Luận án Tiến sĩ Dược học: Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác Interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:199

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Dược học "Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác Interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2" trình bày các nội dung chính sau: Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vị trí hoạt động (orthosteric); Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trí dị lập thể (allosteric); Đánh giá khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR2 và ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL-8 của các chất tiềm năng bằng thử nghiệm in vitro.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác Interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ THÚY NGA SÀNG LỌC CÁC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TƯƠNG TÁC INTERLEUKIN-8 VÀ THỤ THỂ CXCR1/2 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh, Năm 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ THÚY NGA SÀNG LỌC CÁC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TƯƠNG TÁC INTERLEUKIN-8 VÀ THỤ THỂ CXCR1/2 NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 9720205 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ MINH TRÍ Thành phố Hồ Chí Minh, Năm 2024
i LỜI CÁM ƠN Lời cám ơn trân trọng nhất em xin gửi đến Thầy GS.TS. Lê Minh Trí và Thầy GS.TS. Thái Khắc Minh đã định hướng và trực tiếp hướng dẫn đề tài Luận án Tiến sĩ. Cám ơn Thầy trong thời gian qua đã quan tâm, thấu hiểu và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em. Sự tận tình, kiến thức chuyên môn sâu rộng và những góp ý quý giá của Thầy góp phần rất lớn vào thành công của luận án. Được trở thành học trò của Thầy là một điều may mắn vì nhờ Thầy mà em đã có cơ hội học hỏi, trải nghiệm rất nhiều trong nghiên cứu. Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Thầy TS. Nguyễn Quốc Thái đã hướng dẫn tận tình và hỗ trợ quý báu, sự kiên nhẫn, nhiệt tình của Thầy đã giúp em vượt qua những khó khăn, thử thách trong những ngày đầu làm nghiên cứu thực nghiệm. Em xin cám ơn Cô TS. Vũ Thanh Thảo đã cho phép và tạo điều kiện cho em được sử dụng hóa chất và trang thiết bị phục vụ nghiên cứu tại phòng lab của trung tâm Sapharcen. Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến các Thầy/Cô PGS.TS. Trần Mạnh Hùng, PGS.TS. Huỳnh Ngọc Trinh, PGS.TS. Đỗ Thị Hồng Tươi, PGS.TS. Trương Ngọc Tuyền, PGS.TS. Nguyễn Thị Minh Thuận, PGS.TS. Nguyễn Thụy Việt Phương, PGS.TS. Võ Thị Cẩm Vân, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Khôi, PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương, PGS.TS. Nguyễn Đức Hoàng, TS. Mai Huỳnh Như, TS. Nguyễn Kim Anh, TS. Tưởng Lâm Trường đã nhận lời tham dự Hội đồng đánh giá Luận án. Cám ơn Thầy Cô đã dành thời gian đọc, góp ý và phản biện cho đề tài để Luận án được hoàn thiện hơn. Xin gửi lời cám ơn đến Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị tốt nhất để em có thể thực hiện đề tài này. Cám ơn Trường Đại học Kỹ thuật Y-Dược Đà Nẵng đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi được theo học và hoàn thành chương trình đào tạo Tiến sĩ. Em xin thể hiện lòng kính trọng và sự tri ân sâu sắc đến các Thầy Cô Bộ môn Dược lý, Bộ môn Dược lâm sàng, Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Vi sinh, Bộ môn Hóa Dược nói riêng và các Thầy cô trong Khoa Dược nói chung vì đã tận tâm giảng dạy và hết lòng truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá cho em. Em xin cám anh
ii Tưởng Lâm Trường, chị Phạm Diễm Thu và em Mai Thành Tấn vì đã quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian làm Luận án. Em xin gửi lời cám ơn đến anh Lê Quang Đạt và chị Đỗ Nguyễn Minh Thảo đã hỗ trợ dung môi hóa chất, dụng cụ cho em và các bạn làm nghiên cứu. Em cũng xin cám ơn các Thầy Cô Bộ môn Phân tích - Kiểm nghiệm, Bộ môn Hóa sinh và Bộ môn Vi ký sinh đã cho phép và tạo điều kiện cho em được sử dụng trang thiết bị phục vụ nghiên cứu tại Bộ môn. Chị cám ơn Phong đã giúp đỡ rất nhiều từ những ngày đầu chị vào lab Hóa sinh. Một lời cám ơn rất đặc biệt chị muốn gửi đến Hưng, Vy, Hạ, Thư, Thạch, Huyền và Thi vì đã đồng hành cùng chị trong suốt thời gian trên lab Hóa sinh và Vi sinh. Cám ơn