Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:151

Thêm vào BST

Báo xấu

61
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm xác định được một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care. Xác định được đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN VĂN NÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM HÀ NỘI – 2017
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Trần Văn Nên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN THỊ LAN PGS. TS. NGUYỄN VĂN THANH HÀ NỘI, NĂM 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận án Trần Văn Nên i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. TS. Nguyễn Thị Lan và PGS. TS. Nguyễn Văn Thanh đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Bệnh viện thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 20... Tác giả luận án Trần Văn Nên ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................. ii MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................... vi DANH MỤC BẢNG...................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... ix TRÍCH YẾU LUẬN ÁN ................................................................................................ xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................................. 1 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 2 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU......................................................................................... 2 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 3 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ........................................ 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................... 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................... 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 4 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC ............. 4 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nƣớc .......................................................... 4 2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nƣớc .......................................................... 5 2.2. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUT CARE............................................................... 7 2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care ................................................................................ 7 2.2.2. Hình thái của virus Care ......................................................................................... 8 2.2.3. Cấu trúc của virus Care ........................................................................................... 8 2.2.4. Sức đề kháng của virus Care................................................................................... 9 2.2.5. Cơ chế sinh bệnh ..................................................................................................... 9 2.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care .......................................................................... 11 2.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care ............................................................. 13 2.3. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE .............................................................. 18 2.3.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care ........................................................................... 18 2.3.2. Triệu chứng bệnh tích ........................................................................................... 20 iii
2.3.3. Chẩn đoán bệnh Care ............................................................................................ 22 2.3.4. Phòng và điều trị bệnh .......................................................................................... 27 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 31 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 31 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ................................................................................... 31 3.3. ĐỐI TƢỢNG VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .............................................................. 31 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................... 33 3.4.1. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care ........................... 33 3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng virus Care phân lập đƣợc ........... 33 3.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của những chủng virus Care phân lập đƣợc .......................................................................................................................... 34 3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 34 3.5.1. Phƣơng pháp khám lâm sàng ................................................................................ 34 3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể .............................................. 34 3.5.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản ................... 35 3.5.4. Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ............................................................... 38 3.5.5. Phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ tiêu máu ........................................................... 39 3.5.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ................................................................................ 39 3.5.7. Phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST .................. 40 3.5.8. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) ............................................... 41 3.5.9. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus............................. 41 3.5.10. Phƣơng pháp xác định tính kháng nguyên của virus Care.................................. 41 3.5.11. Phƣơng pháp ELISA ........................................................................................... 42 3.5.12. Phƣơng pháp RT-PCR và PCR ........................................................................... 42 3.5.13. Phƣơng pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene .................... 45 3.5.14. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 48 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 49 4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE .................................................................................................................. 49 4.1.1. Kết quả chẩn đoán chó mắc bệnh Care bằng phƣơng pháp RT-PCR ................... 49 4.1.2. Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care ..................................................... 50 4.1.3. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng của các giống chó mắc bệnh Care 52 4.1.4. Kết quả nghiên cứu sự thay đổi về chỉ tiêu máu của các giống chó mắc bệnh Care ................55 iv
4.1.5. Biến đổi bệnh lý đại thể của chó mắc bệnh Care .................................................. 60 4.1.6. Biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care ................................................. 62 4.1.7. Kết quả ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để xác định sự phân bố virus Care trên các cơ quan tổ chức của chó bệnh ........................................................................... 67 4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC................................................................. 70 4.2.1. Thông tin của những chủng virus Care phân lập đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ............ 70 4.2.2. Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân lập đƣợc ...........70 4.2.3. Hiệu giá của những chủng virus Care phân lập đƣợc ........................................... 73 4.2.4. Nghiên cứu xác định biểu đồ tăng trƣởng của những chủng virus Care phân lập đƣợc . 74 4.2.5. Nghiên cứu về tính kháng nguyên của chủng virus Care phân lập đƣợc.............. 79 4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC ................................................. 84 4.3.1. Kết quả giải trình tự gene của những chủng virus nghiên cứu ............................. 84 4.3.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng virus nghiên cứu .............. 85 4.3.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng virus nghiên cứu ............... 90 4.3.4. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide giữa những chủng virus nghiên cứu 98 4.3.5. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid giữa những chủng virus nghiên cứu ....................................................................................................................... 99 4.3.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử .............................................................. 101 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 106 5.1. KẾT LUẬN............................................................................................................ 106 5.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN . 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 109 PHỤ LỤC..................................................................................................................... 119 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CDV Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care ở chó) CPE Cytophathogenic Effect (khả năng gây bệnh tích tế bào) CPV Canine Parvovirus (Virus gây bệnh Parvo ở chó) RNA Ribonucleic acid (Axít ribonucleic) DAB 3,3-diaminobenzidine DNA Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic) EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid (axít etylen diamin tetraaxetic) Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phƣơng pháp miễn ELISA dịch gắn enzyme) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) FCS Fetal Calf Serum (Huyết thanh thai bê) MOI Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm) PBS Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng RT-PCR tổng hợp chuỗi phiên mã ngƣợc) SLS Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu) Tissue Culture Infective fifty percent Dose (Liều gây nhiễm TCID50 50% trên môi trƣờng nuôi cấy mô) vi
DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra .................................. 7 2.2. Danh sách các loại vacxin phòng bệnh Care đƣợc lƣu hành ở Việt Nam ............... 29 3.1. Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P và H .......................... 33 3.2. Chó mắc bệnh Care theo giống chó khác nhau ........................................................ 31 3.3. Chó mắc bệnh Care theo các địa phƣơng nghiên cứu khác nhau ............................ 32 3.4. Các chủng tham chiếu sử dụng để xây dựng cây sinh học phân tử ......................... 46 4.1. Kết quả chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR và PCR ........................................ 49 4.2. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care ........................................... 50 4.3. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care .............................. 52 4.4. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó H’Mông Cộc mắc bệnh Care ........................ 53 4.5. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care .................................. 53 4.6. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó lai Becgie mắc bệnh Care ............................. 53 4.7. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Fox mắc bệnh Care ....................................... 53 4.8. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care ............................. 53 4.9. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care ................................ 55 4.10. Một số chỉ tiêu máu của giống chó H’Mông Cộc mắc bệnh Care ......................... 55 4.11. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care .................................. 56 4.12. Một số chỉ tiêu máu của giống chó lai Becgie mắc bệnh Care .............................. 56 4.13. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Fox mắc bệnh Care ........................................ 57 4.14. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care ............................. 57 4.15. Các tổn thƣơng đại thể ở chó mắc Care ................................................................. 60 4.16. Biến đổi vi thể ở một số cơ quan của chó mắc bệnh Care ..................................... 63 4.17. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch ......................................................................... 67 4.18. Thông tin của các chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu............................. 70 4.19. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của 5 chủng virus Care và chủng virus vacxin Onderstepoort .................................................................................. 71 4.20. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu .......................... 73 4.21. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng kháng thể của 6 chó thí nghiệm trƣớc khi tiêm vacxin Care vô hoạt .................................................................................................................... 80 vii
4.22. Các triệu chứng lâm sàng của các chó thí nghiệm sau khi công cƣờng độc .......... 83 4.23. Kết quả phân lập virus CDV ở các lô chó thí nghiệm ........................................... 84 4.24. Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa những chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin .......................................................................................................... 87 4.25. Các vị trí sai khác nucleotide của gene H giữa những chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin .......................................................................................................... 88 4.26. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene H giữa các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin .............................................................................................. 97 4.27. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene P giữa các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin .............................................................................................. 97 4.28. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene H giữa những chủng virus Care nghiên cứu với mẫu virus vacxin Ond-VX (%) .............................................................. 99 4.29. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene P giữa những chủng virus Care nghiên cứu với mẫu virus vacxin Ond-VX (%) .............................................................. 99 4.30. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene H giữa những chủng virus Care nghiên cứu với chủng virus vacxin (%) ........................................................................ 100 4.31. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene P giữa những chủng virus Care nghiên cứu với chủng virus vacxin (%) ........................................................................ 101 viii
DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1. Cấu trúc của virus Care .............................................................................................. 8 2.2. Cơ chế sinh bệnh của bệnh Care. ............................................................................. 10 2.3. Bệnh tích tế bào do chủng virus CDV4-H và Onderstepoort gây ra sau 36 và 48 giờ gây nhiễm trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero-DST .................................................. 12 2.4. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus vacxin Onderstepoort và chủng 007Lm ............................................................................................................................. 13 2.5. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene H của virus Care ................................ 16 2.6. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene P của virus Care ................................. 17 2.7. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch trên tiêu bản phổi, hạch lympho, não và dạ dày (IHC. 10X) ...................................................................................................................... 25 4.1. Chó tiêu chảy, phân màu cà phê .............................................................................. 52 4.2. Chó có biểu hiện thần kinh ...................................................................................... 52 4.3. Chó mắc bệnh Care có các nốt sài ở vùng da mỏng. ............................................... 52 4.4. Chó mắc bệnh Care có gan bàn chân sƣng, cứng .................................................... 52 4.5. Xuất huyết ở phổi..................................................................................................... 62 4.6. Ruột bị sung huyết ................................................................................................... 62 4.7. Hạch dƣới hàm sƣng to ............................................................................................ 62 4.8. Hạch màng treo ruột sƣng to .................................................................................... 62 4.9. Viêm phế quản phổi (HE. 10X) ............................................................................... 66 4.10. Lông nhung ruột đứt nát (HE. 10X)....................................................................... 66 4.11. Ruột chó xuất huyết và thoái hóa tế bào ruột (HE. 40X)....................................... 66 4.12. Nang lympho teo (HE. 10X) .................................................................................. 66 4.13. Hóa miễn dịch dƣơng tính ở phổi (IHC. 10X) ....................................................... 69 4.14. Hóa miễn dịch dƣơng tính tại ruột (IHC. 10X) ..................................................... 69 4.15. Hóa miễn dịch dƣơng tính tại phổi (IHC. 40X) ..................................................... 69 4.16. Hóa miễn dịch dƣơng tính tại hạch lympho (IHC. 10X) ....................................... 69 4.17. CPE do CDV-VNUA-768 gây ra sau 24 giờ gây nhiễm (10X) ............................. 73 4.18. CPE do Onderstepoort (virus vacxin) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X) ........... 73 4.19. CPE do CDV-VNUA-768 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X) ............................. 73 ix
4.20. Tế bào Vero-DST bình thƣờng (10X) ................................................................... 73 4.21. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-VNUA-768 và chủng virus vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 77 4.22. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-02H và chủng virus vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 77 4.23. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-03R và chủng virus vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 78 4.24. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-04H và chủng virus vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 78 4.25. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-05P và chủng virus vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 79 4.26. Biến động dƣơng tính huyết thanh học ở chó đƣợc tiêm vacxin Care vô hoạt so với lô đối chứng không tiêm vacxin ..................................................................................... 80 4.27. So sánh giá trị OD giữa hai lô chó thí nghiệm sau khi công cƣờng độc................ 82 4.28. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene H của các chủng virus Care nghiên cứu ....................................................................................................................... 94 4.29. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene P của các chủng virus Care nghiên cứu ....................................................................................................................... 96 4.30. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của những chủng virus Care nghiên cứu ............................................................................................................ 102 4.31. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene H của những chủng virus Care nghiên cứu ............................................................................................................ 103 x
