Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần Alkaloid, Flavonoid của lá, tâm sen
lượt xem 5
download
Đề tài nghiên cứu tiến hành chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen bằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm; thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm,... Mời các bạn cùng thham khảo nội dung chi tiết.
Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!
Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần Alkaloid, Flavonoid của lá, tâm sen
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2015
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã số: 62.72.04.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN HÙNG 2. PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN TP Hồ Chí Minh – Năm 2015
- LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Người cam đoan, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ
- i MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC .................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ ................................................... viii MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4 1.1. Thực vật học về Sen ............................................................................................ 4 1.2. Hóa học về Sen .................................................................................................... 7 1.3. Chiết xuất- phân lập các alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen ..................... 12 1.4. Các phương pháp phân tích thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen . 16 1.5. Tác dụng sinh học của lá, tâm Sen ..................................................................... 19 1.6. Công dụng của Sen............................................................................................. 21 1.7. Chất đối chiếu ................................................................................................... 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 25 2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................ 25 2.2. Nguyên vật liệu – Dung môi, hóa chất, thuốc thử – Trang thiết bị................... 25 2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................... 28 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................. 47 3.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen .... 47 3.1.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá và tâm Sen .................................. 47 3.1.2. Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen ...................... 48 3.1.3. Phân lập alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen ................................................. 48 3.1.4. Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen...... 60 3.1.5. Xác định cấu trúc các chất phân lập được....................................................... 61 3.2. Thiết lập một số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen ..... 80
- ii 3.3. Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen ............................................................................................... 85 3.4. Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen ....... 104 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .................................................................................... 108 4.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc cấu trúc các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen ....................................................................................................... 108 4.2. Qui trình định tính, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen ........................................................................................................... 117 4.3. Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm từ lá, tâm Sen ..................................... 124 4.4. Đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen ................................................................ 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
- iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile ASEAN Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á) CĐC Chất đối chiếu CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản) Corr Area Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide CZE Capillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng) d doublet (đỉnh đôi) DVT Dấu vân tay DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry (Quét nhiệt vi sai) DMSO Dimethylsulfoxide ĐDĐ Điện di đồ DTAB Dodecyltrimethylammonium bromide ESI Electrospray Ionization (Ion hóa phun mù electron) EOF Electro-osmotic flow (Dòng điện thẩm) FCPC Fast centrifugal partition chromatography (Sắc ký phân bố ly tâm nhanh) GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation ICH International Conference on Harmonization IR Infrared (Hồng ngoại) i-ProOH Isopropanol
- iv J Coupling constant (Hằng số ghép) LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) LDL Low density lipoprotein LOD Limit of detection LOQ Limit of quantitation MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động) MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 (Tế bào ung thư vú dòng MCF-7) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) NACE Non aqueous capillary electrophoresis NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PE Petroleum ether (ether dầu hỏa) PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) PTN Phòng thí nghiệm RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) s singlet (Đỉnh đơn) SKĐ Sắc ký đồ SCRS Secondary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học thứ cấp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TEA Triethylamin TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) THF Tetrahydrofuran TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến) VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không)