vì đã là động lực để chị lên lab mỗi ngày và cố gắng nhiều hơn. Cám ơn vì các em đã luôn sẵn sàng chia sẻ khó khăn với chị, đã quan tâm, kiên nhẫn lắng nghe và động viên chị. Chị cám ơn Minh, Nhân, Phương, Uyên, Ánh và Thủy đã hỗ trợ chị rất nhiều trong giai đoạn chị làm nghiên cứu in silico. Chị cám ơn các bạn monitor tại lab Hóa dược đã cùng chị trải qua khoảng thời gian làm nghiên cứu thật đáng nhớ. Chị cám thấy rất biết ơn và may mắn vì đã là một thành viên của lab 314, cám ơn tất cả các em! Tiếp theo, em chân thành cám ơn chị Trần Quế Hương vì đã cùng nhau vượt qua những vui buồn, thử thách và hạnh phúc trong hơn năm năm nghiên cứu sinh. Chị là đồng nghiệp, cũng là bạn đồng hành cùng em trong mỗi chuyến đi xa, mỗi đợt báo cáo bảo vệ Luận án, lắng nghe những lời chia sẻ và giúp em vượt qua được thời gian khó khăn trong công việc cũng như cuộc sống. Bên cạnh đó, cô rất cám ơn em Thanh Trang đã giúp đỡ cô rất nhiều trong giai đoạn nghiên cứu ở lab Hóa Dược và đồng hành cùng cô tại phòng trọ thân yêu ở Sài Gòn. Cuối cùng, lời cám ơn đặc biệt nhất xin được gửi đến gia đình thân yêu của con. Cám ơn gia đình vì đã hỗ trợ không ngừng, động viên và luôn ở đó mỗi khi con cần, đã lắng nghe và cho con lời khuyên mỗi khi con gặp khó khăn. Gia đình mãi là điểm tựa tinh thần lớn nhất trong suốt cuộc đời con. Luận án này sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự hỗ trợ từ mọi người và các tổ chức liên quan. Một lời cám ơn hẳn là không đủ để bày tỏ lòng biết ơn và sự cám kích
iii của em/con. Một lần nữa xin được gửi lời cám ơn chân thành nhất đến tất cả Thầy Cô, gia đình, bạn bè và các bạn sinh viên khoa Dược. TP. Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2024 Tác giả Trần Thị Thúy Nga
iv LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Trần Thị Thúy Nga, là Nghiên cứu sinh chuyên ngành Dược lý – Dược lâm sàng, khóa 2019 – 2022, xin cam đoan: (1) Luận án là do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS. Lê Minh Trí; (2) Các tài liệu tham khảo được tôi xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng, trích dẫn và liệt kê tài liệu tham khảo đầy đủ; (3) Kết quả trình bày trong luận án được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của bản thân tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ đề tài cùng cấp nào khác. TP. Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2024 Người hướng dẫn Tác giả thực hiện Lê Minh Trí Trần Thị Thúy Nga
v MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN ...................................................................................................................i LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................................iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT ..................... viiii DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................. x DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... xiiii ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3 1.1. Interleukin-8 .............................................................................................................3 1.2. Nghiên cứu sàng lọc in silico .................................................................................13 1.3. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro ..................................................................21 1.4. Các nghiên cứu có liên quan đến đề tài ..................................................................28 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 34 2.1. Thiết kế nghiên cứu ................................................................................................34 2.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................35 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................36 2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................36 2.5. Phương pháp phân tích dữ liệu ...............................................................................53 Chương 3. KẾT QUẢ .................................................................................................. 54 3.1. Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vị trí hoạt động (orthosteric) ..........................................................................................54 3.2. Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trí dị lập thể (allosteric) ..................................................................................................73 3.3. Kết quả thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro ......................................................82 Chương 4. BÀN LUẬN ............................................................................................... 88 4.1. Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vị trí hoạt động (orthosteric) ..........................................................................................88 4.2. Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trí dị lập thể (allosteric) ................................................................................................105
vi 4.3. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro ................................................................109 KẾT LUẬN ................................................................................................................ 122 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 124 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 2D Two dimension Hai chiều 3D Three dimension Ba chiều Absorption, Distribution, Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải ADMET Metabolism, Excretion and trừ và độc tính Toxicity NEU Bạch cầu trung tính Thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy CADD Computer-aided drug design tính CCVKN Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm Chronic obstructive pulmonary COPD Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính disease CSDL Cơ sở dữ liệu Cryo-EM Cryo-electron microscopy Kính hiển vi điện tử đông lạnh CXCR1/2 Chemokine CXC receptor 1/2 Thụ thể chemokin CXCR1/2 DB Drugbank Ngân hàng thuốc DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid ECL Extracellular loop Vòng ngoại bào EF Enrichment factor Hệ số làm giàu EGFR Epidermal growth factor receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì Enzyme-linked immunosorbent Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên ELISA assay kết enzym ELR motif Glu-Leu-Arg motif Trình tự ba acid amin Glu-Leu-Arg Extracellular signal regulated ERK Kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào kinase
viii GH Goodness of hits Điểm số độ tốt của hit GPCR G protein coupled receptor Thụ thể liên kết với protein G HCPLNB Hợp chất phân lập nội bộ Half maximal inhibitory IC50 Nồng độ ức chế 50% hoạt tính concentration ICL Intracellular loop Vòng nội bào Phép đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng ITC Isothermal titration calorimetry nhiệt JNK Jun N-terminal kinase LBP Ligand-based pharmacophore Pharmacophore dựa trên phối tử LPS Lipopolysaccharide Mitogen Activated Protein MAPK Protein kinase hoạt hóa mitogen Kinase MDs Molecular Dynamics Simulation Mô phỏng động lực học phân tử Molecular mechanics Cơ học phân tử tổng quát hóa diện MM/GBSA Generalized Born surface area tích bề mặt Born) Molecular mechanics Poisson - Cơ học phân tử diện tích bề mặt MM/PBSA Boltzmann surface area Poisson – Boltzman 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- MTT 2,5-diphenyltetrazolium bromide Nicotinamide adenine NADH Dạng khử của NAD+ dinucleotide hydrogen Nicotinamide adenine NADPH Dạng khử của NADP+ dinucleotide phosphate hydrogen NCI National Cancer Institute Viện Ung thư quốc gia NET Neutrophil extracellular trap Bẫy ngoại bào bạch cầu trung tính
ix NEU Neutrophil Bạch cầu trung tính ns Nano second Nano giây OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate-Buffered Saline Đệm muối photphat PDB Protein data bank Ngân hàng dữ liệu protein P-gp Glycoprotein PI3K Phosphoinositide 3-kinase Protein-ligand interaction Dấu vân tay tương tác protein-phối PLIF fingerprint tử PPI Protein-protein interaction Tương tác protein-protein Căn bậc hai độ lệch trung bình bình RMSD Root mean square deviation phương Căn bậc hai độ dao động trung bình RMSF Root mean square fluctuation bình phương SBP Structure-based pharmacophore Pharmacophore dựa trên cấu trúc SPR Surface plasmon resonance Cộng hưởng plasmon bề mặt TBS Tế bào sống TMD Transmembrane domain Miền xuyên màng TMB 3,3′,5,5′ – tetramethylbenzidine TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u TPSA Topological polar surface area Diện tích bề mặt phân cực tôpô X-ray X-ray crystallography Tinh thể học tia X
