Luận án Tiến sĩ Hóa sinh học: Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam

Chia sẻ: Minh Tú | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

14
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm xác định được thành phần hóa học của ba loài san hô mềm S. nanolobata, S. conferta, S. leptoclados thu thập ở vùng biển Trung bộ Việt Nam; phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có trong các loài san hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các nghiên cứu y sinh dược học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa sinh học: Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Ninh Thị Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ BA LOÀI SAN HÔ MỀM SINULARIA NANOLOBATA, SINULARIA LEPTOCLADOS, SINULARIA CONFERTA THU THẬP Ở VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9.42.01.16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021
Công trình được hoàn thành tại: - Học Viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh biển Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Nguyễn Hoài Nam Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Trần Mỹ Linh Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Đình Thắng Phản biện 2: PGS. TS. Trần Thu Hương Phản biện 3: TS. Bùi Thị Thúy Luyện Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ , ngày tháng năm 2021 . Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học
1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nhiều quốc gia đã khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển nhằm phục vụ các nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc chữa trị bệnh hiểm nghèo như: ung thư, viêm gan, các bệnh về viêm nhiễm và do virus gây ra. Cho đến thời điểm này đã có một số dược phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biển đến được tay người sử dụng, điển hình như Cytarabine, Vidarabine, Eribulin, Trabectedin…Để có được thành quả này, các viện nghiên cứu trên thế giới đã sàng lọc hoạt tính sinh học của hàng triệu hợp chất từ các loài sinh vật biển, đồng thời đầu tư nguồn lực tài chính và thời gian cho các giai đoạn nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đối với các hợp chất tiềm năng. Với lợi thế sở hữu đường bờ biển dài trên 3.260 km cùng với rất nhiều đảo và vịnh, Việt Nam có tiềm năng lớn lao trong việc khai thác với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú cả về thành phần loài và trữ lượng. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất giá trị từ sinh vật biển Việt Nam hiện còn chưa nhiều và hạn chế ở bước thử nghiệm hoạt tính in vivo và nghiên cứu về cơ chế tương tác giữa thuốc và tế bào ung thư. Các nghiên cứu hiện đang ở giai đoạn đầu so với các nuớc trong khu vực và lùi xa so với các nước tiên tiến. Nguyên nhân là do còn một số khó khăn như: việc khảo sát và thu thập mẫu sinh vật ở biển yêu cầu trang thiết bị hiện đại, các hợp chất phân lập được từ sinh vật biển thường có hàm lượng rất nhỏ, cấu trúc phức tạp, một số hợp chất dễ phân hủy ngay trong quá trình phân tích. Do đó, yêu cầu cấp thiết đối với nước ta là cần phát triển nghiên cứu nhằm từng bước hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của những loài sinh vật biển.
2 Chi Sinularia là một trong các chi san hô mềm được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học của nhiều hợp chất phân lập từ các đối tượng san hô mềm thuộc chi này. Tuy nhiên, các nghiên cứu đối với các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia như S. nanolobata, S. leptoclados, S. conferta ở Việt Nam rất ít và hầu như chưa có nghiên cứu một cách hệ thống và bài bản về các loài nêu trên. Xuất phát từ thực tế trên, tôi đã lựa chọn đề tài luận án “Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam”. Mục tiêu của luận án: - Xác định được thành phần hóa học của ba loài san hô mềm S. nanolobata, S. conferta, S. leptoclados thu thập ở vùng biển Trung bộ Việt Nam. - Phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có trong các loài san hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các nghiên cứu y sinh dược học. Nội dung luận án bao gồm: 1. Xác định tên khoa học của ba loài san hô mềm thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam bằng chỉ thị phân tử 2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ ba loài san hô mềm S. nanolobata, S. conferta, S. leptoclados. 