- v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Nelumbo .................................................................... 4 Bảng 1.2. Các alkaloid khung aporphin có trong lá Sen ............................................ 8 Bảng 1.3. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong lá Sen .............................. 8 Bảng 1.4. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong tâm Sen ......................... 10 Bảng 1.5. Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có trong tâm Sen .................... 11 Bảng 1.6. Tóm tắt các nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen ........... 12 Bảng 1.7. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng alkaloid, flavonoid lá và tâm Sen............ 16 Bảng 2.1. Nơi thu hái nguyên liệu lá và tâm Sen loài Nelumbo nucifera G. ........... 26 Bảng 2.2. Nơi thu hái nguyên liệu lá Sen loài N. Lutea Willd và Victoria regia. ........ 26 Bảng 2.3. Các chế phẩm có chứa lá và tâm Sen. ...................................................... 26 Bảng 2.4. Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen. ................... 30 Bảng 2.5. Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 và tủa F từ lá Sen. .................... 33 Bảng 2.6. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cao A3, cao N lá Sen. ............................. 34 Bảng 2.7. Điều kiện tiến hành sắc ký cột phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen ... 34 Bảng 2.8. Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 phân đoạn F1, F6, F8 . 35 Bảng 2.9. Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho FCPC phân đoạn P-2 ................................................................................................. 36 Bảng 3.1. Kết quả chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen .............................................. 47 Bảng 3.2. Kết quả chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen ..................... 47 Bảng 3.3. Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen ................ 48 Bảng 3.4. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A2, lá Sen. .................................... 50 Bảng 3.5. Kết quả thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1 ............................................. 50 Bảng 3.6. Kết quả thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2 ................................. 50 Bảng 3.7. Kết quả thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 .................................. 51 Bảng 3.8. Kết quả thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 ............................................. 51 Bảng 3.9. Kết quả thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6 .................................. 51 Bảng 3.10. Kết quả thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 và A2-12 ......................... 52 Bảng 3.11. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A3 lá Sen .................................... 52
- vi Bảng 3.12. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao N lá Sen ...................................... 52 Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột silica gel trên tủa F, lá Sen ....................................... 53 Bảng 3.14. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F1 .............................................. 53 Bảng 3.15. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3 .......................................... 54 Bảng 3.16. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7 ............................................. 54 Bảng 3.17. Kết quả thu hứng LF-2 và LF-4 từ F7-3 ................................................ 54 Bảng 3.18. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F8 .............................................. 54 Bảng 3.19. Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen .............. 55 Bảng 3.20. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP5, tâm Sen ................... 57 Bảng 3.21. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP8, tâm Sen ................... 57 Bảng 3.22. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn P ............................................... 58 Bảng 3.23. Kết quả FCPC phân đoạn P-2 ................................................................ 58 Bảng 3.24. Kết quả Sephadex LH-20 của phân đoạn n-Bu ..................................... 58 Bảng 3.25. Kết quả các phân đoạn sau SPE từ n-Bu II ............................................ 59 Bảng 3.26. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EF, tâm Sen ................................ 59 Bảng 3.27. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn EF-8, tâm Sen ........................... 59 Bảng 3.28. Độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen ........... 60 Bảng 3.29. Dữ liệu phổ UV, MS của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 .............................. 61 Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 13C- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 ........................... 61 Bảng 3.31. Dữ liệu phổ 1H- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 ............................ 62 Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 13C và 1H-NMR của LN-5 .................................................. 63 Bảng 3.33. Dữ liệu phổ UV, MS của LN-8, LN-9 ................................................... 64 Bảng 3.34. Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của LN-8, LN-9. ..................................... 64 Bảng 3.35. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-1, EN-2, EN-3................................... 65 Bảng 3.36. Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của EN-1, EN-2, EN-3. ......................... 66 Bảng 3.37. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của các alkaloid EN-4, EN-5 ......................... 67 Bảng 3.38. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-4 ................................................ 67 Bảng 3.39. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-5 ................................................. 69 Bảng 3.40. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 ........................ 74 Bảng 3.41. Dữ liệu phổ 13C-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 ............................ 75