x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các dạng biến thể tự nhiên của IL-8. ..............................................................3 Bảng 1.2. Dữ liệu cấu trúc protein IL-8/CXCR1/2 .........................................................5 Bảng 1.3. Tương tác giữa các acid amin của IL-8 và CXCR1/2 ở vị trí hoạt động ........7 Bảng 1.4. Vai trò của IL8-CXCR1/2 trong một số nhóm bệnh chính ...........................11 Bảng 1.5. Một số thuốc phân tử nhỏ ức chế CXCR1/2 allosteric trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng .............................................................................................12 Bảng 1.6. Một số nghiên cứu in silico với mục tiêu IL-8/CXCR1/2 ............................29 Bảng 1.7. Một số nghiên cứu in vitro đánh giá sự gắn kết ............................................31 Bảng 1.8. Một số nghiên cứu in vitro về tác động của IL-8 trên tế bào ung thư ..........33 Bảng 2.1. Phần mềm sử dụng trong nghiên cứu............................................................36 Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ..............................................................37 Bảng 2.3. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .......................................................38 Bảng 2.4. Thành phần hỗn hợp dung dịch trong giếng đo ............................................51 Bảng 3.1. Tóm tắt các mô hình docking phân tử trong nghiên cứu ..............................57 Bảng 3.2. Các thư viện hợp chất được dùng để sàng lọc ảo..........................................58 Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc qua các mô hình 3D-pharmacophore tìm chất gắn kết trên IL-8 ........................................................................................................................58 Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc qua các mô hình 3D-pharmacophore tìm chất gắn kết trên CXCR1/2 ...............................................................................................................59 Bảng 3.5. Các chất gắn kết trên CXCR2 có điểm số docking ≤ –20 kJ.mol-1 và sự tương tác ................................................................................................................65 Bảng 3.6. Kết quả dự đoán độc tính của các chất..........................................................72 Bảng 3.7. Kết quả đánh giá mô hình A .........................................................................74 Bảng 3.8. Kết quả đánh giá mô hình B..........................................................................74 Bảng 3.9. Kết quả “redocking” EBX vào vị trí gắn kết của CXCR2 ............................76 Bảng 3.10. Các chất gắn kết trên CXCR2 với điểm số docking và sự tương tác tốt hơn phối tử đồng kết tinh EBX ....................................................................................77
xi Bảng 3.11. Giá trị RMSF của các acid amin trong khoang gắn kết khi MDs phức hợp ba phối tử với CXCR2...........................................................................................78 Bảng 3.12. Dự đoán ADMET của EBX và hai chất tiềm năng .....................................80 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá ức chế tương tác IL-8/CXCR2 của các chất thử nghiệm tại nồng độ 100 μM ...............................................................................................82 Bảng 4.1. Một số nghiên cứu sàng lọc SMPPII sử dụng mô hình pharmacophore dựa trên PPI ...........................................................................................................90 Bảng 4.2. Nghiên cứu gắn kết docking phân tử trên mục tiêu IL-8 ..............................93 Bảng 4.3. Kết quả sàng lọc in silico ở nghiên cứu hiện tại và các nghiên cứu đã công bố ................................................................................................................107 Bảng 4.4. Các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế gắn kết .....................................111 