Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp, thu nhận poly γ- glutamic axit (PGA) ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm và nông nghiệp

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:140

Thêm vào BST

Báo xấu

123
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ thu nhận axit poly γ-glutamic từ vi khuẩn Bacillus subtilis B5 ( phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ưu hóa các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc, đặc tính của γ-PGA).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp, thu nhận poly γ- glutamic axit (PGA) ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm và nông nghiệp

LỜI CAM ĐOAN Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, trong luận án có sử dụng một phần kết quả của đề tài cấp Thành phố“ Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp, thu nhận poly γ- glutamic axit (PGA) ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm và nông nghiệp” mã số 01C-06/03-2013-2 do tôi làm chủ nhiệm. Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố, các thông tin trích dẫn trong luận án đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 19 tháng 01 năm 2016 Ngƣời hƣớng dẫn Ngƣời hƣớng dẫn Tác giả Khoa học Khoa học Nguyễn Chí Dũng PGS-TS. Trần Liên Hà GS-TS. Đặng Thị Thu i
LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên tôi gửi lời cám ơn sâu sắc đến PGS-TS. Trần Liên Hà và GS-TS. Đặng Thị Thu – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, là những ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, định hƣớng, đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô ở Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã chỉ bảo, truyền đạt kinh nghiệm và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN đã truyền đạt kinh nghiệm, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trau dồi kiến thức chuyên môn. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các bạn, các anh chị Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và Viện Công nghệ Sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ cho tôi một số kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Sở Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội. Hà Nội, ngày 19 tháng 01 năm 2016 Nghiên cứu sinh Nguyễn Chí Dũng ii
MỤC LỤC Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt .................................................................................. vi Danh mục các bảng ............................................................................................................ vii Danh mục các hình vẽ và đồ thị ............................................................................................ x MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................................. 3 1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic ..................................................................... 3 1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam ............................................. 4 1.2.1. Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới. ..................................................... 4 1.2.2. Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam ........................................................ 7 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA....................................................................................... 8 1.4 Tính chất γ-PGA........................................................................................................ 11 1.5 Phân loại γ-PGA ....................................................................................................... 12 1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA............................................................................. 13 1.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ...................................... 15 1.7.1. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng ................................................................ 15 1.7.2. Ảnh hƣởng của yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men ............................. 21 1.7.3. Phƣơng pháp lên men γ-PGA ........................................................................ 23 1.8 Xác định và đánh giá chất lƣợng và γ-PGA.............................................................. 24 1.8.1. Định tính và định lƣợng γ-PGA ..................................................................... 24 1.8.2. Thu nhận và tinh sạch γ-PGA ........................................................................ 25 1.8.3. Đánh giá cấu trúc và khối lƣợng phân tử của γ-PGA ................................... 30 1.8.4. Xác định khối lƣợng phân tử γ-PGA.............................................................. 31 1.9 Ứng dụng γ-PGA ....................................................................................................... 32 1.9.1. Trong lĩnh vực môi trƣờng ............................................................................ 32 1.9.2. Trong lĩnh vực y dƣợc.................................................................................... 33 1.9.3. Trong lĩnh vực nông nghiệp........................................................................... 33 1.9.4. Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ......................................................... 34 CHƢƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................. 40 2.1. VẬT LIỆU ...................................................................................................... 40 2.1.1. Nguồn phân lập ............................................................................................. 