- vii Bảng 3.42. Dữ liệu phổ 1H-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 ............................. 75 Bảng 3.43. Dữ liệu phổ UV, MS của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 ..................... 76 Bảng 3.44. Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 .................... 76 Bảng 3.45. Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 .................... 77 Bảng 3.46. Dữ liệu phổ UV, MS của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 ............ 78 Bảng 3.47. Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 .......... 78 Bảng 3.48. Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 ........... 79 Bảng 3.49. Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3) .......................................... 81 Bảng 3.50. Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết HPLC-PDA của 06 CĐC .......................................................................................... 82 Bảng 3.51. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC của 06 CĐC ............................................................................................................... 82 Bảng 3.52. Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của qui trình phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC................................................................... 82 Bảng 3.53. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu thiết lập CĐC ... 83 Bảng 3.54. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử của các CĐC ............... 84 Bảng 3.55. Kết quả đánh giá đồng nhất lô của quá trình đóng lọ các CĐC ............. 84 Bảng 3.56. Kết quả đánh giá liên PTN của các nguyên liệu thiết lập CĐC ............. 85 Bảng 3.57. Kết quả xác định giá trị ấn định của các CĐC sau khi đóng gói ........... 85 Bảng 3.58 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian, độ đúng qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong mẫu nguyên liệu lá sen (NN-1a) bằng phương pháp CE-PDA/MS................................................................. 90 Bảng 3.58. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM .................................................................... 100 Bảng 3.59. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM .................................................................... 101 Bảng 3.60. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA ................... 102
- viii Bảng 3.61. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC/PDA ................. 102 Bảng 3.62. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA ................ 103 Bảng 3.63. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA .............. 103 Bảng 3.64. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE/PDA ...................... 104 Bảng 3.65. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA ................... 104 Bảng 3.66. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS .................. 104 Bảng 3.67. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS .............. 105 Bảng 3.68. Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100 mg) có trong mẫu nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA ............................................................ 106 Bảng 3.69. Kết quả xác định hàm lượng của các alkaloid (mg/100 mg) có trong 07 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N. nucifera bằng phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA ............................................................................................................. 106 Bảng 3.70. Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100mg) có trong mẫu nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA ................................................................... 107 Bảng 3.71. Kết quả xác định hàm lượng của các flavonoid (mg/100 mg) có trong 06 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N. nucifera bằng phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA ............................................................................................................. 107 Bảng 4.1. Độ dịch chuyển trên phổ 13 C và 1 H để phân biệt 05 alkaloid LN-1, LN-2, LN-3, LN-4, LN-5 ............................................................................ 114 Bảng 4.2. Độ dịch chuyển trên phổ 13 C và 1 H để phân biệt 05 alkaloid EN-1, EN-2, EN-3, EN-4, EN-5 ............................................................................ 115
- ix Bảng 4.3. Độ dịch chuyển trên phổ 13 C và 1 H để phân biệt 04 alkaloid EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 ....................................................................................... 116 Bảng 4.4. Độ dịch chuyển trên phổ 13 C và 1 H để phân biệt 02 alkaloid LN-9, LN-10 ........................................................................................................... 117 Bảng 4.5. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong lá Sen (N. nucifera) Việt Nam................................................................................. 127 Bảng 4.6. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong tâm Sen (N. nucifera) Việt Nam ............................................................................. 127 Bảng 4.7. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có trong lá Sen (N. nucifera) Việt Nam .................................................................. 127 Bảng 4.8. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có trong tâm Sen (N. nucifera) Việt Nam .................................................................... 127
