Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:196

Thêm vào BST

Báo xấu

132
lượt xem 20
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V.cholerae phân lập được; xác định đặc tính kháng sinh của các chủng V.cholerae; xác định các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc của các chủng Vibrio cholerae và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch với V.cholerae ở thỏ đã được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường; định danh các chủng vi khuẩn phân lập và đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 6242 0107 Hướng dẫn khoa học PGS.TS. HỒ THỊ VIỆT THU 2015
LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Quản lý Sau Đại học thuộc Trường và Viện đã tạo điều kiện tốt thực hiện nghiên cứu khoa học và các học phần của nghiên cứu sinh. Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ Thị Việt Thu, PGS.TS. Trần Nhân Dũng đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi có thể hoàn thành luận án. Do mới nhận hướng dẫn trong thời gian 2 năm sau của luận án nên PGS.TS Hồ Thị Việt Thu đã gặp nhiều khó khăn, và cũng trong thời gian này tôi cũng chưa định hướng đúng đắn cho nghiên cứu, nhưng PGS.TS Hồ Thị Việt Thu rất tận tình giúp đỡ, tìm hướng đi cho phù hợp với nghiên cứu trong thực tế để tôi có thể hoàn thành luận án này. Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Trà Vinh đã tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia lấy mẫu tại các cơ sở giết mổ trong địa bàn Tỉnh. Chân thành cảm ơn các anh chị em Bộ môn Vi sinh Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ; Trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Khoa xét nghiệm bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp Thuỷ sản Trường Đại học Trà Vinh đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu đề tài này. Chân thành cảm ơn gia đình và đồng nghiệp đã tạo điều kiện và động viên tôi hoàn thành nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn! NGUYỄN THỊ ĐẤU i
TÓM TẮT Vibrio cholerae là một loại vi khuẩn Gram âm có hình dấu phẩy với những chủng không gây bệnh và gây bệnh. Chủng gây bệnh lây lan mạnh nhất từ năm 1816 đến năm 1923 thuộc V. cholerae O1 type sinh học cổ điển. Những năm sau đó, chủng vi khuẩn khác thuộc type sinh học El Tor gây ra những trận đại dịch kéo dài trong thập niên 1970s, chủng gây bệnh mới nhất được xác định vào năm 1992 thuộc type sinh học O139, chủng này cùng với chủng thuộc type sinh học O1 được xem là nguyên nhân của những vụ dịch xảy ra gần đây. Hiện nay, tuy có nhiều kháng sinh có thể điều trị được bệnh, nhưng hiệu quả kháng sinh có phần hạn chế do tình hình đa kháng thuốc gia tăng trong quần thể vi khuẩn này (CDC, 2005). Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của V. cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh” được thực hiện với mục đích cung cấp thông tin cần thiết trong chiến lược sử dụng kháng sinh phù hợp nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm hiện tượng kháng thuốc và giảm chi phí trong điều trị bệnh. Nghiên cứu được thực hiện qua việc phân lập vi khuẩn Vibrio spp. từ 160 mẫu nghêu, 150 mẫu nước (50 mẫu nước biển, 50 mẫu nước sông, 50 mẫu nước ao nuôi tôm), 100 mẫu huyết heo và 40 mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy thu thập tại bệnh viện đa khoa tỉnh Trà Vinh từ tháng 4 năm 2012 đến tháng 4 năm 2014. Kỹ thuật PCR và các test sinh hoá (theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-1:2007) được sử dụng để định danh mức loài của vi khuẩn Vibrio, phản ứng ngưng kết được sử dụng để định type huyết thanh V. cholerae. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 25 chủng vi khuẩn thuộc Vibrio spp. bao gồm 6 chủng V. cholerae (24%) (3 chủng từ nghêu, 2 chủng từ mẫu huyết heo và 1 chủng từ mẫu nước sông), 8 chủng thuộc loài V. paraheamolyticus (32%), 4 chủng thuộc loài V. vulnificus (16%), 5 chủng thuộc loài V. fluvialis (20%) và 2 chủng thuộc loài V. alginolyticus (8%). Kết quả định type huyết thanh học 6 chủng V. cholerae đều thuộc type O1, với 50% (3/6) dương tính với Inaba, 50% (3/6) dương tính Ogawa. Không có chủng nào thuộc type O139. Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide của gene 16S rRNA của 6 chủng V. cholerae phân lập được với chủng MS6 (Thái Lan), O395 (Ấn Độ), M66-62 (Indonesia), LMA 3894-4 (Brazil) và N16961 (Ấn Độ). Kết quả cho thấy 1 chủng trong 6 chủng này 100% tương đồng với 56 chủng; 99% tương đồng với 32 chủng và 99% tương đồng với 12 chủng gần. Riêng đối với 2 chủng mang gene kháng kháng sinh trong nghiên cứu này có trình tự nucleotide tương đồng 97% với 10 chủng; 96% với 01 chủng và 94% với 02 chủng. ii