40 2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................ 40 2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy: ..................................................................................... 40 2.1.4. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 41 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 41 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh và sinh học phân tử ..................................................... 41 2.2.2. Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp γ-PGA............ 42 2.2.3. Phƣơng pháp toán học - tối ƣu điều kiện nuôi cấy theo quy hoạch thực nghiệm 43 2.2.4. Phƣơng pháp phân tích hóa lý, hóa sinh ....................................................... 46 2.2.5. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan .................................................................. 49 2.2.6. Nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hƣởng của γ-PGA đến chất lƣợng giò lụa 49 iii
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 51 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp Poly γ-glutamic ........................................................................................................................51 3.2. Định danh chủng vi khuẩn sinh γ-PGA ......................................................... 55 3.2.1. Định danh theo đặc điểm hình thái kết hợp với sử dụng kit API 50CHB .......... ..............................................................................................................55 3.2.2. Định tên bằng phƣơng pháp sinh học phân tử: ............................................. 60 3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ........ 61 3.3.1. Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA ............................ 61 3.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ................................................................................. 62 3.3.3. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc. ............................................................................. 63 3.3.4. Ảnh hƣởng của pH. ........................................................................................ 64 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp γ-PGA. ............. 65 3.3.6. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ............................................................................ 66 3.3.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấp giống. ..................................................................... 67 3.3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ natri-glutamat ........................................................ 68 3.4. Tối ƣu các điều kiện ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp γ-PGA ........................... 69 3.5. Nghiên cứu động học của quá trình lên men ................................................. 75 3.6. Nghiên cứu các yếu tố ngoại cảnh đến sinh tổng hợp γ-PGA của chủng B5 ở quy mô 100 lít/mẻ ............................................................................................................ 77 3.6.1. Ảnh hƣởng của chế độ khuấy và sục khí........................................................ 77 3.6.2. Sự thay đổi của hàm lƣợng oxy hòa tan trong quá trình lên men ................. 78 3.7. Tinh sạch γ-PGA ............................................................................................ 79 3.7.1. Tinh sạch dựa trên tiêu chí hàm lƣợng protein và carbonhydrat.................. 79 3.7.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau khi tinh sạch. .............................. 80 3.7.3. Kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) .................................................................................................................... 81 3.7.4. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm tinh sạch, cấu trúc γ-PGA qua kính hiển vi điện tử quét. .................................................................................................................. 83 3.7.5. Xác định cấu trúc và độ sạch của γ-PGA thông qua phổ FT-IR và phổ H NMR 84 3.8. Nghiên cứu một số đặc tính của γ-PGA ......................................................... 86 3.8.1. Xác định khối lƣợng phân tử ......................................................................... 86 3.8.2. Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic và L – Glutamic trong γ-PGA ...................... 89 3.8.3. Nghiên cứu tính bền axit của γ-PGA. ............................................................ 89 3.8.4. Nghiên cứu tính bền nhiệt của γ-PGA ........................................................... 90 3.9. Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ-PGA....................................................... 91 3.9.1. Nghiên cứu các thông số cho sấy phun chế phẩm γ-PGA ............................. 91 3.9.2. Đánh giá mức độ an toàn của γ-PGA trong việc sử dụng làm phụ gia thực phẩm. 92 3.10. Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong ổn định nƣớc cam. ................................ 94 3.10.1. Khảo sát chất lƣợng nguyên liệu ............................................................... 94 3.10.2. So sánh ảnh hƣởng của γ-PGA đến độ ổn định của nƣớc cam với các phụ gia khác 95 iv