3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được. 4. Đánh giá cơ chế gây độc tế bào của một số hợp chất tiêu biểu.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Bao gồm phần tổng quan về các nghiên cứu trong nước và quốc tế về việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thu, nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư, đặc điểm chung của san hô mềm và chi Sinularia, về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của san hô mềm chi Sinularia 1.1. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 1.1.1. Các dòng tế bào ung thư 1.1.2. Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống ung thư 1.1.3. Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên apoptosis 1.1.4. Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan đến chu kỳ tế bào 1.2. Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thư 1.2.1. Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ sinh vật biển 1.2.2. Tình hình nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính chống ung thư từ san hô mềm của Việt Nam 1.3. Giới thiệu chung về san hô mềm 1.3.1. Đặc điểm của san hô mềm 1.3.2. Tổng quan về san hô mềm chi Sinularia 1.3.3. Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại san hô mềm 1.3.4. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia Thống kê các nghiên cứu đã công bố cho thấy các hợp chất phân lập từ san hô mềm chi Sinularia chủ yếu bao gồm các hợp chất sesquiterpen, diterpen và steroid. Nhiều hợp chất trong số này thể hiện hoạt tính sinh học thú vị như hoạt tính gây độc tế bào, kháng
4 viêm, kháng khuẩn, kháng vi rút, bảo vệ thần kinh và chống oxy hóa… CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu san hô mềm S. nanolobata Verseveldt, 1977 được thu thập ở vùng biển Lăng Cô, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng 4 năm 2015. Mẫu san hô mềm S. leptoclados Ehrenberg, 1834 được thu thập ở vùng biển quanh đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam vào tháng 5 năm 2016. Mẫu san hô mềm loài S. conferta Dana, 1846 được thu thập ở vùng biển quanh đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam vào tháng 5 năm 2015. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Xác định tên khoa học của các mẫu san hô mềm bằng các chỉ thị phân tử (msh1 và 28S RNA) 2.2.1.2. Khuyếch đại và xác định trình tự các đoạn ADN chỉ thị Hình 2.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn các M SN SLE SCO M SN SLE SCO đoạn gen chỉ thị từ các mẫu san hô mềm nghiên cứu. (A) đoạn gen 28S rARN sử dụng cặp mồi 28SF và 28SR. (B) đoạn gen msh1 sử dụng cặp mồi MSHF và MSHR. M: A B GeneRulerTM 1kb ADN ladder
5 M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18 19 20 21 Hình 2.6. Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau khi biến nạp vector pTZ57R/T gắn gen 28S rARN của các mẫu san hô mềm SN (giếng số 1- 7), SLE (giếng số 8-14), SCO (giếng số 15-21). M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder M 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 M 35 36 37 38 39 40 41 42 Hình 2.7. Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau khi biến nạp vector pTZ57R/T gắn gen msh1 của các mẫu san hô mềm SN (giếng số 22-28), SLE (giếng số 29-35), SCO (giếng số 36-42). M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder 2.2.1.3. Xác định loài và phân tích đa dạng di truyền 2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.2.1. Phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. nanolobata Hình 2.8. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài S. nanolobata