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Trần Văn Nên Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập đƣợc tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định đƣợc một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care. Xác định đƣợc đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập đƣợc tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng virus Care phân lập đƣợc tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus Care phân lập đƣợc tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Các chó mắc bệnh Care và mẫu virus Care phân lập đƣợc từ các chó mắc bệnh đƣợc thu thập từ 5 tỉnh ở phía Bắc Việt Nam gồm: Hà Nội, Hƣng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định. Bể ổn nhiệt, máy đúc chuyển mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính hiển vi quang học, máy xét nghiệm huyết học tự động CELL-DYN 3700, tủ ấm nuôi cấy tế bào (5% CO2), kính hiển vi soi nổi, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR, máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000. Formol 10%, parafin, xylen, thuốc nhuộm Hematoxilin – Eosin, dòng tế bào Vero-DST; DMEM, 10% FBS, dung dịch đệm EDTA, kháng sinh; kit tách chiết RNA tổng số, cặp mồi gene H và P, kit phản ứng RT-PCR và PCR, đệm TBE hoặc TAE, agarose, hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR sequence và kit chạy giải trình tự gene. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care bằng các phƣơng pháp thƣờng quy nhƣ: phƣơng pháp khám lâm sàng; phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể; phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản; phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch; phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý máu. Số liệu nghiên cứu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê phân tích phƣơng sai (ANOVA/One Way) với phƣơng pháp Tukey. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng virus Care phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp nuôi cấy tế bào Vero- DST, phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST; phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) (Lan et al., 2005a); phƣơng pháp xác định đƣờng biểu diễn sự nhân lên của virus; phƣơng pháp xác định tính kháng nguyên của virus. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus Care phân lập đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp RT-PCR; phƣơng pháp giải trình tự gene. Cây sinh học phân tử thể hiện nguồn gốc phát sinh của các chủng virus nghiên cứu đƣợc xây dựng bằng phần mềm MEGA6.0. Sử dụng phƣơng pháp test Maximum likehood với giá trị bootstrap là 1000 đơn vị. xi
Kết quả chính và kết luận 68 chó ở độ tuổi 3-6 tháng mắc bệnh Care thuộc 6 giống khác nhau đƣợc thu thập từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam gồm Hà Nội, Hƣng Yên, Thái Bình, Bắc Giang và Nam Định có biểu hiện bệnh lý điển hình của bệnh. Triệu chứng lâm sàng: sốt (100,0%), biếng ăn, ủ rũ (100,0%), có dử mắt (100,0%), nôn mửa (97,06%), dử mũi (79,41%), ho (79,41%), tiêu chảy phân màu cà phê (76,47%), sừng hóa gan bàn chân (41,18%), có các nốt sài ở vùng da mỏng (32,35%) và xuất hiện các triệu chứng thần kinh (11,76%). Các chỉ tiêu cận lâm sàng: thân nhiệt (40,230C – 40,590C), tần số hô hấp (71,83 – 78,94 lần/phút), tần số tim (118,88 – 130,75 lần/phút) tăng so với chó khỏe. Xét nghiệm máu ở chó mắc bệnh Care: số lƣợng hồng cầu (3,80 – 4,26 x 106/µl), hàm lƣợng huyết sắc tố (110,81 – 123,81 g/l), tỷ khối hồng cầu (32,59% - 34,18%), thể tích trung bình hồng cầu (46,20 – 47,74 fl), lƣợng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (17,88 – 18,65 pg), số lƣợng bạch cầu (4,67 – 4,87 x 103/ml). Công thức bạch cầu có sự thay đổi, trong đó tỷ lệ bạch cầu đa nhân trung tính (62,65% - 63,29%) tăng so với chó khỏe. Bệnh tích ở phổi: phổi xuất huyết (85,29%), viêm phổi thùy (79,41%), viêm phế quản phổi (79,41%). Bệnh tích ở ruột: ruột viêm, xuất huyết (91,18%) và sung huyết ở ruột non (88,24%). Hạch lympho vùng đầu, cổ, dƣới hàm, màng treo ruột sƣng to, rìa tù, xuất huyết (100%). Bệnh tích vi thể ở phổi, ruột, hạch lympho là sung huyết, xuất huyết, hoại tử tế bào, thoái hóa tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch chỉ ra virus tập trung nhiều tại phổi, ruột và hạch lympho. Một số đặc tính sinh học của 5 chủng virus Care phân lập đƣợc từ chó mắc bệnh Care là virus phân lập đƣợc thích ứng tốt trên môi trƣờng tế bào Vero-DST. Virus phá hủy tế bào Vero-DST từ 24 giờ đến 48 giờ sau khi gây nhiễm và phá hủy hoàn toàn tế bào sau 60 giờ đến 72 giờ. Hiệu giá virus biến động cao từ 3,16 x 104 tới 6,25 x 105 (TCID50/25µl). Ở các thời điểm thu hoạch virus khác nhau thì lƣợng virus tập trung trong tế bào luôn cao hơn so với lƣợng virus ở ngoài tế bào. Chủng virus Care CDV- VNUA-768 phân lập đƣợc, dùng sản xuất vacxin Care vô hoạt có tính kháng nguyên cao, khi tiêm chó thí nghiệm có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tốt, bảo