Bảng 4.5. Các nghiên cứu về sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt do IL-8 kích thích .............................................................................................................112 Bảng 4.6. Các nghiên cứu về sự tăng sinh của một số dòng tế bào ung thư qua trung gian IL-8 ....................................................................................................113 Bảng 4.7. Hiệu quả ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt của một số dẫn xuất benzamid ...............................................................................................117 Bảng 4.8. Tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư của tectochrysin ........................119
xii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc tinh thể IL-8 monomer ......................................................................4 Hình 1.2. Minh họa cấu trúc CXCR1/2 trong phức IL-8/CXCR1/2/protein G ...............5 Hình 1.3. Minh họa vị trí tương tác giữa IL-8 với thụ thể CXCR1 (8IC0) và CXCR2 (6LFO) .....................................................................................................................6 Hình 1.4. Sự tương tác giữa IL-8 và kháng thể LY3041658 ...........................................8 Hình 1.5. Sự tương tác giữa CXCR2 và chất ức chế EBX ..............................................8 Hình 1.6. Con đường dẫn truyền tín hiệu của IL-8/CXCR1/2 ........................................9 Hình 1.7. Cơ sở docking bằng công cụ FlexX/ LeadIT ................................................16 Hình 1.8. Minh họa phương pháp đo lường sự gắn kết. (A) ITC và (B) SPR ..............22 Hình 1.9. Kit thử nghiệm gắn kết IL-8/CXCR1/2 của hãng RayBioTech® ..................25 Hình 1.10. Cấu trúc của MTT và sản phẩm có màu formazan......................................27 Hình 2.1. Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu sàng lọc dựa trên cấu trúc ....................................34 Hình 2.2. Minh họa giao diện PLIF trong phần mềm MOE 2015.10 ...........................40 Hình 2.3. Cấu trúc các chất ức chế CXCR2 vị trí allosteric .........................................41 Hình 2.4. Tóm tắt các bước tiến hành mô phỏng động lực học phân tử .......................45 Hình 2.5. Tóm tắt các bước tiến hành thử nghiệm ức chế tương tác ............................49 Hình 2.6. Tóm tắt thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư do IL-8 cám ứng .........................................................................................................52 Hình 3.1. Mô hình PhIL8-CXCR1 (A) và PhCXCR1-IL8 (B) .....................................54 Hình 3.2. Mô hình PhIL8-CXCR2 (A) và PhCXCR2-IL-8 (B) ....................................55 Hình 3.3. Mô hình PhIL8-LY3041658-S1 (A) và PhIL8-LY3041658-S2 (B) .............56 Hình 3.4. Mô hình docking phân tử (vùng màu xanh): (A) D-IL8-CXCR1/2 và (B) D-IL8-LY3041658 ..........................................................................................57 Hình 3.5. Mô hình docking phân tử (vùng màu xanh): (A) D-CXCR1-IL8 và (B) D-CXCR2-IL8 ................................................................................................57 Hình 3.6. Tỷ lệ chất dock thành công qua các mô hình gắn kết docking phân tử.........59 Hình 3.7. Sự phân bố chất dock thành công theo khoảng điểm số docking..................60 Hình 3.8. Sự tương tác của 4 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-CXCR1 ...................61
xiii Hình 3.9. Sự tương tác của 11 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-CXCR2 .................61 Hình 3.10. Sự tương tác của 4 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-LY3041658 ...........62 Hình 3.11. Phân tích PLIF các chất trong khoang gắn kết của IL−8 với CXCR1 (A), CXCR2 (B) và kháng thể LY3041658 (C) ...........................................................62 Hình 3.12. Phân tích PLIF các chất trong khoang gắn kết của CXCR1/2 ....................63 Hình 3.13. Sự tương tác của 19 chất tiềm năng trên khoang D-CXCR1-IL8 ...............64 Hình 3.14. RMSD của 19 phức hợp tiềm năng. ............................................................67 Hình 3.15. RMSF của protein tự do/phức hợp của các chất tiềm