6 2.2.1.2. Phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. leptoclados Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài S. leptoclados 2.2.1.2. Phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. conferta Hình 2.10. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài S. conferta
7 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào ung thư CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Xác định loài bằng chỉ thị phân tử 3.1.1. Giải trình tự tự đoạn gen 28S rARN và msh1 của 3 mẫu san hô mềm - Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của mẫu SN với độ dài 639 bp, bao gồm 190 A, 113 C, 121 G, 215 T - Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của mẫu SLE với độ dài 639 bp, bao gồm 189 A, 113 C, 119 G, 218 T - Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của mẫu SCO với độ dài 639 bp, bao gồm 189 A, 113 C, 122 G, 215 T - Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN của mẫu SN với độ dài 695 bp, bao gồm 139 A, 194 C, 228 G, 134 T - Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN của mẫu SLE với độ dài 709 bp, bao gồm 145 A, 197 C, 231 G, 136 T - Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN của mẫu SCO với độ dài 709 bp, bao gồm 144 A, 199 C, 228 G, 138 T 3.1.2. So sánh trình tự của 3 mẫu san hô mềm bằng chương trình BLAST Kết quả phân tích trình tự đoạn gen msh1 và 28S rARN của các mẫu nghiên cứu với các các trình tự tham khảo trên ngân hàng gen quốc tế NCBI đã cho thấy các trình tự của gen chỉ thị của các mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao với các trình tự tương ứng trên ngân hàng gen, cụ thể:
8 - Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SN có độ tương đồng 100% so với trình tự tương ứng (mã số FJ621451.1) của mẫu S. nanolobata vourcher RMNH coel.38441 trên ngân hàng gen NCBI. - Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SLE có độ tương đồng 100% so với trình tự tương ứng (mã số KC542857.1) của mẫu S. leptoclados vourcher ZMTAU:CO35308 trên ngân hàng gen NCBI. - Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SCO có độ tương đồng 100% so với trình tự tương ứng (mã số FJ621389.1) của mẫu S. conferta vourcher NTM C13972 trên ngân hàng gen NCBI. - Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SN có độ tương đồng 99,8% so với trình tự tương ứng (mã số KF915519.1) của mẫu Sinularia sp. voucher RMNH:Coel.41326 trên ngân hàng gen NCBI. - Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SLE có độ tương đồng 100% so với trình tự tương ứng (mã số KC542837.1) của mẫu S. leptoclados voucher ZMTAU:CO34095 trên ngân hàng gen NCBI. - Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SCO có độ tương đồng 99,6% so với trình tự tương ứng (mã số MF817932.1) của mẫu Sinularia sp. trên ngân hàng gen NCBI. Bảng 3.1. Kết quả phân loại các mẫu san hô mềm nghiên cứu dựa vào phân tích độ tương đồng (%) trình tự các đoạn ADN chỉ thị (gen 28S rARN và msh1) của các mẫu nghiên cứu với các trình tự tham khảo trên ngân hàng gen. Chỉ thị msh1 Chỉ thị 28S rARN Kết luận Ký chung dựa hiệu độ độ theo 2 chỉ mẫu Loài tương Loài tương thị ADN đồng đồng Sinularia Sinularia SN 100% Sinularia sp. ≥ 99.8% nanolobata nanolobata Sinularia Sinularia Sinularia SLE 100% 100% leptoclados leptoclados leptoclados Sinularia Sinularia SCO 100% Sinularia sp. ≥ 99.6% conferta conferta