hộ đƣợc chó trƣớc sự tấn công của virus công cƣờng độc. Có thể sử dụng chủng virus này nghiên cứu vacxin phòng bệnh. Đặc tính sinh học phân tử của 5 chủng virus Care phân lập đƣợc dựa trên kết quả giải trình tự gene H và P. Đoạn gene H và P có độ dài lần lƣợt là 1824 bp và 402 bp. Mức độ tƣơng đồng về nucleotide ở gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu đạt tỷ lệ lần lƣợt là 90,05%-99,61% và 94,81%-99,75%. Mức độ tƣơng đồng về nucleotide về nucleotide ở gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin đạt tỷ lệ lần lƣợt là 89,99%-99,34% và 94,81%-99,50%. Mức độ tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu đạt tỷ lệ lần lƣợt là 89,38%-99,5% và 92,47%-100,0%. Mức độ tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin đạt tỷ lệ lần lƣợt là 89,39%-99,17% và 92,47%-100,0%. 5 chủng virus Care phân lập đƣợc nằm trong 3 nhánh phát sinh khác nhau thuộc 3 genotype lần lƣợt là Asia 1, Asia 2 và Classic. xii
THESIS ABSTRACT Author: Tran Van Nen Thesis Title: Study on mainly pathological characteristics of dogs infected with Canine Distemper virus, biological and molecular characteristics of the Canine Distemper virus isolated in some Northern provinces in Vietnam. Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 62.64.01.02 Training Institution: Vietnam National University of Agriculture Research purposes To identify some mainly pathological features of dogs infected with Canine Distemper virus (CDV). To determine biological and molecular characteristics of the CDV isolated in some Northern provinces in Vietnam. Research Methods This study was conducted to identify some mainly pathological features of CDV infection in dogs. Biological characteristics of the CDV strains isolated in some northern provinces in Vietnam were investigated. Molecular biological characteristics of the CDV strains isolated in some northern provinces in Vietnam were investigated. Dogs infected with CDV and samples of CDV isolated from infected dogs were collected from 5 northern provinces in Vietnam include Hanoi, Hung Yen, Thai Binh, Bac Giang, and Nam Dinh. To realize this study, the following materials were used: waterbath, automatic paraffin dispenser embedding, automatic microtome, slide dryer, microscopes, CELL-DYN 3700 automatic hematology analyzer, cell-culture incubator (5% CO2), stereoscopic microscopes, centrifuges, PCR machines, Beckman Coulter Formol 8000 automatic sequencing machine, 10% formalin, paraffin, xylene, Haematoxylin - Eosin dyes, Vero-DST cell line; DMEM, 10% FBS, EDTA buffer, antibiotics; total RNA extraction Kit, primers of H and P gene, RT-PCR and PCR Kit, TBE or TAE buffer, agarose, chemical for purification and Kit for sequencing of PCR products. Main pathological features of dogs infected with CDV were studied using routine methods: clinical examination; post-mortem necropsy, macroscopic lesions observation; prepare microscopic slides and examination of microscopic lesions; immunohistochemistry staining; assays of physiological indicators of blood. Data was analyzed using statistical analysis of variance (ANOVA/One Way), and Tukey method. Research on biological characteristics of the CDV strains isolated was carried out using Vero-DST cell culture, CDV isolation methods on Vero-DST cell environment; virus titration (TCID50 / ml) (Lan et al., 2005a); determination the viral replication. Molecular biological characteristics of the CDV strains isolated were demonstrated by RT-PCR and sequencing methods. Phylogenetic tree illustrating the origin of viral strains was established by MEGA6.0 software and Maximum likehood test with the bootstrap value of 1000 units. xiii
Main results and conclusion Determination of some mainly pathological features of 68 dogs of 3 – 6 months old, from 6 different breeds collected from 5 northern provinces in Vietnam include Hanoi, Hung Yen, Thai Binh, Bac Giang, and Nam Dinh. Dogs infected with CDV has mainly clinical symptoms such as fever (100.0%), anorexia, depression (100.0%), rheum (100.0%), vomiting (97.06%), scratchy nose (79.41%), coughing (79.41%), diarrhea with stool of coffee color (76.47%), keratosis in sole of the feet (41.18%), pitches in the thin skin (32.35%) and neurological sign (11.76%). The subclinical indicators of infected dogs such as body temperature (40.23°C – 40.59°C), respiratory rate (71.83 – 78.94 times/minute), heart frequency (118.88 – 130.75 beat/minute). Hematological test revealed that infected dogs have RBC (3.80 – 4.26 x 106/µl), Hb (110.81 – 123.81 g/l), HCT (32.59% - 34.18%), MCV (46,20 – 47,74 fl), MCH (17,88 – 18,65 pg), WBC (4,67 – 4,87 x 103/ml). White blood cell formula has been changed, in which neutrophil rate (62.65% - 63.29%) increases in infected dogs. Mainly gross lesions were found in lung, include pulmonary hemorrhage (85.29%), lobular pneumonia (79.41%), bronchopneumonia (79.41%). Gross lesions in digestive tracts were hemorrhage (91.18%) and small intestinal congestion (88.24%). Lymph notes are swelling, hemorrhagic (100%) in heard, under the jaw, and mesentery. Mainly