năng.........................68 Hình 3.16. Tỷ lệ liên kết hydro của các chất thuộc ngân hàng thuốc (DB) với acid amin của CXCR2 trong quá trình MDs 100ns ...............................................................69 Hình 3.17. Tỷ lệ liên kết hydro của các chất thuộc thư viện ZINC (A), HCPLNB (B) và CCVKN (C) với acid amin của CXCR2 trong quá trình MDs 100ns ..............70 Hình 3.18. Năng lượng gắn kết tự do của 19 chất trong phức hợp với CXCR2 ...........71 Hình 3.19. Biểu đồ “BOILED-Egg” của các chất phân tích .........................................72 Hình 3.20. Mô hình A ....................................................................................................73 Hình 3.21. Mô hình PhCXCR2-EBX và sự gióng hàng lên CXCR2 ............................75 Hình 3.22. Mô hình gắn kết docking phân tử D-CXCR2-EBX (A) và 10 cấu dạng redocking của EBX trong khoang gắn CXCR2 (B) ..............................................75 Hình 3.23. Kết quả gắn kết docking phân tử qua mô hình D-CXCR2-EBX ................76 Hình 3.24. Kết quả MDs của phức CXCR2/ZINC77105530 ........................................78 Hình 3.25. Kết quả MDs của phức CXCR2/ZINC93176465 ........................................79 Hình 3.26. Năng lượng gắn kết tự do của phức hợp CXCR2 và ZINC77105530, ZINC93176465, EBX............................................................................................79 Hình 3.27. Tóm tắt kết quả nghiên cứu sàng lọc in silico .............................................81 Hình 3.28. Hiệu quả ức chế tương tác IL-8/CXCR2 của ba chất tiềm năng theo nồng độ ..................................................................................................................83 Hình 3.29. Sự tăng sinh các dòng tế bào ung thư được cám ứng bởi IL-8 ...................84 Hình 3.30. Tác động của IL-8 100 ng/mLvà/hoặc các chất thử nghiệm tại nồng độ 100 µM lên sự sống sót tế bào LNCaP .................................................................85
xiv Hình 3.31. Tỷ lệ tế bào sống do tác động IL-8 và 6 chất thử nghiệm theo nồng độ .....86 Hình 3.32. Tỷ lệ tế bào sống do tác động của 6 chất thử nghiệm theo nồng độ ...........87 Hình 4.1. RMSD của các phức hợp CXCR2 với DB07754, ZINC1251190, acid usnic và cefixim ..............................................................................................................97 Hình 4.2. Minh họa vị trí các phối tử trong khoang gắn kết CXCR2 ở thời điểm 0 ns (xanh lá), 50 ns (cam) và 100 ns (xanh dương). (A) DB07754, (B) ZINC1251190, (C) acid usnic và (D) cefixim ................................................................................97 Hình 4.3. Các nhóm cấu trúc của 6 hợp chất tiềm năng tham gia tương tác với acid amin quan trọng của CXCR2 trong quá trình MDs ............................................100 Hình 4.4. Sự tương tác của bốn phối tử đại diện cho 4 thư viện chất tại khoang gắn kết CXCR2 trong quá trình gắn kết docking phân tử (A) và MDs 100 ns (B) .........101 Hình 4.5. Nhóm cấu trúc có khả năng gây độc tính (in đậm) của ZINC0220077 và DB15327 .............................................................................................................104 Hình 4.6. (A) Tương tác giữa CXCR2 và EBX1. (B) Sự gióng hàng EBX1 (xanh lá), ZINC77105530 (cam) và ZINC93176465 (xanh dương) lên mô hình pharmacophore PhCXCR2-EBX ........................................................................106 Hình 4.7. Cấu trúc 2D của ZINC77105530 (A1), ZINC93176465 (A2) và sự hình thành tương tác của hai phối tử trong docking phân tử (B1,B2) và MDs (C1,C2) .............................................................................................................................108 Hình 4.8. Năng lượng gắn kết mỗi acid amin của CXCR2 với hai chất tiềm năng ....109 Hình 4.9. Minh họa vị trí của ba chất tiềm năng và ELR motif của IL-8 trong khoang CXCR2 từ kết quả docking phân tử ....................................................................110