- x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh loài Sen hồng và Sen trắng .............................................................. 4 Hình 3.1. SKLM của 09 alkaloid phân lập từ lá Sen ................................................ 49 Hình 3.2. SKLM của cao A1, A2, A3 lá Sen ........................................................... 49 Hình 3.3. SKĐ 06 lần tiêm mẫu thu hứng LN2, LN8 .............................................. 51 Hình 3.4. SKLM 08 flavonoid phân lập từ lá Sen .................................................... 53 Hình 3.5. SKLM các alkaloid phân lập từ tâm Sen .................................................. 56 Hình 3.6. SKLM các phân đoạn NP5, NP8, P tâm Sen............................................ 56 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 ...................................... 62 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-5....................................... 63 Hình 3.9. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-8, LN-9 ............................ 65 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của EN-1, EN-2, EN-3 ............................................... 67 Hình 3.11. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-4..................................... 69 Hình 3.12. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-5..................................... 70 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 .................................... 75 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của LF-1, LF-5, LF-6, LF-7, LF-8, TF-1 ................... 77 Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 ................... 79 Hình 3.16. Điện di đồ của hỗn hợp chuẩn 07 alkaloid và mẫu thử dịch chiết toàn phần alkaloid lá sen ở điều kiện thích hợp ........................................................ 87 Hình 3.17. Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp chuẩn 07 alkaloid (TIC) và mẫu thử lá Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện thích hợp................................................... 87 Hình 3.18. Phổ MS của nuciferin, 2-O-nornuciferin, norarmepavin, armepavin trong mẫu thử lá Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS ....................................................................... 89 Hình 3.19. Kiểm tra độ tinh khiết pic pronuciferin .................................................. 90 Hình 3.20. Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 07 chuẩn alkaloid và mẫu thử thêm hỗn hợp chuẩn ...................................................................... 90 Hình 3.21. Điện di đồ mẫu hỗn hợp chuẩn 08 flavonoid và mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần lá Sen ........................................................................................ 91
- xi Hình 3.22. SKĐ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 04 chuẩn alkaloid ở điều kiện sắc ký thích hợp ........................................................................ 92 Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu pha động (a), mẫu hỗn hợp chuẩn (b), dung môi pha mẫu (c), mẫu thử lá Sen (d), mẫu thử thêm chuẩn (e). ................................................................. 93 Hình 3.24. Phổ UV-Vis của nuciferin trong (1) mẫu chuẩn, (2) mẫu thử lá Sen, (3) mẫu thử thêm chuẩn và kiểm tra độ tinh khiết pic nuciferin ........................................ 93 Hình 3.25. SKĐ hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid (1), mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần lá Sen (2), ở điều kiện sắc ký thích hợp ................................................... 94 Hình 3.26. Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần tâm Sen, hỗn hợp 09 chuẩn alkaloid ở điều kiện điện di thích hợp ............................................................ 95 Hình 3.27. Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp chuẩn 09 alkaloid (TIC) và mẫu thử tâm Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện điện di thích hợp ................................... 96 Hình 3.28. Phổ MS của isoliensinin N2’-oxyd, isoliensinin N2-oxyd, isoliensinin, pronuciferin trong mẫu thử tâm Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS................................. 97 Hình 3.29. Điện di đồ mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần tâm Sen, hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid ở điều kiện điện di thích hợp .......................................................... 98 Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 07 chuẩn alkaloid và mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần tâm Sen ở điều kiện sắc ký thích hợp .................................................................... 99 Hình 3.31. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid và mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần tâm Sen ở điều kiện sắc ký thích hợp ........................................................... 100