9 3.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. nanolobata 28 21 22 24 26 18 20 23 25 12 29 27 13 17 19 11 H 16 OH 9 14 15 1 2 10 8 5 H H 3 7 4 6 HO Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài S. nanolobata 3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. leptoclados Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài S. leptoclados
10 3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. conferta 28 21 22 24 26 18 25 20 23 12 27 13 17 19 11 16 9 14 1 10 8 3 5 6 HO OH Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài S. conferta 3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ các mẫu san hô mềm 3.3.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S. nanolobata Bảng 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SN IC50 (µM) Mẫu thử SK- MCF- SK- KB HepG2 LNCaP HL-60 SW480 LU-1 7 Mel-2 89,02± SN 4 - - - - - - - 9,93 64,35± 33,53± 71,02± SN 6 - - - - - 7,00 4,25 4,00 SN 30 - - - - - - - - 1,26± 2,07± 1,95± 2,36± 2,07± 1,46± 1,91± 2,24± Elipticine* 0,20 0,33 0,28 0,24 0,28 0,20 0,37 0,16 *: Đối chứng dương; “-“: Không có hoạt tính
11 Kết quả đánh giá 10 hợp chất SN cho thấy: Hợp chất mới SN 6 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình trên dòng 3 tế bào HL-60, HepG2 và SW480 (IC50 từ 33.53-71.02 µM). Hợp chất SN 4 thể hiện hoạt tính gây độc yếu trên dòng tế bào HL-60. Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính. 3.3.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S. leptoclados Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SLE IC50 (µM) Mẫu thử SK- SW- SK- KB HepG2 MCF-7 HL-60 LNCaP LU-1 480 Mel-2 34,95± 21,13± 38,92± 51,80± 62,07± 28,65± 59,35± 64,12± SLE 10 4,21 0,70 6,26 31,22 10,88 1,53 4,23 1,71 92,96± 83,84 89,80± SLE 20 - - - - - 8,29 ±3,72 3,34 19,03± 21,79± 17,29± 21,21± 13,45± 14,4± 29,01± 17,13± SLE 27 2,92 2,20 1,91 1,47 1,81 1,88 3,21 1,81 32,86± 39,54± 36,97± 49,13± 20,53± 26,6± 33,87± 40,55± SLE 28 3,46 4,90 2,24 4,74 2,26 1,59 3,82 3,63 82,80 72,32 SLE 30 - - - - - - ± 3,65 ± 1,30 Elliptici 1,79± 1,38± 1,34± 1,26± 1,91± 2,03± 1,91± 1,95± ne* 0,28 0,28 0,16 0,28 0,12 0,16 0,20 0,20 *: Đối chứng dương;” -“: Không có hoạt tính Kết quả đánh giá 15 hợp chất SLE cho thấy: 3 hợp chất SLE 10, SLE 27 và SLE 28 (IC50 trong khoảng từ 1,78 đến 78,33 µM) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Hợp chất SLE 20 và SLE 30 thể hiện hoạt tính trên 2-3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính. 3.3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S. conferta Kết quả đánh giá 12 hợp chất SCO cho thấy hợp chất SCO 27, SCO 35 và SCO 37 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên cả
12 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính. Bảng 3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SCO IC50 (µM) Mẫu thử A-549 Hela PANC-1 SCO 27 3,64±0,18 19,34±0,42 1,78±0,69 SCO 35 78,73±2,11 30,5±0,77 9,35±0,37 SCO 37 27,12±1,69 24,64±1,28 20,51±2,72 Etoposide * 27,99±2,01 1,17±0,42 Camptothecin* 12,65±1,01 *: Đối chứng dương; 3.3.4. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE 27 và và hợp chất SCO 27 3.3.4.1. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SCO27 trên tế bào ung thư phổi A549 a. Đánh giá tác động của SCO 27 đến sự thay đổi hình thái tế bào ung thư Hình 3.5. Hình thái tế bào A549 dưới tác động của SCO 27 ở các nồng độ khác nhau và đối chứng dương (camptothecin 5 µM). Mũi tên chỉ các tế bào ở trạng thái apoptosis b. Đánh giá khả năng kích thích sản sinh enzym caspase 3 của SCO27