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Interleukin (IL)-8, thuộc họ chemokin, là yếu tố tiền viêm đóng vai trò then chốt trong việc kích hoạt bạch cầu trung tính và liên quan đến các bệnh lý viêm như bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), hen phế quản, vẩy nến hoặc viêm khớp dạng thấp.1 Nhiều bằng chứng cũng cho thấy IL-8 thúc đẩy sự hình thành mạch, tăng sinh, di chuyển, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư phổi, vú, ruột kết, bàng quang, tuyến tiền liệt, gan, tử cung hay một dòng tế bào khối u khác.2,3 Vai trò IL-8 được thể hiện qua sự gắn kết với hai thụ thể kết hợp protein G (GPCR), là CXCR1 và CXCR2, tại vị trí hoạt động (orthosteric) ở ngoại bào. Bên cạnh đó, một vùng gắn kết dị lập thể nội bào (allosteric) cũng đã được phát hiện trong cấu trúc thực nghiệm của các phức hợp phối tử và GPCR.1,4-6 Các chất tác động ở vị trí allosteric nội bào có thể điều chỉnh chức năng của thụ thể dẫn đến ảnh hưởng tới sự liên kết của phối tử nội sinh (IL-8) và GPCR (CXCR1/2).5 Do đó, tìm kiếm các chất gắn kết vào vị trí orthosteric hoặc allosteric, ngăn chặn tương tác IL-8/CXCR1/2, có thể là các chiến lược phát triển thuốc hiệu quả để phát hiện liệu pháp mới trong điều trị các bệnh lý kể trên. Trong hai thập kỷ qua, một số kháng thể đơn dòng (ABX-IL8, HuMax IL-8), thuốc có nguồn gốc peptid (CXCL8 K11R G31P), acid nuleic (miR-155, miR-708) với đích tác động là IL-8/CXCR1/2 đã được nghiên cứu.5,7 Những liệu pháp sinh học này cho thấy điểm yếu không thể tránh khỏi như nguy cơ nhiễm khuẩn, chi phí cao và yêu cầu tiêm tĩnh mạch.8 Ngược lại, chất ức chế phân tử nhỏ với ưu điểm rẻ hơn và có thể được dùng bằng đường uống, các chất đối kháng phân tử nhỏ thụ thể CXCR1/2 (AZD5069, danirixin, elubrixin, navarixin, SX-682 hay reparixin) đã được khám phá và thử nghiệm lâm sàng.3-5,7,9 Tuy nhiên, những chất này đều tác động trên thụ thể tại vị trí allosteric và chưa có thuốc nào được phê duyệt điều trị hoặc một số thuốc đã thất bại trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng vì hiệu quả thấp (elubrixin hay danirixin trên bệnh nhân COPD, viêm ruột hay xơ nang) hoặc đặc tính dược động học kém (SX-56).5,10 Các nghiên cứu với cách tiếp cận dựa trên phối tử tại vị trí allosteric của nhóm tác giả Madea,11 Ha,12 Thái Khắc Minh13 hoặc Lê Minh Trí và cộng sự14 đã sử dụng mô hình tương đồng CXCR2 và thực hiện docking phân tử bằng cách dự đoán khoang gắn kết
2 trên thụ thể hay nghiên cứu in silico của nhóm tác giả Boraek15 tiến hành docking mù trên toàn bộ IL-8. Theo đó, kết quả thu được ở những nghiên cứu trên cho thấy các ứng viên tiềm năng có cách thức tương tác khác nhau với CXCR211,12 hoặc tiềm năng gắn kết yếu trên IL-8.15 Hơn nữa, cho đến nay chưa có phân tử nhỏ ức chế IL-8/CXCR1/2 tại vị trí orthosteric được nghiên cứu và công bố với lý do chính đến từ việc thiếu cấu trúc thực nghiệm và thông tin tương tác trong phức hợp IL-8 và thụ thể tại vị trí này.4,6 Hiện nay, thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (CADD) hay còn gọi phương pháp in silico là công cụ hỗ trợ đắc lực, góp phần đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc một cách hiệu quả hơn về chi phí cũng như giảm thiểu thất bại trong các giai đoạn thử nghiệm cuối.16 Trong CADD, thông tin cấu trúc protein là yếu tố cần thiết, đồng thời tỷ lệ sàng lọc các chất tiềm năng cao với ái lực gắn kết tốt đạt được khi xác định vị trí tương tác protein-protein (PPI).4 Đáng chú ý, các cấu trúc phức hợp của IL-8 và CXCR1/2 được công bố (2020-2023) bằng các phương pháp hiện đại như tinh thể học tia X (X-ray) hoặc kính hiển vi điện tử đông lạnh (cryo-EM)6,17,18, là những cấu trúc có độ chính xác cao hơn so với mô hình tương đồng sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước.11-14 Đồng thời, với các cấu trúc mới này, PPI tại những acid amin quan trọng (hot-spot/key residue) được xác định thông qua nghiên cứu thực nghiệm đột biến điểm.6,17,18 Đây là cơ sở cho nghiên cứu in silico dựa trên cấu trúc để sàng lọc các phân tử nhỏ tiềm năng ức chế IL-8/CXCR1/2 trước khi đưa vào thử nghiệm in vitro. Do vậy, đề tài “Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu: 1. Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vị trí hoạt động (orthosteric). 2. Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trí dị lập thể (allosteric). 3. Đánh giá khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR2 và ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL-8 của các chất tiềm năng bằng thử nghiệm in vitro.