- xii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu................................................... 29 Sơ đồ 2.2. Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ lá Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng .................................................................................... 31 Sơ đồ 2.3. Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ tâm Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng ...................................................................... 32 Sơ đồ 2.4. Chiết xuất cao N từ cắn B bằng phương pháp tạo tủa với TT Bertrand .. 33 Sơ đồ 3.2. Qui trình chiết alkaloid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen .................... 87 Sơ đồ 3.3. Qui trình chiết flavonoid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen .................. 91
- MỞ ĐẦU Có nhiều con đường để tạo ra thuốc phục vụ điều trị và chăm sóc sức khỏe con người, trong đó các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên là một lĩnh vực được các nhà nghiên cứu phát triển dược phẩm trên thế giới quan tâm, nghiên cứu bởi nhiều lợi thế của chúng. Có nhiều cách tiếp cận trong phát triển thuốc có nguồn gốc tự nhiên. Đó là phát hiện các hoạt chất và phát triển chúng theo các tiêu chuẩn của dược phẩm hiện đại phương tây và chứng minh tác dụng của dược liệu, bài thuốc của y học cổ truyền như là một thể thống nhất như nó vốn có và dùng các kỹ thuật hiện đại để đảm bảo, nâng cao hiệu quả điều trị của chúng. Với xu hướng này, những cây thuốc lâu nay được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, trong y học cổ truyền, bên cạnh việc được đánh giá tác dụng trị liệu, đang rất được quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp theo dõi, đánh giá thành phần, hàm lượng các chất chính, để có thể đánh giá, đảm bảo chất lượng, tiêu chuẩn hóa cho các sản phẩm, sử dụng trong chăm sóc sức khỏe một cách an toàn, hiệu quả và khoa học. Việt Nam được thiên nhiên ban tặng một thảm thực vật xanh rộng khắp trên mọi miền đất nước, là điều kiện rất thuận lợi trong việc nghiên cứu và phát triển các thuốc có nguồn gốc dược thảo. Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae) đã gắn liền với cuộc sống tâm linh cũng như thường nhật của người Việt. Sen tượng trưng cho sự tinh khiết và trường thọ, nhưng cũng hết sức bình dị và hữu dụng trong cuộc sống hàng ngày. Sen có ở khắp mọi miền đất nước, nhưng phổ biến nhất có lẽ ở vùng Miền tây Nam bộ mà nổi tiếng nhất là ở Đồng Tháp Mười, nơi được xem là xứ sở Sen. Sen là một trong số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều được sử dụng và đều là những vị thuốc quí, có giá trị. Danh y Hải Thượng Lãn Ông đã viết: “Cây mọc từ dưới bùn đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của trời đất nên củ, lá, hoa, tua, vỏ quả, ruột đều là thuốc hay”. Từ xưa nhân dân ta đã biết dùng ngó Sen, quả Sen làm thực phẩm. Lá Sen, tâm Sen, gương Sen, nhị Sen dùng làm thuốc cổ 1
- truyền để điều trị mất ngủ, hồi hộp, cao huyết áp, tiêu chảy mãn tính, cảm nắng, béo phì, di tinh, cầm máu[1],[3],[8]. Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh dịch chiết lá Sen có nhiều hoạt tính sinh học in vivo như: an thần [45] , chống béo phì [66], [103], , giảm cholesterol trong máu [33], [38], [78] , chống oxy hóa [27],[70] , hạ đường huyết [25],[65] , chống lại sự phát triển của tế bào ung thư [64]…Dịch chiết tâm Sen có hoạt tính an thần [104] , hạ đường huyết[25],[96], hạ huyết áp[88], chống loạn nhịp tim [30],[108] , ức chế kết tập tiểu cầu [100] , kháng HIV [99] . Các hoạt tính sinh học này ít nhiều đều liên quan đến sự hiện diện của thành phần alkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học chiết tách và phân tích, trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và phân tích định tính, định lượng một số thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen. Trong lĩnh vực phân tích cũng đã có một vài nghiên cứu của các tác giả Trung quốc và Ấn độ ứng dụng phương pháp HPLC, CE để định lượng một vài chất trong số các thành phần chính của Sen trong dược liệu, chế phẩm hay dịch sinh học. Tại Việt Nam hiện nay, việc sử dụng lá, tâm Sen trong điều trị bệnh ngày càng trở nên phổ biến. Thế nhưng các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, cũng như các phương pháp định tính, định lượng các chất chính có trong lá, tâm Sen bằng các phương pháp phân tích hóa lý hiện còn rất hạn chế. Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học alkaloid, flavonoid và thiết lập các chất đối chiếu phục vụ cho việc định tính, định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâm Sen Việt Nam là một việc làm cấp thiết. Với những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm Sen và các chế phẩm” được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau: 1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen bằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm. 2. Thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm. 2
- 3. Xây dựng các qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng các phương pháp HPLC và CE. 4. Áp dụng các phương pháp đã xây dựng để định tính, đánh giá thành phần, hàm lượng các alkaloid và flavonoid trong lá, tâm Sen được thu hái từ các tỉnh, thành khác nhau và trong chế phẩm từ Sen có trên thị trường. 3
- CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. THỰC VẬT HỌC VỀ SEN 1.1.1. Chi Nelumbo và vị trí phân loại của chi Chi Nelumbo thuộc họ Sen- Nelumbonaceae trước đây được xếp cùng với họ Súng- Nymphaeaceae. Tuy nhiên, ngày nay được tách ra riêng thành họ Sen, với một chi duy nhất là Nelumbo với hai loài Nelumbo nucifera Gaertn. (Sen hồng, phổ biến ở Việt Nam và một số nước Châu Á như Trung quốc, Ấn độ, Srilanka, Nhật Bản, Thái Lan, Úc) và Nelumbo lutea Willd (Sen trắng, phổ biến ở Đông Bắc Mỹ )[1],[8]. Theo hệ thống phân loại APG II năm 2003 và của Amen Takhtajan năm 2009 [14] , vị trí phân loại của chi Nelumbo được trình bày trong Bảng 1.1. Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Nelumbo Phân giới Cormobionta (Thực vật bậc cao) Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc Lan) Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc Lan) Phân lớp Ranunculidae (Phân lớp Sen) Liên bộ Proteanae Bộ Nelumbonales (Bộ Sen) Họ Nelumbonaceae Chi Nelumbo 1.1.2. Cây Sen - Nelumbo nucifera Loài Sen Nelumbo nucifera Gaertn. có một số đồng danh khác là: Nelumbium nelumbo (L.) Druce, Nelumbium nuciferum Gaertn, Nelumbium speciosum Willd. Trong tiếng Việt, Sen còn được biết với tên là Sen hồng, Liên. Trong tiếng Anh, Sen được gọi với tên thông dụng nhất là lotus nhưng còn được biết với các tên khác như Chinese water - lily, Indian lotus, Egypian bean.[3] Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbo lutea Willd. Hình 1.1. Hình ảnh loài Sen hồng và Sen trắng (nguồn: Wikipedia) 4
- 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái Cây thân rễ mang củ mọc khá sâu trong đáy hồ, sống nhiều năm. Thân rễ hình trụ mọc bò lan trong bùn thường gọi là ngó Sen, có ngăn ngang; thân và cuống lá có bộng to dài. Lá (liên diệp) hình tròn, hình khiên to, có cuống dài vươn lên khỏi mặt nước, cuống có thể dài 0,5 tới 1,5 hay 2 m. Phiến lá có dạng đĩa, với mép lượn sóng, màu lục hoặc xanh lục, thường có lớp sáp rộng trên bề mặt, rộng 20 – 80 cm có gai nhỏ, đính ở giữa phiến lá, mép lá uốn lượn. Hoa rất đẹp, rộng tới 20 – 30 cm, màu hồng tím, trắng có mùi thơm. Hoa đều, lưỡng tính. Lá đài 4 - 5, cánh hoa nhiều, hướng lên và trải ra, nhị nhiều bao phấn hai ô, nứt theo kẽ dọc. Nhiều lá noãn chứa trong một đế hoa loe ra thành hình nón ngược gọi là gương Sen, mỗi lá noãn có 1-2 tiểu noãn. Quả bế màu xanh hình bầu dục, rời nằm sâu trên gương Sen chứa 15 - 25 quả bế, chứa một hạt không nội nhũ. Hạt màu trắng, dài 1,3 - 1,5 cm, phần ngoài mỏng và cứng, màu lục tía, phần giữa mềm chứa tinh bột màu trắng ngà và bên trong là lá mầm dầy có màu xanh sẫm (tâm Sen). Tâm Sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên; rễ mầm không rõ; thân mầm màu xanh, dài 3 - 4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bóng, 2 lá đầu tiên, 1 to, 1 nhỏ, cuống lá mầm màu xanh, hình móc câu, tiết diện đa giác, dài 1,8 - 2 cm, phiến lá mầm hai mép cuộn vào giữa tạo thành một đoạn dài 6-7 mm. Các loài trong chi Nelumbo có hoa giống với các loài hoa Súng trong họ Nymphaeaceae (họ Súng). Tuy nhiên, lá của các loài Sen có thể phân biệt được với lá của các loài trong họ Súng do có hình khiên (lá tròn), trong khi đó Nymphaeaceae có vết khía hình chữ V đặc trưng từ mép lá vào tâm của lá. Quả ở trung tâm chứa hạt của các loài cũng có đặc trưng phân biệt và được gọi là bát Sen [1],[3],[7],[8]. 1.1.2.2. Sinh thái - phân bố Trong thời kỳ cổ đại, Sen đã từng là loại cây mọc phổ biến dọc theo bờ sông Nile ở Ai Cập cùng với một loài hoa súng có quan hệ họ hàng gần gũi có tên gọi dài dòng là hoa Sen xanh linh thiêng sông Nile (Nymphaea caerulea). Từ Ai Cập, Sen đã được đem đến vùng lãnh thổ Assyria và sau đó được trồng rộng rãi khắp các vùng Ba Tư, Ấn Độ và Trung Quốc. 5
CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu một số giải pháp nâng cao chất lượng cung ứng thuốc tại bệnh viện nhân dân 115 - Huỳnh Hiền Trung
135 p | 252 | 62
-
Luận án tiến sĩ dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây học
330 p | 279 | 61
-
Luận án tiến sĩ dược học: Nghiên cứu xác định dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ
219 p | 200 | 39
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin và đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột
243 p | 146 | 20
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Triển khai can thiệp dược lâm sàng vào việc sử dụng hợp lý imipenem và meropenem tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ
325 p | 19 | 11
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng ung thư của thân lá cây củ dòm (Stephania dielsiana Y.C. Wu)
359 p | 17 | 10
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu can thiệp việc sử dụng olanzapin trong điều trị tâm thần phân liệt nhằm đảm bảo hiệu quả, an toàn tại Bệnh viện Tâm thần Trung ương I
237 p | 16 | 10
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ và chống trầm cảm của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) trên thực nghiệm
179 p | 18 | 9
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R. & G.forst. ở Việt Nam
264 p | 17 | 8
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Chùa dù (Elsholtzia penduliflora W. W. Smith)
295 p | 17 | 8
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế và xác định sinh khả dụng viên nén quetiapin 200 mg giải phóng kéo dài
182 p | 13 | 7
-
Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Triển khai can thiệp dược lâm sàng vào việc sử dụng hợp lý imipenem và meropenem tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ
27 p | 14 | 7
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày tá tràng của lá cây Xăng xê (Sanchezia nobilis Hook.F.)
173 p | 12 | 7
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Khảo sát tính đa hình và ảnh hưởng của CYP3A5, CYP2C9 trên bệnh nhân bệnh động kinh Việt Nam
177 p | 26 | 6
-
Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu can thiệp việc sử dụng olanzapin trong điều trị tâm thần phân liệt nhằm đảm bảo hiệu quả, an toàn tại Bệnh viện Tâm thần Trung ương I
27 p | 14 | 6
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến
216 p | 20 | 6
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng
293 p | 12 | 5
-
Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng điều hòa lipid máu của chế phẩm từ bột sấy phun đài hoa của cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae)
162 p | 13 | 5
Chịu trách nhiệm nội dung:
Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA
LIÊN HỆ
Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM
Hotline: 093 303 0098
Email: support@tailieu.vn