Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:178

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu nhằm chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP, NĂM 2016
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số: 62 62 01 12 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG 2. TS. TRỊNH XUÂN HOẠT HÀ NỘI, NĂM 2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành i
LỜI CẢM ƠN Luận án có sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh chổi rồng và bệnh thán thƣ hại sắn” do Bộ Nông nghiệp và PTNT cấp kinh phí thực hiện cho TS. Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài và đã đƣợc cho phép sử dụng trong luận án. Để hoàn thành bản luận án này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy, quý cô và ngƣời thân. Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Hà Viết Cƣờng và TS. Trịnh Xuân Hoạt đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc. Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã nhiệt tình trao đổi, góp ý cho các vấn đề, giải pháp, trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ kỹ thuật và bà con nông dân tại nhiều nơi đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời tri ân tới tất cả ngƣời thân trong gia đình, những ngƣời luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành ii
MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 1.4. Những đóng góp mới của đề tài 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1. Cây sắn 5 2.1.1. Lƣợc sử nguồn gốc và phân loại cây sắn 5 2.1.2. Giá trị sử dụng và giá trị dinh dƣỡng 5 2.1.3. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới 5 2.1.4. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam 6 2.2. Phytoplasma hại thực vật 7 2.2.1. Lịch sử phát hiện phytoplasma 7 2.2.2. Phân loại phytoplasma 7 2.2.3. Tầm quan trọng của phytoplasma 12 2.2.4. Đặc điểm hình thái phytoplasma 13 2.2.5. Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra 14 2.2.6. Cơ chế gây bệnh của phytoplasma 14 2.2.7. Sự đa dạng của phytoplasma 15 2.2.8. Lan truyền của phytoplasma 16 2.2.9. Phƣơng pháp chẩn đoán phytoplasma 20 iii
2.2.10. Biện pháp phòng chống 26 2.3. Một số nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại sắn 27 2.4. Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật ở Việt Nam 32 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 36 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 36 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 3.2. Nội dung nghiên cứu 37 3.2.1. Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37 3.2.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 37 3.2.3. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38 3.2.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 38 3.2.5. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 38 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 39 3.3.1. Phƣơng pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 39 3.3.2. Phƣơng pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 40 3.3.3. Phƣơng pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ 44 3.3.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 46 3.3.5. Phƣơng pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 47 3.4. Phƣơng pháp tính và xử lý số liệu 49 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51 4.1. Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 51 4.1.1. Mô tả triệu chứng bệnh 51 4.1.2. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53 4.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 54 4.2.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 54 iv
4.2.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô 57 4.2.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR 59 4.3. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65 4.3.1. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR 65 4.3.2. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP 75 4.3.3. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide 84 4.3.4. Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide 86 4.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 96 4.4.1. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 96 4.4.2. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP 101 4.5. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 104 4.5.1. Ảnh hƣởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh 104 4.5.2. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây 108 4.5.3. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 109 4.5.4. Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số loài côn trùng 112 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 120 5.1. Kết luận 120 5.2. Kiến nghị 121 Danh mục các công trình công bố 122 Tài liệu tham khảo 123 Phụ lục 141 v
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh chữ viết tắt cs. Cộng sự CT Công thức µl Microliter A. laidlawii Acholeplasma laidlawii BIP Backward internal primer (Mồi ngƣợc dòng bên trong) BLAST Basic local alignment search tool (Công cụ tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng cơ bản cục bộ) bp Base pair (Cặp bazơ) Ca. Phytoplasma Candidatus Phytoplasma CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DNA Deoxy nucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtOH Ethanol FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp và Lƣơng thực của Liên hiệp Quốc) FIP Forward internal primer (Mồi xuôi dòng bên trong) IRPCM International research project for comparative mycoplasmology (Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma) kb Kilo base LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR (Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt) M. esculenta Manihot esculenta ml Mililiter nm Nanometer nts Nucleotides PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) vi
RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn) rRNA ribosomal ribonucleic acid TAE Tris-acetate acid EDTA TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng) vii
DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Phân loại phytoplasma dựa trên phân tích gen 16S RNA ribosome 8 2.2. Thành phần các nhóm côn trùng bộ Hemiptera là môi giới truyền phytoplasma 17 2.3. Một số mồi PCR phát hiện phytoplasma đã đƣợc công bố 23 2.4. Danh sách các nhóm phytoplasma hại sắn đã đƣợc xác định dựa vào phân tích phân tử 32 3.1. Các cặp mồi đƣợc sử dụng để phát hiện phytoplasma trên cây sắn 42 4.1. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại các điểm điều tra ở một số tỉnh (năm 2011) 53 4.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 55 4.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm DAPI (năm 2014) 57 4.4. Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7- R16F2n/R16R2 60 4.5. Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1 63 4.6. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 66 4.7. Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 67 4.8. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 70 4.9. Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 71 4.10. Danh sách các mẫu phytoplasma hại sắn đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen 74 4.11. Danh sách các mẫu dùng trong phân tích RFLP mô phỏng 77 4.12. Mức tƣơng đồng di truyền dựa trên mô hình cắt RFLP mô phỏng vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn 83 4.13. So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn 85 viii
4.14. Đại diện 28 nhóm phytoplasma dùng trong phân tích phả hệ 86 4.15. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrI dùng trong phân tích phả hệ 89 4.16. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrII dùng trong phân tích phả hệ 92 4.17. Các nhóm/nhóm phụ 16S RNA ribosome của phytoplasma hại sắn tại Việt Nam 94 4.18. Đặc điểm 8 trình tự phù hợp trên gen mã hóa 16S RNA ribosome để thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 99 4.19. Trình tự các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 100 4.20. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ cây 101 4.21. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR tinh sạch 102 4.22. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn khác nhau bị bệnh chổi phù thuỷ 103 4.23. Ảnh hƣởng của đất trồng và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012) 105 4.24. Ảnh hƣởng của nguồn vật liệu hom giống đến tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ (Đồng Nai, năm 2013) 107 4.25. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua phƣơng pháp ghép (Đồng Nai, năm 2012) 108 4.26. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012) 110 4.27. Kết quả bẫy đèn thu thập một số loài rầy trên vùng trồng sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ (Đồng Nai, năm 2012) 113 4.28. Xác định khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn của côn trùng thí nghiệm 116 ix
DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Hình thái và kích thƣớc phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch phloem đƣợc chụp dƣới kính hiển vi điện tử 13 2.2. Minh họa sự phân bố của phytoplasma trong cơ thể côn trùng môi giới lan truyền bệnh 18 2.3. Sơ đồ các mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng LAMP-PCR 24 2.4. Sơ đồ nguyên lý phản ứng LAMP-PCR 25 2.5. Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ 29 2.6. a) Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở vùng São Paulo, Brazil; b) cây sắn bị bệnh biến vàng ở vùng Kuwanda, Uganda 29 2.7. Bệnh da cóc hại sắn 29 2.8. Một số hình ảnh xác định phytoplasma bằng phƣơng pháp hiển vi điện tử tại Việt Nam 34 3.1. Lƣợc đồ cụm gen rDNA của phytoplasma, vị trí của các mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR 42 4.1. Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ hại sắn trên đồng 52 4.2. Xác định phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 1, năm 2011) 56 4.3. Xác định phyttoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 2, năm 2011) 56 4.4. Kết quả thí nghiệm nhuộm DAPI 58 4.5. Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7- R16F2n/R16R2 62 4.6. Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7- R16mF2/R16mR1 64 4.7. Phân tích sản phẩm PCR bằng kỹ thuật RFLP 75 4.8. Phân tích đa hình mô phỏng trình tự nucleotide bằng pDRAW32 81 4.9. Phân tích cụm dựa trên số liệu RFLP mô phỏng vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam 82 4.10. Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc vẽ theo phƣơng pháp Neighbor-Joining 88 4.11. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI 91 4.12. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII 93 x
4.13. Minh họa một phần vùng gen 16S RNA ribosome chứa các trình tự phytoplasma nhóm 16SrII với các nhóm còn lại 97 4.14. Vị trí các trình tự trên vùng gen mục tiêu và các mồi tƣơng ứng trong kỹ thuật LAMP cải tiến 98 4.15. Tám đoạn trình tự đƣợc lựa chọn để thiết các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu nhóm 16SrII 98 4.16. Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ cây 101 4.17. Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR tinh sạch 102 4.18. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ khác nhau 103 4.19. Ảnh thí nghiệm ảnh hƣởng của đất trồng đến khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ sắn trong thí nghiệm nhà lƣới (năm 2012) 106 4.20. Ảnh thí nghiệm xác định khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua phƣơng pháp ghép 109 4.21. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 110 4.22. Một số loài rầy thu thập trên vùng trồng sắn có cây bị bệnh chổi phù thuỷ tại Đồng Nai (năm 2012) 114 xi