13 Hình 3.6. Khả năng kích thích sản sinh caspase 3 của SCO 27. sco-10 µM; sco-5 µM và sco-2,5 µM: các mẫu phân tích được bổ sung SCO 27 ở các nồng độ tương ứng. Đối chứng: mẫu phân tích không được bổ sung hợp chất SCO 27. Camptothecin: mẫu phân tích được bổ sung camptothecin c. Xác định khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư phổi A549 của SCO 27 Bảng 3.2. Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SCO 27 trên dòng tế bào ung thư phổi A549 Tỉ lệ tế Tỉ lệ tế bào Tỉ lệ tế bào Tỉ lệ tế Mẫu thử bào sống apoptosis apoptosis bào hoại (%) sớm (%) muộn (%) tử (%) Control 89,08 3,89 5,18 1,85 SCO 27 - 5 µM 88,50 4,90 5,72 0,88 SCO 27 - 10 µM 83,33 4,76 8,93 2,99 Camptothecin- 79,17 15,49 1,57 3,77 5µM A B Hình 3.7. Tác động của SCO 27 đến quá trình apoptosis tế bào A549 ở thời điểm 24h tại các nồng độ khác nhau 5 µM (C), 10 µM C D (D), đối chứng âm (A) và đối chứng dương (B) sử dụng phương pháp nhuộm Annexin V/P
14 3.3.4.2. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE 27 trên tế bào ung thư vú MCF-7 a. Đánh gá tác động của hợp chất SLE 27 lên sự thay đổi hình thái tế bào ung thư Hình 3.8. Tác động của hợp chất SLE 27 ở nồng độ 10, 30 và 100 µM lên hình thái tế bào ung thư vú MCF-7. Mũi tên chỉ các tế bào ở trạng thái apoptosis. b. Xác định khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung Độ thưphóng vú MCF-7 đại 10X và của hợp chất SLE 27 20X. Control: đối Bảng 3.3. Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SLEchứng 27 trên dòng âm – Tế bào tế bào ung thư vú MCF-7 MCF-7 không bổ sung Tỉ lệ tế Tỉ lệ tế bào Tỉ lệ tế bào Tỉ lệ tế Mẫu thử bào sống apoptosis hợp chất SLE apoptosis bào 27 hoại (%) sớm (%) muộn (%) tử (%) Control 97,08 0,67 1,93 0,32 SLE 27-10 µM 97,39 1,15 1,28 019 SLE 27-30 µM 86,08 1,72 7,16 5,04 SLE 27-100 µM 39,10 3,71 23,02 34,16 c. Đánh giá tác động của hợp chất SLE 27 đến chu kì tế bào ung thư vú MCF-7 Bảng 3.4. Tỉ lệ (%) tế bào MCF-7 trong pha G0/G1, S, G2/M và apoptosis (sub-G1) sau 48 giờ xử lí với hợp chất SLE 27 Mẫu thử Tỉ lệ tế bào ở các pha của chu trình phân bào (%) Pha sub-G1 Pha G0/G1 Pha S Pha G2/M Control 0,54 41,21 41,22 14,81 SLE 27 - 10 µM 0,23 36,57 33,41 17,78 SLE 27 - 30 µM 0,76 40,59 27,19 15,86 SLE 27- 100 µM 10,24 66,08 15,96 4,42
15 Hình 3.10. Ảnh hưởng của hợp chất SLE 27 (nồng độ 10; 30; 100 µM) đến chu kì tế bào MCF-7 ở thời điểm 48h, sử dụng hệ thống Flow cytometer Novocyte CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Xác định loài của các mẫu san hô mềm dựa vào các trình tự DNA chỉ thị Sau khi tách dòng và giải trình tự của các đoạn gen chỉ thị từ 3 mẫu san hô mềm, các trình tự DNA của Sinularia leptoclados (MW077896, MW077906); Sinularia conferta (MW077897, MW077907) và Sinularia nanolobata (MW077898, MW077908) đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI
16 Sinularia-abruptaMF817864 48 Sinularia-slieringsiMH516803 47 Sinularia-penghuensisJX991181 Sinularia-molestaJX991172 30 Sinularia-abrubtaFJ621374 Sinularia-abruptaJX991168 37 Sinularia-leptocladosKC542857 66 SLE 46 Sinularia-compactaFJ621384 Sinularia-bisulcaFJ621378 99 Sinularia-acutaFJ621375 46 Sinularia-verseveldtiKC542859 Sinularia-robustaFJ621473 Sinularia-diffusaFJ621399 Sinularia-sp.KF915757 64 Sinularia-abhishiktaeFJ621373 50 Sinularia-tumulosaFJ621482 Sinularia-siaesensisFJ621478 Sinularia-polydactylaKU230374 90 Sinularia-confertaFJ621389 99 43 SCO Sinularia-peculiarisJX023274 64 Sinularia-ornataJX991173 65 Sinularia-nanolobataFJ621451 90 SN Sinularia-brassicaKF915724 0.01 Hình 4.1. Kết quả phân tích chủng loại theo phương pháp NJ (Neighbor- Joining) trên MEGA6 của các mẫu san hô mềm dựa vào đa hình trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của các mẫu nghiên cứu và các mẫu san hô mềm liên quan trên ngân hàng gen NCBI. Các số đầu nhánh cây chủng loại là giá trị Bootdtrap thể hiện độ tin cậy phân nhánh di truyền các trình tự và nhóm trình tự Phân tích chủng loại dựa trên 3 trình tự đoạn gen msh1 nghiên cứu và 23 trình tự tham khảo trên NCBI. Kết quả trên hình 4.1 cho thấy mẫu SLE có quan hệ di truyền tương đồng cao với loài đã được công bố trình tự trên ngân hàng gene quốc tế đó là Sinularia leptoclados KC542857 (bootstrap 66%). Mẫu SCO có quan hệ di truyền tương đồng cao với loài S. conferta FJ621389 (bootstrap 90%). Mẫu SN có quan hệ di truyền tương đồng cao với các loài S. nanolobata FJ62621451 (bootstrap 90%). Tương tự như thế, phân tích phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN được thực hiện trên 3 trình tự nghiên cứu và 21 trình tự tham khảo trên NCBI. Kết quả cho thấy mẫu SLE