3.10.3. Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nƣớc cam........................................... 100 3.10.4. Ảnh hƣởng của chế độ thanh trùng tới chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam .....................................................................................................................................101 3.11. Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong cải thiện chất lƣợng giò ...................... 102 3.11.1. Ảnh hƣởng của các loại phụ gia đến độ dẻo của khối thịt xay. ............... 103 3.11.2. Ảnh hƣởng của các loại phụ gia đến chất lƣợng của giò. ....................... 104 3.11.3. Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lƣợng của giò. .................................. 107 KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 109 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN........................................ 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 111 PHỤ LỤC.......................................................................................................................... 121 v
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate CFU/ml Colony forming unit CMC Carboxyl Methyl Celullose D,L-PGA axit D,L- Poly γ- glutamic DHA Axit Docosa Hexaenoic DNA Axit Deoxyribonucleic D-PGA axit D-Poly γ- glutamic EDTA Axit Ethylenediaminetetraacetic EPA Axit Eicossa Pentaenoic FT-IR Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi GPC Sắc ký lọc gel H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân K – γ-PGA Kali – γ-PGA LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp L-PGA axit L-Poly γ- glutamic MEGA6 Phần mêm phân tích trình tự gen, phân loài NCBI Trung tâm thông tin công nghệ Sinh học quốc gia – Mỹ PCR Polymerase chain reaction RNA Axit Ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Scanning Electron Microscope TCA Axit Tricarboxylic v/p Vòng/ phút v/v Thể tích/ thể tích γ-PGA Axit Poly γ- glutamic vi
Danh mục các bảng Bảng 1.1.Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn trên thế giới ...................... 6 Bảng 1.2. Vi sinh vật sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic ................................................... 13 Bảng 1.3. Thành phần môi trƣờng cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA ............................. 15 Bảng 2.1. Khoảng biến đổi của các yếu tố ......................................................................... 44 Bảng 2.2. Bảng bố trí thí nghiệm tối ƣu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp γ-PGA. 45 Bảng 3.1. Sự phát triển, tạo màng nhày của các trực khuẩn gram dƣơng trên môi trƣờng đặc hiệu ............................................................................................................................... 51 Bảng 3.2. Độ nhớt của canh trƣờng nuôi cấy của các chủng tuyển chọn .......................... 53 Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn trên môi trƣờng LB ............ 55 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn ............................................................................................................................................. 56 Bảng 3.5. Kết quả sinh tổng hợp enzym ngoại bảo của các chủng vi khuẩn ...................... 58 Bảng 3.6. Kết quả sử dụng carbon của vi khuẩn B5 và T1 bằng Kit API 50 CHB............. 59 Bảng 3.7. Kết quả thực nghiệm theo ma trận quy hoạch thực nghiệm. .............................. 70 Bảng 3.8. Kết quả phân tích phƣơng sai ANOVA của mô hình .......................................... 71 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy và sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml) .......... 77 Bảng 3.10: Hàm lƣợng protein và carbonhydrat còn lại sau khi tinh sạch γ-PGA ............ 80 Bảng 3.11. Các tiêu chí đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm γ-PGA......................... 81 Bảng 3.12. Kết quả chạy sắc ký lọc gel (GPC) mẫu γ-PGA từ chủng B. subtilis B5.......... 88 Bảng 3.13. Tỷ lệ hỗn hợp của các đồng phân quang học axit glutamic. ............................ 89 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của axit đến tính chất của sản phẩm γ-PGA .................................. 90 Bảng 3.15. Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ-PGA ................................................... 92 Bảng 3.16. Bảng phân tích chỉ tiêu hóa lý, hóa sinh của γ-PGA sử dụng làm phụ gia thực phẩm .................................................................................................................................... 93 Bảng 3.17. Một số chỉ tiêu hóa học của cam sành Hà Giang............................................. 94 Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch quả đến chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam .......... 94 Bảng 3.19. Ảnh hƣởng của các phụ gia ổn định đến sự biến đổi độ nhớt của nƣớc cam... 96 Bảng 3.20. Sự biến đổi màu sắc sản phẩm sau thời gian bảo quản ................................... 97 Bảng 3.21. Chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam ép đục ở các tỷ lệ bổ sung γ-PGA ...... 100 Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của chế độ thanh trùng tới chất lƣợng màu sắc và mùi vị của nƣớc cam .................................................................................................................................... 102 Bảng PL1. Bảng thành phần các môi trƣờng lên men sinh tổng hợp γ-PGA ................... 122 vii
Bảng PL2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh γ-PGA ........................................ 122 Bảng PL3. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh γ-PGA ................................................ 123 Bảng PL4. Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan ........................................................... 127 Bảng PL5. Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nƣớc cam .................................... 127 Bảng PL6. Thang điểm đánh giá chất lƣợng sản phẩm nƣớc cam ................................... 128 Bảng PL7. Thang điểm đánh giá thị hiếu sản phẩm ......................................................... 129 Bảng PL8. Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan sản phẩm giò lụa ............................... 129 Bảng PL9. Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm giò ............................................... 129 viii
Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA .............................................................................................. 3 Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA ........................................................................................ 9 Hình 1.3. Phản ứng polymer hóa γ-PGA bởi ATP ........................................................................... 10 Hình 1.4. Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phƣơng pháp của Ho và các cộng sự ............................ 27 Hình 1.5. Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phƣơng pháp của Seong và các cộng sự ....................... 28 Hình 1.6. Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phƣơng pháp của Goto và Kunioka................................ 29 Hình 1.7. Kỹ thuật điện di SDS-PAGE xác định khối lƣợng phân tử γ-PGA .................................... 31 Hình 1.8. Quy trình thử nghiệm chế phẩm γ-PGA trên sản phẩm giò lụa ......................................... 37 Hình 3.1. Ảnh chụp tạo màng của các chủng vi khuẩn thử nghiệm trên môi trƣờng đặc hiệu ......... 52 Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng dịch nhớt canh trƣờng sau khi thủy phân .............................................. 54 Hình 3.3. Khả năng sinh γ-PGA của các chủng tuyển chọn .............................................................. 54 Hình 3.4. Đặc điểm hình thái tế bào của chủng B5 và T1 dƣới kính hiển vi quang học ................... 56 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phát triển của vi khuẩn ................................................ 57 Hình 3.6. Cây phát sinh chủng (B5) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA .................................. 60 Hình 3.7. Cây phát sinh chủng (T1) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA .................................. 60 Hình 3.8 Ảnh hƣởng của các tiền chất đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA. .................................... 61 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ............................................ 62 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ....................................... 63 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA .................................................. 64 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến sự hình thành γ-PGA ................................................ 66 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sự hình thành γ-PGA ..................................................... 67 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấp giống đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA .............................. 68 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nồng độ Natriglutamat đến sự tổng hợp γ-PGA ..................................... 69 Hình 3.16. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi thời gian và nhiệt độ thay đổi ............................................. 73 Hình 3.17. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi nhiệt độ và tiền chất thay đổi .............................................. 74 Hình 3.18. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH và nhiệt độ thay đổi ....................................................... 74 Hình 3.19. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH và thời gian thay đổi ..................................................... 75 Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn động học quá trình tổng hợp γ-PGA ..................................................... 76 Hình 3.21. Sự biến đổi của hàm lƣợng oxy hòa tan trong quá trình lên men.................................... 78 Hình 3.22. Sắc ký đồ HPLC mẫu γ-PGA thủy phân thành glutamic. ................................................ 82 Hình 3.23. Sắc ký đồ axit L-Glutamic sử dụng trong sinh tổng hợp γ-PGA. ..................................... 82 Hình 3.24. Ảnh chụp cấu trúc γ-PGA bằng kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 100.000 lần...... 83 Hình 3.25. Phổ FT-IR của γ-PGA tinh sạch thu đƣợc bởi chủng B. subtilis B5 ................................ 84 Hình 3.26. Phổ FT-IR của γ-PGA chuẩn của hãng Merck ................................................................ 85 Hình 3.27. Phổ H NMR của γ-PGA tinh sạch thu đƣợc bởi chủng B. subtilis B5 ............................. 85 Hình 3.28. Phổ HNMR mẫu γ-PGA chuẩn của hãng Merck ............................................................. 86 ix