3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Interleukin-8 Năm 1987-1988, một yếu tố hóa ứng động bạch cầu đặc biệt đã được tinh chế từ môi trường bạch cầu đơn nhân khi kích thích bằng lipopolysacarid (LPS) và sau đó được gọi là CXCL8 hay interleukin (IL)-8.3,5,6,9 IL-8 thuộc nhóm chemokin, là một họ cytokin lớn có cấu trúc polypeptid 6 – 14 kDa, được biết đến với vai trò quan trọng trong bệnh lý ung thư và điều hòa sự ổn định của các tế bào miễn dịch. IL-8 ít hoặc hầu như không biểu hiện trong điều kiện sinh lý bình thường hoặc bởi các tế bào không ung thư (non- cancerous cells).19,20 Tuy nhiên, IL-8 có thể được giải phóng từ bạch cầu và các loại tế bào khác để đáp ứng với nhiều kích thích hay tín hiệu khác nhau. Đó là các kích thích gây viêm nội sinh hoặc ngoại sinh (LPS, IL-1, TNF-α hay vi khuẩn, virus), tín hiệu stress do môi trường, hóa chất, hoặc tín hiệu do hormon gây ra (như estrogen và androgen).3,20 Bên cạnh đó, nhiều tế bào khối u bao gồm vú, cổ tử cung, phổi, đại tràng, dạ dày, tuyến tiền liệt hay buồng trứng, đã được chứng minh có biểu hiện rõ rệt chemokin này.9,20 1.1.1. Cấu trúc của interleukin-8 và thụ thể 1.1.1.1. Cấu trúc của interleukin-8 IL-8 lần đầu tiên được tổng hợp dưới dạng protein ban đầu có 99 acid amin và sau khi cắt chuỗi tín hiệu (peptid signal) 22 acid amin tạo ra dạng trưởng thành, thường được kí hiệu là IL-8(1-77). Quá trình xử lý ngoại bào bằng cách cắt đầu N thu được nhiều biến thể (Bảng 1.1), trong đó biến thể IL-8(6-77) là dạng phổ biến nhất với 72 acid amin và trọng lượng phân tử 8,383 kDa.21,22 Việc loại bỏ 5-8 acid amin làm tăng đáng kể hoạt tính của IL-8, có thể gấp 30 lần so với IL-8(1-77).3 Bảng 1.1. Các dạng biến thể tự nhiên của IL-8. Các dạng tự nhiên của IL-8 Hoạt tính sinh học so sánh với IL-8 (1-77) IL-8 (2-77) Xấp xỉ IL-8 (3-77) Xấp xỉ IL-8 (6-77) Mạnh hơn IL-8 (7-77) Mạnh hơn IL-8 (8-77) Mạnh hơn IL-8 (9-77) Mạnh hơn
4 IL-8 có thể tồn tại thuận nghịch dưới dạng monomer hoặc dimer. Cấu trúc monomer của IL-8 như mô tả ở Hình 1.1 (minh họa từ mã PDB 4XDX, độ phân giải 0,95 Å) với một chuỗi ngắn, hình dạng linh động ở đầu N, ba sợi β đối song song (β1,2,3-strands) nối với nhau bởi các vòng 30s, 40s, 50s và một chuỗi xoắn α (α-helix) kéo dài từ phân tử acid amin thứ 57 đến đầu C. Cấu trúc ổn định bởi cầu nối disulfid được hình thành bởi Cys7-Cys34 và Cys9-Cys50. Hai acid amin cystein (Cys7 và Cys9) được phân tách bằng Gln8.9,21-23 Trình tự ba acid amin là Glu4-Leu5-Arg6 (mô típ ELR) được chứng minh có vai trò rất quan trọng trong việc tương tác với các thụ thể.3 Hình 1.1. Cấu trúc tinh thể IL-8 monomer 1.1.1.2. Cấu trúc thụ thể của interleukin-8 CXCR1 và CXCR2 là thụ thể của IL-8, thuộc họ thụ thể liên kết với protein G (GPCR), chứa bảy vòng xoắn alpha, mỗi vòng kéo dài theo độ dày lớp phospholipid kép của màng tế bào như minh họa ở Hình 1.2 với mã PDB 8IC0 (IL-8/CXCR1)18 và 6LFO (IL-8/CXCR2).6 CXCR1 và CXCR2 là các protein gồm lần lượt 350 và 360 acid amin, cấu trúc giống nhau 76% và hiệu lực liên kết với IL-8 cũng tương tự nhau (Kd ≈ 4 nM). Điểm khác biệt lớn giữa hai thụ thể này là ở vòng ngoại bào thứ 2 và CXCR2 có thể tương tác với các ELR chemokin khác (CXCL1-3, CXCL5-7) với ái lực cao hơn CXCR1. Cấu trúc của các thụ thể CXCR1/2 gồm bảy miền xuyên màng (TMD), ba vòng ngoại bào (ECL1-3) và ba vòng nội bào (ICL1-3). Đầu N gồm miền xuyên màng 4