micro- lesions found in lung, intestine, and lymph notes of infected dogs were congestion, hemorrhage, necrosis, cell degeneration and infiltration. Results of immunohistochemistry staining indicated lung, intestines, organs and lymph nodes are infiltrated with much CDV. Results of the study on biological characteristics of the 5 strains CDV isolated showed that they had the following features: viruses start destroying cells from 24 hours to 48 hours after inoculation and completely destroyed cells after 60 hours to 72 hours; high titer (3.16 x 104 to 6.25 x 105 TCID50 / 25μl) and adapt well in Vero- DST cell culture; Virus concentration in the cell is always higher than the levels of the virus outside the cell in different collection time. CDV-VNUA-768 strain isolated was used for attenuated vaccine production with high antigenicity. Experiment in dogs yields a good immune response, protects dogs from experimental virus infection. It is recommended to use this strain for further research on vaccine. The results of the study on the molecular characteristics of the 5 isolated strains of CDV showed that they had the following features: nucleotide sequence of H and P gene was sequenced in length 1824 bp and 402 bp, respectively. The nucleotide similarity in the gene H and gene P of 5 studied strains were at a high rate of 90.05% - 99.61% and 94.81% - 99.75%, respectively. The nucleotide similarity in the gene H and gene P of 5 strains compared to the vaccine strain were 89.99% - 99.34% and 94.81% - 99.50%, respectively. The degree of amino acid similarity of the gene H and gene P was a high rate of 89.38% - 99.5% and 92.47% -100.0%, respectively. The degree of amino acid similarity of the gene H and gene P 89.39% - 99.17% and 92.47% -100.0%, respectively. Five studied CDV strains were in 3 different branches belonging to 3 genotypes: Asia 1, 2 and Classic, respectively. xiv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thƣờng xảy ra ở chó con, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao. Bệnh Care đƣợc biết tới là căn bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa đầu thế kỷ 19. Bệnh Care đƣợc báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and Gillespie, 1972). Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã đƣợc mô tả lần đầu tiên vào năm 1809 bởi Edward Jenner (Appel and Gillespie, 1972; Shell, 1990) và virus Care đã đƣợc phân lập vào năm 1905. Bệnh Care xảy ra rộng rãi trên toàn thế giới, xảy ra ở một số nƣớc nhƣ Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều nƣớc ở châu Âu, gần đây nhất là ở các nƣớc châu Á nhƣ Nhật Bản (Lan et al., 2006a), Thái Lan (Keawcharoen et al., 2005), Hàn Quốc (An et al., 2008) và Ấn Độ (Latha et al., 2007). Nguyên nhân gây bệnh Care trên chó là do virus Care (Canine distemper virus - CDV). CDV là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ Paramixoviridae. Các thành viên khác của giống Morbillivirus nhƣ virus gây bệnh sởi trên ngƣời (Measles virus - MV), virus dịch tả trâu bò (Rinderpest virus - RPV), virus gây bệnh trên động vật nhai lại nhỏ (Peste des petits ruminants virus - PPRV), virus gây bệnh trên động vật có vú dƣới nƣớc (cá heo, hải cẩu) (Murphy et al., 1999). Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang dã ăn thịt và hổ (Appel et al., 1994; Frölich et al., 2000; Martella et al., 2002). Virus Care có cấu tạo gồm một sợi RNA đơn không phân đoạn gồm khoảng 15.690 nucleotide. Trong cấu trúc bộ gene gồm 6 gene mã hóa cho các protein nhƣ protein tạo lớp vỏ bọc (M), hai glycoprotein (yếu tố kết dính (H), yếu tố kết hợp virus với thụ thể trên màng tế bào (F)), hai protein có liên quan tới sự sao chép RNA (phosphoprotein – P và large protein – L) và nucleocapsid N đóng gói RNA của virus (Sidhu et al., 1993). Dựa trên trình tự của protein Haemagglutinin (H), Harder and Osterhaus, (1997) và Martella et al., (2006) đã phân loại virus Care thành 7 nhóm chính theo ví trí địa lý gồm: Arctic – like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife. CDV là virus gây nhiễm hƣớng lympho, niêm mạc và mô thần kinh. Trƣớc đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân lập CDV trên các môi trƣờng nhƣ dòng tế bào biểu mô và nguyên bào sợi, tế bào lympho của chó (Appel et al., 1992), đại thực bào phế nang của chó (Appel, 1978), đại thực bào màng bụng 1