Hình 3.29. Điện di SDS PAGE xác định khối lƣợng phân tử của γ-PGA .......................................... 87 Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu γ-PGA tạo thành bởi chủng B. subtilis B5 bằng sắc ký lọc gel ............... 88 Hình 3.31. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biến đổi độ nhớt của dịch γ-PGA .................................. 91 Hình 3.32. Biểu đồ so sánh ảnh hƣởng của γ-PGA và các phụ gia thƣờng dùng khác trong việc ổn định cho nƣớc cam............................................................................................................................. 95 Hình 3.33. Nƣớc cam đóng chai sau 6 tháng bảo quản .................................................................... 98 Hình 3.34. Biểu đồ ảnh hƣởng của các phụ gia ổn định đến chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam .. 99 Hình 3.35. Biểu đồ đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nƣớc cam ép đục ở các tỷ lệ bổ sung γ-PGA ......................................................................................................................................................... 100 Hình 3.36. Biểu đồ ảnh hƣởng của phụ gia tạo cấu trúc đến chất lƣợng khối thịt xay. .................. 103 Hình 3.37. Biểu đồ lực nén và lực cắt của giò thành phẩm ............................................................. 104 Hình 3.38. Biểu đồ đánh giá cƣờng lực gel của các mẫu sản phẩm giò ......................................... 105 Hình 3.39. Biểu đồ điểm đánh giá cảm quan các mẫu giò sử dụng phụ gia. .................................. 106 Hình 3.40. Cƣờng lực gel của các mẫu giò sử dụng γ-PGA ............................................................ 107 Hình PL1. Ảnh khuẩn lạc trên môi trƣờng LB, môi trƣờng E và ảnh chụp qua kính hiển vi nhuộm bào tử, nhuộm gram của vi khuẩn Bacillus subtilis B5 ................................................................... 121 Hình PL2. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng γ-PGA ..................................................................... 123 Hình PL3. Ảnh các peak khi giải trình tự 2 chiều ........................................................................... 124 Hình PL4. Đƣờng chuẩn đánh giá hàm lƣợng carbonhydrat.......................................................... 126 Hình PL5. Bảng phối màu từ ba màu cơ bản .................................................................................. 126 x
MỞ ĐẦU Khoa học công nghệ trên thế giới nói chung hay ở Việt Nam nói riêng ngày càng đƣợc quan tâm khai thác ứng dụng vào cuộc sống. Nhờ tiến bộ khoa học công nghệ, các sản phẩm thực phẩm có thể giữ đƣợc lâu hơn và chất lƣợng chế biến tốt hơn. Tuy nhiên, trong sản xuất thực phẩm, do chạy theo lợi ích, một số nhà sản xuất đã sử dụng những nguyên liệu và phụ liệu chế biến không phù hợp với tiêu chuẩn đã đặt ra, làm cho vấn đề đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm càng trở nên báo động hơn bao giờ hết. Để góp phần giải quyết vấn đề này, việc nghiên cứu tạo ra phụ gia thực phẩm mới thay thế những hóa chất độc hại đang đƣợc sử dụng tràn lan trên thị trƣờng là nhiệm vụ cấp thiết đối với các nhà khoa học. Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) là một polymer sinh học đƣợc tạo thành từ các phần tử axit glutamic. Với ƣu thế là một polymer có khả năng phân hủy, không độc với con ngƣời và tự nhiên nên γ-PGA đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, thí dụ: Trong công nghiệp môi trƣờng γ-PGA đƣợc sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học [5, 59, 82, 83, 88, 95, 126]. Trong y dƣợc γ-PGA đƣợc dùng nhƣ các chất mang, chất giữ ẩm... Trong sản xuất thực phẩm γ- PGA đƣợc sử dụng nhƣ một dạng phụ gia ổn định chất lƣợng sản phẩm, chất chống kết tinh, chất ổn định… Axit poly γ-glutamic đƣợc sản xuất bằng cách trùng hợp các axit glutamic, thông qua con đƣờng tổng hợp hóa học [1, 2], hay theo con đƣờng lên men sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic. Các chủng vi sinh vật này thƣờng đƣợc tuyển chọn trong các sản phẩm lên men truyền thống nhƣ Natto (Nhật Bản), Thua-nao (Thái Lan), Chungkookjang (Hàn Quốc), Tƣơng (Việt Nam)…[8, 53, 100]. Ở Việt Nam những nghiên cứu về γ-PGA cho đến nay chỉ đƣợc triển khai trên quy mô phòng thí nghiệm, ở mức độ phân lập và tuyển chọn chủng giống. Một số nghiên cứu sản xuất γ-PGA trên quy mô công nghiệp phục vụ nông nghiệp đƣợc thực hiện bởi các công ty của Đài Loan và Nhật Bản với chủng giống độc quyền của họ Bacillus là vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ đƣợc tìm thấy trong các sản phẩm nƣớc ngoài mà có thể phân lập đƣợc từ các sản phẩm thực phẩm truyền thống của Việt Nam nhƣ Tƣơng Bần, Tƣơng Nam Đàn, Nƣớc Mắm, Chao…[3]. Thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy chúng ta cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ƣu việt của vi khuẩn Bacillus trong sinh 1
tổng hợp γ-PGA và ứng dụng của chúng trong chế biến các sản phẩm thực phẩm. Hơn nữa việc tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hƣớng mới, tiến bộ bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng sống. Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay, việc lạm dụng các phụ gia có nguồn gốc hóa học đang diễn biến rất phức tạp, với việc nhiều loại hóa chất công nghiệp đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm. Các nhà quản lý và nhà nghiên cứu đang dần trở nên thụ động đối với mỗi loại sản phẩm có chứa các phụ gia lạ. Từ góc độ nghiên cứu cho thấy cần phải nghiên cứu ra những loại phụ gia thực phẩm mới, phù hợp tiêu chuẩn an toàn, đƣợc các tổ chức trong nƣớc và quốc tế công nhận. Để đáp ứng một phần nhu cầu đó đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ-glutamic và hướng ứng dụng trong thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những những điểm mạnh của vi khuẩn Bacillus, để tạo ra sản phẩm lên men an toàn cho chế biến thực phẩm ngày nay. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:  Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ-glutamic từ vi sinh vật.  Ứng dụng chế phẩm axit poly γ-glutamic trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm Nội dung nghiên cứu gồm  Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp γ- PGA từ các sản phẩm thực phẩm.  Khảo sát và tối ƣu các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic.  Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm và cấu trúc của axit poly γ-glutamic.  Bƣớc đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ-glutamic vào một số sản phẩm thực phẩm. Những đóng góp mới của đề tài: Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ thu nhận axit poly γ-glutamic từ vi khuẩn Bacillus subtilis B5 ( phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ƣu hóa các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc, đặc tính của γ-PGA). Bƣớc đầu thử nghiệm ứng dụng có hiệu quả γ-PGA trong quá trình chế biến để ổn định trạng thái, màu sắc và hƣơng vị của nƣớc cam và thử nghiệm ứng dụng để cải thiện độ giòn, dai và màu sắc trong sản xuất giò. 2