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Đức Thành Tên luận án: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ. Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62 62 01 12 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng. Phƣơng pháp nghiên cứu * Vật liệu: Hom sắn KM94, KM419 và SM937-26 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ đƣợc lấy từ ruộng sản xuất của hộ nông dân. Hom sắn giống KM94 khoẻ. * Nội dung nghiên cứu: - Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn. - Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR. - Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn. - Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn. - Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra. * Phương pháp nghiên cứu: - Phát hiện phytoplasma trên sắn bằng kính hiển vi điện tử truyền qua trên máy JEOL 1010 và nhuộm với DAPI. - DNA tổng số đƣợc tách chiết bằng CTAB theo tài liệu mô tả của Doyle and Doyle (1990). Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp đƣợc thực hiện theo tài liệu của Deng and Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996). - Tinh chiết sản phẩm PCR dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. - Phân tích RFLP thực hiện mô phỏng bằng chƣơng trình pDRAW32. xii
- Sử dụng các phần mềm tin sinh học nhƣ ClustalW2, BioEdit 7.0. Cây phả hệ đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining trong MEGA 5.0. - Số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai bằng chƣơng trình IRRISTAT 4.0. Kết quả chính và kết luận - Xác định đƣợc phytoplasma hại sắn tại Đông Nam Bộ thuộc ít nhất 2 nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A). - Thiết kế và thử nghiệm đƣợc bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho phytoplasma nhóm 16SrII nhằm chẩn đoán bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ. - Xác định đƣợc một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra, trong đó bệnh lan truyền chủ yếu qua việc sử dụng hom giống đã bị nhiễm bệnh. xiii
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Nguyen Duc Thanh Thesis title: Study on phytoplasma disease on cassava (Manihot esculenta Crantz) in South-eastern provinces. Major: Plant Protection Code: 62 62 01 12 Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA). Research objectives Diagnosis and identification of phytoplasma disease on cassava in South-eastern provinces; evaluation of some biological characteristics including the pathogenicity and transmission ability of identified phytoplasma. Materials and Methods * Materials: Cassava varieties KM94, KM419 and SM937-26. * Research content: - Investigation of the prevalence of witches‟ broom disease on the cassava fields in south of Vietnam. - Detection of phytoplasma in cassava tissues by transmission electron microscopy and DAPI staining technique. - Molecular identification and phylogenetic analysis of the phytoplasma on cassava Vietnam. - Application of loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of the phytoplasma 16SrII group on cassava. - Evaluation of biological characteristics of phytoplasma disease on cassava under screen house conditions. * Methods: - The presence of phytoplasma in cassava tissues was identified by transmission electron microscopy and DAPI staining technique. - Total DNAs were extracted by CTAB method as previously described by Doyle and Doyle (1990). Polymerase chain reactions were followed the methods of Deng and Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996). - PCR products from agarose gel were purified by QIAquick gel extraction kit (Qiagen) according to manufacturer‟s instructions. xiv
- Virtual-restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rRNA gene was conducted by pDRAW32 program. - Phylogenetic trees were constructed by Neighbor-Joining method in MEGA 5.0 software. - Statistical analysis was conducted by IRRISTAT 4.0 software. Main findings and conclusions - The study identified two different phytoplasma groups belonging to the 16SrI (subgroup B) and the 16SrII (subgroup A) from witches‟ broom cassava plants grown in south-eastern provinces of Vietnam. - The study designed loop mediated isothermal amplification (LAMP) primers based on the 16S ribosomal RNA gene. LAMP-PCR using these primers demonstrated to be efficient to detect the phytoplasma 16SrII group on cassava. - The study provided new scientific data on biological characteristics of phytoplasma disease on cassava. This disease is mainly transmitted by cutting through vegetative propagation using diseased cassava plants. xv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) đƣợc trồng rộng khắp ở các tỉnh trong cả nƣớc với nhiều vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho ngƣời dân, góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội. Sắn là cây lƣơng thực, đồng thời cung cấp nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và làm nguyên liệu sinh học. Sắn đã trở thành 1 trong 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lƣợc đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Ở nƣớc ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một loại bệnh mới đƣợc gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu hiện triệu chứng đặc trƣng do bị nhiễm phytoplasma, nhƣ cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn và phần thân chính, lá biến vàng. Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đƣợc ghi nhận xuất hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại một số huyện của tỉnh Quảng Ngãi và đã trở thành dịch nghiêm trọng tại nhiều vùng trồng sắn thuộc một số tỉnh Đông Nam Bộ nhƣ Bà Rịa-Vũng Tàu và Đồng Nai. Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10 - 30%, hàm lƣợng tinh bột giảm 20 - 30% (Nguyên Khê, 2011). Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay trồng mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn xuất hiện, gây quan ngại cho nông dân và chính quyền địa phƣơng. Do nguyên nhân gây bệnh chƣa đƣợc xác định chính xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng. Ở một số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm để xử lý hom và phun cho cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả phòng chống bệnh. Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma. Bệnh phytoplasma hại sắn đã đƣợc ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế giới nhƣ quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nƣớc thuộc châu Mỹ và châu Á. Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định đƣợc liên quan đến bệnh biến vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ và bệnh da cóc. Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn thuộc phía đông bắc nƣớc này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85% và năng suất củ giảm đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm sút đến 90% cũng đã đƣợc ghi nhận (Lozano, 1992). 1
Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng. Phytoplasma không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo, tế bào thiếu lớp vách bên ngoài do bộ gen của chúng đã bị suy thoái mạnh. Con đƣờng lan truyền của phytoplasma ngoài tự nhiên là qua nhân giống vô tính và qua côn trùng môi giới. Do phytoplasma không nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo nên chẩn đoán và phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng gen, quan trọng nhất là gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014). Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau và số lƣợng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo từng năm (Bertaccini et al., 2014). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma trên cây trồng còn hạn chế. Các kết quả điều tra cơ bản trƣớc đây đều chƣa phát hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam. Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã đƣợc xác định là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013). Hai bệnh này đã gây thành dịch nghiêm trọng tại một số vùng trồng mía trọng điểm của Việt Nam. Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh. Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đông Nam Bộ. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng. 1.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn đoán, phân loại và một số đặc điểm sinh học. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thủy hại sắn ở Đông Nam Bộ, xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn. Nghiên cứu biện pháp chẩn đoán, xác định và phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn và khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn ở điều kiện chậu vại trong nhà lƣới. 2
1.3.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu Điều tra trên đồng, thu thập mẫu đƣợc thực hiện tại một số tỉnh Đông Nam Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Tây Ninh và một số tỉnh khác, bao gồm Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi, Kon Tum. Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học đƣợc thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc; nghiên cứu chẩn đoán, phân loại phytoplasma hại sắn đƣợc thực hiện tại Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới. Thời gian thực hiện các thí nghiệm trong đề tài từ năm 2011 đến năm 2014. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đề tài đã xác định đƣợc bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do phytoplasma gây ra. Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A). Riêng mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 (KM360166) ở Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nhƣng nằm trong nhóm phụ hoàn toàn mới, chƣa đƣợc công bố. Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI để phát hiện phytoplasma hại sắn tại Việt Nam. Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ. Đề xuất đƣợc quy trình chẩn đoán phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đông Nam Bộ. Cung cấp dẫn liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra. Xác định đƣợc con đƣờng lan truyền chính của bệnh là qua nhân giống vô tính đã bị nhiễm bệnh. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Đã xác định đƣợc phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ, phân loại đƣợc phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc 2 nhóm 16SrI và 16SrII. Đã ứng dụng thành công các kỹ thuật để chẩn đoán, phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn nhƣ kính hiển vi điện tử, kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI, kỹ thuật PCR lồng, kỹ thuật RFLP và kỹ thuật LAMP-PCR. Xác định đƣợc con đƣờng lan truyền của phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn tại Đông Nam Bộ là chủ yếu qua nhân giống vô tính. 3