17 có quan hệ di truyền tương đồng cao với các loài đã được công bố trình tự trên ngân hàng gene thế giới đó là S. leptoclados KC542857, S. leptoclados MF817912, S.densa KC542829, S. abrupta KC542822, S.australiensis KC542825, Sinularia sp. MF817932 (bootstrap 100 %). Mẫu SCO có quan hệ di truyền tương đồng cao với các loài đó là S. bisulca KC542826, S. slieringsi MK333594, S. penghuensis KC542842, S. robusta KC542843, S. verseveldti KC542845, S. eilatesis KC542832, S. corpulentissima KC542827, S. maxima KC542839 (bootstrap 100%). Mẫu SN có quan hệ di truyền tương đồng cao với các loài Sinularia sp. KC915519 và S. polydactila KF915515 (bootstrap 98%). Như vậy, tổng hợp các kết quả so sánh trình tự các đoạn gen chỉ thị msh1 và 28S của 3 mẫu san hô mềm được trình bày ở Bảng 3.1. Mẫu SN được xác định thuộc loài S. nanolobata, mẫu SLE được xác định thuộc loài S. leptoclados, mẫu SCO được xác định thuộc loài S. conferta. Kết quả này cũng hoàn toàn tương đồng với kết quả xác định loài dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái các mẫu san hô mềm nghiên cứu do GS.TS Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên môi trường biển thực hiện. Điều này đã góp phần khẳng định vai trò hỗ trợ hiệu quả của các chỉ thị phân tử trong công tác phân loại đối với một số nhóm sinh vật biển như san hô mềm. 4.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài S. nanolobata Từ loài san hô mềm S. nanolobata đã phân lập được 10 hợp chất. Trong đó bao gồm: 4 hợp chất mới được đặt tên là: 24(S),28- epoxyergost-5-ene-3β,4α-diol (SN 6), 3β,4α-dihydroxyergosta- 5,24(28)-diene (SN 8), nanolobatol B (SN 20), nanolobatol A (SN 30) và 6 hợp chất đã biết: 16α-Hydroxysarcosterol (SN 3),
18 sarcophytosterol (SN 4), sinularianin B (SN 10), sinularianin D (SN 11), Cholesta-5,24(28)-dien-3β-ol-7-one (SN 16), dissesterol (SN 17). Các hợp chất phân lập được có cấu trúc thuộc lớp chất sterol và sesquiterpen 4.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài S. leptoclados Từ loài san hô mềm S. leptoclados đã phân lập và xác định cấu trúc của 15 hợp chất: tất cả 15 hợp chất đều thuộc lớp chất sterol, trong đó có 2 hợp chất mới được đặt tên là: Leptosteroid (SLE 10), 5β,6β-epoxygorgosterol (SLE 21) và 13 hợp chất đã biết: sarcophytosterol (SLE 13), Ergosta-24(28)-en-3β-ol (SLE 19), Ergosta-5,22,24(28)-trien-3β-ol (SLE 20), 3β,4α-Dihydroxyergosta- 5,24(28)-die (SLE 22), Ergosta-5,24(28)-dien-3β-ol-7-one (SLE 23), 7-oxogorgosterol (SLE 25), Ergosta-5-en-3β-ol-7-one (SLE 26), Ergosta-5,24(28)-dien-3β,7β-diol (SLE 27), Ergosta-5-en-3β,7β-diol (SLE 28), 7β-hydroxygorgosterol (SLE 29), Ergosta-5,24(28)-dien- 3β,7α-diol (SLE 30), Ergosta-5-en-3β,7α-diol (SLE 31), 7α- hydroxygorgosterol (SLE 32). 4.4. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài S. conferta Từ loài san hô mềm S. conferta đã phân lập và xác định cấu trúc của 12 hợp chất: tất cả 12 hợp chất đều thuộc lớp chất sterol, trong đó có 5 hợp chất mới được đặt tên là: 7α-Methoxygorgosterol (SCO 29), 7α-Methoxy-ergosta-5-ene-3β-ol (SCO 30), 3β-Hydroxyergosta- 4-ene-6-one (SCO 44), 3β-Hydroxyergosta-4,24(28)-diene-6-one (SCO 32), 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-3-monoacetate (SCO 42) và 7 hợp chất đã biết: 3β-Hydroxy-24-methylenecholest-5- en-7-one (SCO 26), 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-6-