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic Axit poly gamma glutamic (γ-PGA) là một polymer tự nhiên, mang điện tích âm có các đơn phân là axit L-glutamic hay axit D-glutamic hoặc chứa cả hai đơn phân trên liên kết với nhau bằng mối liên kết giữa nhóm γ-carboxyl và nhóm α-amino [50, 95]. Khả năng tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2 của nhóm α-COOH và γ-COOH theo thứ tự giảm dần theo mạch. Thông thƣờng, α-NH2 liên kết với α-COOH tạo nên liên kết α-peptid (hình 1.1), tạo ra sản phẩm là α-PGA thông qua các phản ứng hóa học bằng cách trùng hợp nucleophile. Nhƣng khi có đƣợc một hệ xúc tác thích hợp, nhóm α-NH2 sẽ liên kết với nhóm γ-COOH để tạo nên liên kết γ-peptid, nhƣ mô tả trong hình 1.1. Sự hình thành γ- PGA khác với sự hình thành của protein, vì glutamate đƣợc polymer hóa bên trong tế bào thông qua các mối liên kết γ-amide, tổng hợp một cách độc lập với ribosome. Do vậy, các chất ức chế của protein, chẳng hạn nhƣ chloramphenicol không có ảnh hƣởng đến việc tổng hợp γ-PGA[4]. Nhờ quá trình polymer hóa, γ-PGA có thể đƣợc hình thành từ hơn 10.000 phân tử axit glutamic. Tùy theo môi trƣờng và phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, γ- PGA có thể đƣợc hình thành với 3 loại khác nhau, trong đó một loại đƣợc tạo thành từ toàn bộ D-γ-PGA, một loại đƣợc tạo thành nhờ toàn bộ L-γ-PGA và một loại đƣợc tạo thành nhờ polymer hóa hỗn hợp DL-γ-PGA. Sự khác biệt này có đƣợc khi vi khuẩn có khả năng chuyển hóa trực tiếp hay gián tiếp axit L-glutamic thành axit D-glutamic và hai dạng này sẽ đồng trùng hợp tạo ra DL-γ-PGA gọi chung là γ-PGA [95]. Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA [4] Một vài nghiên cứu về γ-PGA từ vi khuẩn đã đƣợc tiến hành thông qua việc đo độ nhớt, đo phổ hấp thụ hồng ngoại. Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong phần nhầy của Natto có 58% γ-PGA và 40% polysaccharide, pH khoảng 5 – 8,8 và phần nhầy này sẽ thay đổi tỷ lệ γ-PGA và polysaccharide khi pH môi trƣờng thay đổi [42, 85, 92, 130]. Nghiên cứu về ảnh hƣởng của nồng độ polymer tới cấu trúc cho thấy γ-PGA có cấu trúc xoắn khi ở nồng 3
độ thấp và có dạng  khi nồng độ cao (thể hiện ở 2 dải quang phổ 1635 và 1588 cm-1) [58, 84]. Khi nồng độ polymer tăng, có sự ảnh hƣởng lẫn nhau giữa các phân tử, sự ảnh hƣởng này lớn hơn rất nhiều so với ảnh hƣởng nội phân tử. Nhƣ vậy có thể thấy polymer ngoại bào đƣợc sản xuất từ vi khuẩn tồn tại nhiều cấu hình khác nhau, phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, nồng độ polymer và nồng độ ion những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng tới xu hƣớng hình thành các nhóm chức năng trong polymer. Cấu trúc thay đổi sẽ ảnh hƣởng đến tính chất vật lý (gắn, kết dính) kim loại, theo đó sẽ thay đổi môi trƣờng và độc tính của kim loại mà γ-PGA có thể gắn kết [50]. 1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới. Các sản phẩm có nguồn gốc sinh học, các polymer sinh học, các vật liệu sinh học đang dần thay thế các polymer dầu mỏ, các sản phẩm có nguồn gốc dầu mỏ và khoáng sản đang dần cạn kiệt. Trong số các sản phẩm sinh học có những đặc tính nói trên phải kể đến axit poly γ-glutamic (γ-PGA), một sản phẩm đƣợc tổng hợp từ axit glutamic, đƣợc sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật với các nguồn nguyên liệu rẻ tiền nhƣ ngô, khoai, sắn hay từ sinh khối thực vật. Hiện tại trên thế giới một số công ty đã sản xuất γ-PGA nhƣ Wako Pure Chemical Industries, Vedan Enterprise Corp (Đài Loan), Alamanda Polymers (Canada)… Năm 1913, axit poly γ-glutamic chỉ đƣợc biết đến trong hỗn hợp với fructan, ở lớp màng nhầy của Natto – sản phẩm đậu tƣơng lên men của ngƣời Nhật Bản [91]. Năm 1937, axit poly γ-glutamic đƣợc tìm thấy lần đầu tiên bởi Ivanovíc và các cộng sự khi họ nghiên cứu về lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus anthrasis một loại vi khuẩn gây nên bệnh than rất nguy hiểm cho các động vật ăn cỏ, động vật có vú và con ngƣời [54]. Năm 1942, Bovarnick đã chứng minh rằng γ-PGA là một sản phẩm tiết trực tiếp vào canh trƣờng nuôi cấy giống nhƣ một sản phẩm lên men ngoại bào thông thƣờng [27]. Năm 1962, House và các cộng sự phân tách đƣợc một hệ enzym tổng hợp PGA cũng từ chủng Bacillus licheniformis 9945A. Tuy nhiên, hệ enzym này xúc tác tạo ra một loại γ- PGA chứa 60% là axit L-glutamic [51]. Năm 1973, Troy đã tìm ra một phức hợp các enzym poly-glutamyl synthetase ở màng nhầy bao quanh vi khuẩn B. licheniformis 9945A xúc tác cho hàng loạt phản ứng trên màng, trong đó axit L- glutamic đƣợc hoạt hóa, đồng phân hóa và polymer hóa thành cấu trúc rất giống PDGA nhƣ là một sản phẩm tiết vào canh trƣờng dạng hòa tan. Hệ enzym xúc tác 4
