của lá: Tiết diện cắt ngang của lá có cấu tạo như sau: Gân giữa có một bó dẫn duy nhất. Gỗ ở trung tâm khá nhỏ, không phân biệt được cấu tạo cấp 1 và cấp 2. Gỗ bao gồm thành dày bao quanh. Libe bao gồm mô mềm libe và ống rây. Nội bì khó nhìn thấy. Các bó mạch vẫn còn bao quanh bởi trụ bì hóa mô cứng. Mô mềm lá nằm giữa bó mạch và lớp biểu bì. Lớp biểu bì của hầu hết các loài có lỗ khí trên cả hai mặt của lá như trong Lycopodium clavatum, Lycopodium selago. Tuy nhiên, ở các loài có lá lưỡng hình các lỗ khí thường được tìm thấy trên một mặt của lá như trong Lycopodium complanatum và Lycopodium volubile [7] [24]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Các nhóm hoạt chất được phát hiện nhiều nhất từ các loài thuộc họ Thạch tùng chủ yếu bao gồm nhóm Lycopodium alcaloid, terpenoid, flavonoid và các acid phenolic [66] [97] [149]. 1.2.1. Lycopodium alcaloid Các Lycopodium alcaloid này thường có khung cấu trúc 16 carbon, 32 carbon, một số ít công thức hóa học có ít hơn 16 carbon và được chia thành 4 nhóm là lycopodin, lycodin, fawcettimin và nhóm có cấu trúc khác tương tự như phlegmarin [9] [54] [58] [66].
8 N O B OH H 12 N B 13 A 12 B C 13 O 12 13 1 4 13 4 A 1 4 4 12 NH N A N HN 1 A C C 1 C Lycodin lycodin Lycopodin lycopodin Fawcettimin fawcettimin Phlegmarin Phlegmarin Hình 1.1. Cấu trúc của bốn nhóm Lycopodium alcaloid “Nguồn: Ma X., 2004” [66] Theo đề xuất về sinh phát nguyên của Corony, khung cấu trúc của các Lycopodium alcaloid này có cấu tạo bởi 2 đơn vị 2 - propylpiperidin, liên kết với nhau tạo thành khung phlegmarin. Sự hình thành liên kết giữa C4 và C13 tạo ra khung lycodan. Các alcaloid thuộc nhóm này phân lập được trong tự nhiên đa số đều có vòng A bị oxy hóa thành vòng pyridin và pyridon. Sự thay đổi ở vị trí C1 gắn với Nα được tách ra và gắn lại vào Nβ đã tạo ra khung lycopodin. Khung fawcettimin được hình thành từ sự dịch chuyển C4 liên kết với C13 chuyển sang C4 liên kết với C12 [66]. Nhóm lycodin: Khung cơ bản của nhóm này cũng bao gồm 4 vòng 6 cạnh liên kết với nhau nhưng khác với nhóm lycopodin là vòng A mở và sắp xếp lại thành vòng piridin hoặc vòng piridon. Tất cả các Lycopodium alcaloid nhóm này có hoạt động ức chế AChE, đáng chú ý nhất là huperzin A, huperzin B, N-methyl-huperzin B [64] [91]. H H H N N N H H O O O Me N N + N HO O β-Obscurin Casuarin B Huperzinin N-oxid OH OH H H H N O NH N NH NH H 2N H O O Huperzin B Lycoparin C Huperzin U Hình 1.2. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycodin “Nguồn: Zhang, Dong-Bo, 2013” [152]
9 Nhóm lycopodin: Là nhóm có nhiều hợp chất được phân lập nhất của Lycopodium alcaloid. Nhóm này được đặc trưng bởi 4 vòng 6 cạnh liên kết với nhau, trong đó vòng A và vòng C là vòng quinolizidin. Lycocarinamin A Malycorin B Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycopodin “Nguồn: Kogure, Noriyuki và cộng sự, 2016” [55] Nhóm fawcettimin: Đặc điểm khung cấu trúc của nhóm này là liên kết đôi ở carbon số 13 và 14. Do đó, nó dễ dàng bị hydrat hóa để gắn hydroxyl vào vị trí C13. Palhicerin D Phlegmariurin B Hình 1.4. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung fawcettimin “Nguồn: Tang Yu., 2016” [109] Nhóm lycopodium alcaloid khác: Các hợp chất trong nhóm này có cấu trúc rất đa dạng. Khung cơ bản của nhóm là phlegmarin. Khung phlegmarin được xem là chất trung gian để sinh tổng hợp các Lycopodium alcaloid khác. Khác với 3 nhóm trên, nhóm này có C4 không nối với C12 và C13 qua cầu nối C-C, khung cấu trúc chỉ có 3 vòng, thay vì ba nhóm trên khung cấu trúc có 4 vòng. Tuy nhiên, cũng có một số trường hợp ngoại lệ, một số hợp chất thuộc nhóm này nhưng khung cấu trúc có 6 vòng như huperzin J, lucidin A, oxolucidin A, lucidin B, oxolucidin B. Cermizin A giống phlegmarin nhất chỉ khác ở Nα và C9. Cernuin, lycocernuin có cấu trúc khác với phlegmarin, các hợp chất này mở vòng D ở C7-C12 tạo thành khung tetracyclic. Ngoài ra, nhóm này còn có 5 alcaloid có 2 vòng: huperzinin B, phlegmariurin N, cermizin C, senepodin G và senepodin H là những alcaloid lycopodin có cấu trúc đơn giản nhất, vòng quinolizidin