chồn sƣơng (Poste, 1971), xơ phôi gà (Ezeibe, 2005). Tuy nhiên việc phân lập và xác định hiệu giá virus Care rất khó khăn do không có dòng tế bào nào thích hợp để virus sinh trƣởng và gây bệnh tích tế bào. Qua nghiên cứu của Seki et al. (2003) và Lan et al. (2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus. Ở Việt Nam, bệnh Care đƣợc phát hiện từ năm 1920. Chó phát bệnh thƣờng chết với tỷ lệ chết 50-80%, có thể lên đến 100% nếu không đƣợc điều trị kịp thời (Hồ Đình Chúc, 1993). Cho đến nay, bệnh Care xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn cho đàn chó nuôi trong nƣớc do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006). Nhƣng các nghiên cứu về bệnh lý, đặc tính sinh học và di truyền của virus Care ở trong nƣớc còn rất khiêm tốn, bên cạnh đó hiệu quả bảo hộ của các vacxin phòng bệnh Care đang lƣu hành hiện nay chƣa cao cũng nhƣ chƣa có nhiều báo cáo cụ thể. Xuất phát từ thực tiễn đó, trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc Care, đồng thời nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa rất quan trọng cung cấp dữ liệu khoa học hỗ trợ việc chẩn đoán bệnh dựa vào đặc điểm bệnh lý đặc trƣng của bệnh và lựa chọn đƣợc nguồn mẫu bệnh phẩm phục vụ cho việc chọn chủng virus chế vacxin phòng bệnh hiệu quả, chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh Care gây ra cho đàn chó nuôi ở trong nƣớc. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Xác định đƣợc một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care cũng nhƣ đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập đƣợc tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc chẩn đoán phát hiện bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng. Bên cạnh đó, thông tin về các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các virus Care giúp cho việc sàng lọc và lựa chọn đƣợc chủng virus có tiềm năng trong sản xuất vacxin và các chế phẩm sinh học phục vụ công tác chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh Care. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tƣợng nghiên cứu là chó mắc bệnh Care, mẫu virus Care phân lập đƣợc từ các chó mắc bệnh Care. - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2014 tới tháng 12/2016 - Địa điểm nghiên cứu: 2
+ Bệnh viện thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. + Bộ môn bệnh lý thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam + Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và có hệ thống về đặc điểm bệnh lý bệnh Care ở chó và đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus phân lập đƣợc từ 6 giống chó (3-6 tháng tuổi) mắc bệnh Care thu thập từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam: Hà Nội, Hƣng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu về bệnh Care ở chó trong các trƣờng, viện nghiên cứu chuyên ngành thú y. Đây cũng là tƣ liệu khoa học quý báu và cần thiết cho những ngƣời làm công tác thú y cơ sở về bệnh Care. Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống virus Care phân lập đƣợc có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho các bƣớc đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn gene quốc gia. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus Care đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. 5 chủng virus phân lập đƣợc có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất vacxin hoặc chế tạo kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cƣờng độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nƣớc từ chính các chủng virus đang lƣu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nƣớc Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện từ năm 1920. Nghiên cứu của Hồ Đình Chúc (1993) đã chỉ ra thời kỳ ủ bệnh Care thƣờng là 3 - 6 ngày (dài nhất là 17 - 21 ngày) và có thể kéo dài trong khoảng thời gian trên dƣới 1 tháng. Chó phát bệnh thƣờng chết với tỷ lệ chết 50 - 80%, thậm chí lên đến 100% nếu không điều trị kịp thời. Cho đến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006). Tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhƣng mẫn cảm ở là loài chó lai, chó cảnh, chó nội ít mẫn cảm hơn (Tô Du và Xuân Giao, 2006). Nghiên cứu của Lan et al. (2008) đã phân lập đƣợc chủng virus gây bệnh trên chó mắc bệnh tại Việt Nam. Virus Care đƣợc phân lập trên dòng tế bào Vero-DST, sau đó đƣợc kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR. Chủng virus CDV- HN1 có hiệu giá virus đạt 3,16 x 105 TCID50/25 l. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy đàn chó ở Hà Nội đã lây nhiễm với virus Care. Trong nghiên cứu của Lan et al. (2009a), hai chủng virus Care là Vn86 và Vn99 đã đƣợc phân lập từ chó 4 tháng tuổi có đặc điểm là viêm não không mƣng mủ, viêm phổi, suy giảm tế bào lympho và viêm dạ dày ruột. Kết quả phân tích sinh học phân tử đã chỉ ra 2 chủng phân lập đƣợc này đều thuộc nhóm cổ điển (Classic type), khác xa với nhóm Asia 1 và Asia 2. Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam (2012) đã chỉ ra đặc điểm bệnh lý của chó Phú Quốc mắc bệnh Care và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán bệnh. Các dấu hiệu lâm sàng đầu tiên khi mắc bệnh Care là sốt cao, biếng ăn hoặc không ăn, nôn mửa đối với chó con, ho ở chó trƣởng thành, có nốt sài tại vùng da mỏng ở vùng bụng, tiêu chảy và có triệu chứng thần kinh nhƣ đi vòng tròn. Bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu ở phổi và ruột. Mặt cắt phổi có nhiều dịch chảy ra; ruột có hiện tƣợng sung huyết, xuất huyết; đại não bị sung huyết. Các dấu hiệu bệnh tích khác là: lách sƣng, mặt cắt lồi, hạch lympho sƣng, gan thoái hóa, túi mật sƣng to. Các bệnh tích vi thể gồm có xuất hiện nhiều hồng cầu trong lòng phế nang, vách phế nang đứt nát, thoái hóa tế bào nhu mô, lông nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não. Nguyễn Thị Lan và cs. (2015) đã nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của 4