cho các phản ứng này đòi hỏi phải sự có mặt của ion Mg2+ và không thể thay thế bằng các ion kim loại hóa trị hai khác [113]. Năm 1982, trong một số nghiên cứu đã công bố việc phân lập đƣợc một số enzym ngoại bào từ Bacillus natto tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển hóa amin đặc biệt là cho glutamine. Các đơn phân này đƣợc chuyển hóa thành đơn phân còn lại, sau đó chúng sẽ liên kết với nhau nhờ các liên kết γ-peptid và tồn tại ở dạng đồng hình chỉ chứa một loại đơn phân. Kết quả là có hàng loạt enzym phải tham gia vào quá trình tổng hợp này [48, 112]. Các nghiên cứu sâu hơn về γ-PGA đã đƣợc tiến hành vào năm 1995, từ đó sản phẩm này trở thành một polymer nhận đƣợc nhiều sự quan tâm nghiên cứu từ các nhà khoa học trong những năm gần đây. Phƣơng pháp đơn giản để phát hiện, tinh sạch, xác định γ-PGA đã đƣợc Kanno và cộng sự đƣa ra và rất hữu ích trong nghiên cứu di truyền và sinh hóa. Phƣơng pháp này sử dụng Cetyltrimethylammonium bromide là chất tạo độ đục cho dung dịch chứa γ-PGA rồi đo OD ở 400 nm có thế xác định đƣợc hàm lƣợng γ-PGA [7]. Năm 2006, Masaaki và các cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu về sự hình thành màng sinh học từ chủng B. subtilis ATCC 14593 và chỉ ra rằng γ-PGA là thành phần chính của màng sinh học. Nghiên cứu này đã mở ra một hƣớng ứng dụng mới đầy tiềm năng cho γ- PGA trong tƣơng lai đặc biệt là việc lựa chọn phƣơng thức lên men nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa tạo γ-PGA của chủng vi khuẩn [79, 82]. Theo số liệu thống kê trong bảng 1.1 để thu γ-PGA thời gian lên men trung bình từ 3 đến 4 ngày (72-96h) và hàm lƣợng γ-PGA sinh tổng hợp đạt đƣợc từ 20-35 g/l [95, 96]. 5
Bảng 1.1.Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn trên thế giới [17, 34, 45, 46, 84, 85, 87, 93, 95, 96, 128] Điều kiện, thời Chủng Năng suất Trích nguồn gian lên men B. licheniformis ATCC 30oC, 96h 17-23 g/l Troy, F.A (1973) 9945 Goto, A và Kunioka, B. subtilis IFO 3335 37oC, 48h 10-20 g/l M (1992) Yoshihito, I và cộng B. subtilis TAM-4 30oC, 96h 20 g/l sự (1996) Cheng, C và cộng sự. B. licheniformis A35 30oC, 72 – 120h 8-12 g/l (1989) Kubota, H và cộng sự. B. subtilis F-02-1 30oC, 48-72h 50 g/l (1993) Ogawa, Y. F và cộng B. subtilis (Natto) 40oC, 96h 35 g/l sự (1997) B. licheniformis CCRC Shih, I.L và cộng sự 37oC, 96h 19–20 g/l 12826 (2002) Bajaj, I. B và Singhal, B. licheniformis NCIM 2324 37oC, 96h 46-47 g/l R. S (2009) Chen, J và cộng sự B. subtilis ZJU-7 37oC, 48h 54 g/l (2010) B. licheniformis ATCC Nuttawut, K và cộng 30oC, 72h 12-15 g/l 9945 sự (2012) Joseph, M và Kumar, B. subtilis AR1 37oC, 115h 55,2 g/kg A (2012) Trong các nghiên cứu khoa học gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học vào các lĩnh vực thực phẩm, nông nghiệp và xử lý môi trƣờng, chăm sóc sức khỏe ngày càng phổ biến và đƣợc quan tâm sâu hơn. Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên trong công nghệ thức phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất tự nhiên đƣợc tổng hợp từ quá trình sinh học của vi sinh vật đang là đích đến của các nhà nghiên cứu. Các hợp chất có nguồn gốc từ vi sinh vật tổng hợp đƣợc phân tách ra làm các sản phẩm với các mục đích khác nhau. So với các hợp chất đƣợc tổng hợp bằng phƣơng 6
pháp hóa học, chúng có những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ an toàn cho sức khỏe con ngƣời, thân thiện với môi trƣờng [95]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam Ở nƣớc ta việc ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống không cao nhƣ các nƣớc phát triển khác. Song việc khai thác ứng dụng các quá trình sinh học trong công nghệ thực phẩm đã đƣợc hình thành từ lâu trong đời sống xã hội. Những sản phẩm truyền thống nhƣ nƣớc mắm, tƣơng Bần, tƣơng Nam đàn, tôm chua Huế, Chao… là những nguồn tài nguyên vi sinh vật tiềm năng cho phát triển công nghệ sinh học hiện đại đặc biệt là các hợp chất polymer sinh học. Nghiên cứu về axit poly γ-glutamic ở Việt Nam còn rất hạn chế, chủ yếu là hợp tác nghiên cứu các phần có liên quan đến γ-PGA. Sản phẩm γ-PGA chỉ thấy xuất hiện tại Việt Nam ở các dạng mỹ phẩm gia dụng, màng sinh học... và hầu hết các sản phẩm γ-PGA này đều có nguồn gốc nƣớc ngoài: từ Nhật bản, Hàn Quốc, Mỹ, Đức… Các công trình nghiên cứu về γ-PGA tại Việt Nam cho đến nay mới chủ yếu đạt đƣợc ở mức tổng quan, mô tả về quy trình, mô tả về ứng dụng thực tiễn trong một số tài liệu giảng dạy. Việc đi sâu nghiên cứu về cơ chế quá trình sinh tổng hợp γ-PGA và khai thác ứng dụng sản phẩm này hầu nhƣ là chƣa có. Hiện tại cũng có một số nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam tại nƣớc ngoài có liên quan đến γ-PGA nhƣ nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa enzym γ-PGA synthetase từ B. subtilis của Viện nghiên cứu thực phẩm Quốc gia Nhật bản và Viện Công nghệ Sinh học [40, 66-68]. Nhìn một cách tổng thể việc nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam còn rất ít và chỉ liên quan đến vi khuẩn Bacillus và các ứng dụng của vi khuẩn này trong công nghệ sinh học hay công nghệ thực phẩm. Hiện tại ở Việt Nam tập đoàn Vedan đã sử dụng vi khuẩn B. subtilis var natto và axit L-Glutamic qua cơ chế chuyển hóa sinh hóa Salvage Bioconversion Pathway để tạo thành sản phẩm γ-PGA. Tuy nhiên công nghệ này chỉ đƣợc sử dụng trong khuôn khổ của tập đoàn Vedan nên mọi thông tin công nghệ hay chủng giống đều đƣợc bảo mật và sản phẩm tạo thành γ-PGA của Vedan là sản phẩm dạng nƣớc sử dụng cho mục đích làm thức ăn chăn nuôi và phân bón nông nghiệp [114]. Năm 2013 đề tài nghiên cứu “Phân lập vi khuẩn có năng lực sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống Boza” của Trƣờng đại học Nông Lâm Thái Nguyên đƣợc thực hiện nhằm mục đích phân lập đƣợc chủng vi khuẩn có năng lực sinh tổng hợp γ-PGA và ứng dụng các sản phẩm này trong lĩnh vực nông nghiệp. 7
Tóm lại, từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ƣu việt của vi khuẩn Bacillus cũng nhƣ các sản phẩm do vi khuẩn này tạo ra. 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA Nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành để làm sáng tỏ con đƣờng trao đổi chất và các enzym có liên quan đến quá trình polymer hóa tạo γ-PGA nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa của vi khuẩn bằng việc tác động vào các enzym trong quá trình tạo γ-PGA. Đã có nhiều nghiên cứu công bố cho thấy sự tham gia của enzym transglutaminase của B. subtilis NR-1 là yếu tố chính xúc tác sinh tổng hợp γ-PGA, và cơ chế đồng phân hóa L-glutamic sang D- glutamic nhờ enzym alanine recemase. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phản ứng kéo dài chuỗi γ- peptid đƣợc xúc tác bởi hệ enzym: glutamate dehydronase, glutamine synthetase, pyruvic acid aminotransferase, PGA synthetase [45, 92, 95]. Tuy nhiên, B. anthracis và B. subtilis không có sự chuyển hóa này mà vẫn tạo ra γ-PGA. Điều đó chứng tỏ đây không phải là cơ chế tạo ra γ-PGA mà thực tế chỉ là một bƣớc trong cả một quy trình chuyển hóa tạo γ-PGA [19, 45]. Các nghiên cứu đã chỉ ra chủng B. licheniformis 9945A có hệ enzym tổng hợp γ-PGA dạng tự do là glutamyl transamidase. Hệ enzym này xúc tác cho việc tạo ra một loại γ-PGA chứa 60% axit L-glutamic và trong quá trình tổng hợp này đòi hỏi phải có sự tham gia của Mn2+ với vai trò co-factor [53, 64, 65, 67, 125]. Axit glutamic là những đơn phân trong cấu trúc của axit poly γ-glutamic nhờ ba nhóm liên kết hóa học α-NH2, α-COOH, γ-COOH. Phản ứng hóa học của ba nhóm này đƣợc sắp xếp theo thứ tự α-NH2>α-COOH >γ-COOH. Trong phản ứng hóa học xúc tác polymer hóa của axit glutamic, quá trình trùng hợp sẽ xảy ra đầu tiên giữa các nhóm α-NH2 và α-COOH hình thành nên liên kết α-peptid và kết quả của quá trình này sẽ là axit poly α-glutamic. Nhƣng đối với một quá trình sinh tổng hợp, phần lớn axit L- glutamic đƣợc xúc tác và chuyển hóa thành axit D – glutamic, khi đó cả D – glutamic và L – Glutamic cùng đƣợc polymer hóa và hình thành liên kết giữa nhóm α-NH2 và nhóm γ-COOH với kết quả tạo nên sản phẩm cuối là D,L-γ-PGA. Liên kết α-peptid thƣờng chỉ tìm thấy trong cấu trúc của các protein và các liên kết này có thể bị enzym protease phân cắt. Đối với liên kết γ-peptid trong axit poly γ-glutamic chỉ có thể phân cắt bởi enzym γ-GTP (γ- glutamyltranspeptidase) một loại enzym hiếm có trong tự nhiên. Không một protease nào 8
có thể phân cắt đƣợc γ-PGA, tuy nhiên γ-PGA lại là đối tƣợng sử dụng trở lại của các vi sinh vật tạo nên chúng [95]. Việc chuyển hóa tạo γ-PGA cần sử dụng các hệ enzym đa dạng tùy thuộc vào hệ vi sinh và môi trƣờng nuôi cấy. Sơ đồ hình thành nên γ-PGA đƣợc minh họa trong hình 1.2 nhƣ sau: Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA [48] Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA đƣợc nghiên cứu và đƣa ra từ năm 1982 bởi Hara và các cộng sự vẫn là vấn đề đang gây tranh cãi giữa các nhà khoa học, bởi mỗi chủng vi khuẩn có những cách chuyển hóa riêng [48]. Tuy nhiên có một số điểm chung trong các nghiên cứu về con đƣờng tổng hợp γ-PGA là: từ các hợp chất polysaccharide sau khi chuyển hóa thành các dạng đƣờng cơ bản là glucose hoặc saccharose đƣợc vi khuẩn chuyển hóa qua quá trình đƣờng phân thành axit pyruvic. Từ axit pyruvic nhờ sự chuyển hóa của vi khuẩn qua chu trình TCA chuyển hóa thành axit α-ketoglutaric. Với sự tham gia xúc tác của NH4+, phản ứng chuyển hóa axit α-ketoglutaric và L-glutamine thành axit L-glutamic. Nhờ axit α-ketoglutaric và axit pyruvic mà axit L-glutamic có thể chuyển hóa một phần thành D-glutamic. Giai đoạn polymer hóa nhờ sự xúc tác của enzym PGA synthetase sản sinh bởi vi khuẩn, các phần tử L-glutamic và D-glutamic liên kết với nhau thành D,L-γ-PGA. 9
Quá trình tổng hợp γ-PGA nhìn chung có thể tổng kết qua bốn góc độ là: racemic hóa γ- PGA, polymer hóa γ-PGA, phân cắt γ-PGA, và điều tiết γ-PGA, đƣợc cụ thể nhƣ sau: - Quá trình racemic hóa γ-PGA: Do γ-PGA là một hỗn hợp chỉ gồm L hoặc D –glutamic hoặc cả D và L glutamic, tùy thuộc vào chủng vi khuẩn tham gia. Tuy nhiên, để có đƣợc D-glutamic cần phải có quá trình racemic hóa từ L-glutamic. Vi khuẩn B. subtilis, có đoạn mã gen liên quan đến sự hình thành enzyme có khả năng racemic hóa là glr và yrpC. Trong đó glr là enzym cytosolic có khả năng lựa chọn glutamic cao và đặc biệt đối với L- glutamic[30]. Quy trình racemic hóa L-glutamic thành D-glutamic đƣợc xảy ra nhƣ sau: L- glutamic đƣợc enzym pyruvic aminotransferase xúc tác chuyển hóa thành L- alanine, sau đó L-alanine đƣợc enzym alanine racemase xúc tác racemic hóa thành D-alanine. Cũng nhờ xúc tác của enzym pyruvic aminotransferase mà D-alanine chuyển hóa thành D- glutamic [45, 95]. - Quá trình polymer hóa γ-PGA: cơ chế polymer hóa các phân tử γ-PGA phụ thuộc vào các phần tử ATP đƣợc chỉ ra trong hình 1.3. Đầu tiên là nhóm carboxyl ở cuối của phân tử γ- PGA kết hợp với nhóm phosphoryl từ gamma phosphate của ATP. Tiếp theo, nhóm amino của axit glutamic tấn công thay thế vào các phần tử phosphorylated trên nhóm carboxyl, kết quả hình thành liên kết amin mới làm kéo dài mạch γ-PGA [104]. Hình 1.3. Phản ứng polymer hóa γ-PGA bởi ATP [104]. - Quá trình phân cắt γ-PGA (depolymer γ-PGA): hai enzym (endo-γ-glutamyl peptidase và exo-γ- glutamyl peptidase đƣợc chứng minh là những enzym phân cắt γ-PGA. Trong thực tế đã chứng minh có sự phân cắt γ-PGA trong canh trƣờng do enzym ngoại bào của vi khuẩn B. subtilis NX2, là nguyên nhân giảm khối lƣợng phân tử γ-PGA [120]. Những enzym này đƣợc thể hiện rõ ở pha cuối của quá trình sinh tổng hợp. - Quá trình điều tiết γ-PGA: Theo nhiều nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp γ-PGA đƣợc điều tiết bởi các gen ComPA, DegSU và DegQ điều khiển mức độ phiên mã để thể hiện các đặc tính cảm ứng tối thiểu, thẩm thấu và sự biến đổi pha. 10