Tính kháng kháng sinh đối với 8 loại (streptomycin, norfloxacine, ampicillin, tetracycline, azithromycin, amoxillin/clavulanic acid, trimethotrime/sulfamethazol và vancomycin) của 6 chủng Vibrio cholerae được xác định bằng phương pháp Kirby-Bauer (CLSI, 2010), kết quả cho thấy có 50% (3/6) chủng kháng streptomycin, 33% (2/6) chủng kháng tetracycline và trimethoprim-sulfamethoxazole. Với kỹ thuật PCR cho thấy có 2 chủng trong tổng số 6 chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh tetA (gene mã hóa cho yếu tố kháng tetracycline), chưa phát hiện gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI mã hoá yếu tố cho nhóm kháng sinh β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim tương ứng. So sánh trình tự nucleotide gene tetA của chủng T1 và T3 so với chủng hoang dại (N16961) cho thấy có hiện tượng thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide trên 10 vị trí codon của gene tetA của chủng T1 và trên 6 vị trí codon của chủng T3. Kết quả thử nghiệm trên thỏ chứng minh chỉ số bám dính vi khuẩn V. cholerae T1 và T3 vào niêm mạc ruột đối với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả tại thời điểm 9 giờ sau khi cho uống vi khuẩn là 55,7±13,9 và 59,3±4,2 cao hơn đối với thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả (12,4±0,6 và 7,41±1,9). Tại thời điểm 16 giờ sau khi cho uống vi khuẩn, không có hiện tượng vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột trên tất cả thỏ được thí nghiệm. Thí nghiệm cho thấy chủng phân lập có tính kháng nguyên giống với kháng nguyên của vi khuẩn sử dụng làm vaccine phòng bệnh tả (moORCVAX) đang được sử dụng trong nước. Từ khoá: Vibrio, V. cholerae, đề kháng kháng sinh iii
STUDY ON GENETIC CHARACTERISTICS AND ANTIBIOTICS RESISTANCE OF VIBRIO CHOLERAE ISOLATES IN TRA VINH ABSTRACT Vibrio cholerae is a "comma" shaped Gram-negative bacteria, some of which are pathogenic and some of which are not. The pathogenic strains which caused the most pandemic cholera from 1816 to 1293 are the Vibrio choleraes classical biotype O1. Later, other strains belong to biotype El Tor which was active in the seventh of 20th century. The latest pathogenic biotype O139 was discovered in 1992, this strain and strain O1 have been considered to be the pathogenic agents of recent cholera outbreaks. Although, there are antibiotics which can cure the disease now, but it is limited in therapy because of V. choleraes are resistant to multiple drugs (Ingole et al., 1994). Hence, we carried out “the study on genitical characteristic and antibiotic resistance of Vibrio cholerae isolated in Tra Vinh province” with purpose of providing essential information for appropriate antibotic using in order to reduce mortality, decrease antibiotic resistance and cost of treatment. The study was conducted by isolation of Vibrio spp from 160 clams, 150 water samples (50 samples of sea water, 50 samples of estuarine water, and 50 samples of shrimp pond water), 100 samples of pig blood and 40 diarrheic stool samples collected from general hospital of Tra Vinh province during April 2012 to April 2014. Polymerase chain reaction and biochemical tests (standard ISO/TS 21872-1:2007) were used to indentificate Vibrio into species, and agglutination test was used for characterization of Vibrio cholerae serotype. The results showed that there were 25 Vibrio spp. isolates including 6 strains of Vibrio cholerae (24%) (3 isolates were from clams, 2 isolates from pig blood samples and 1 from estuary water), 8 strains of Vibrio paraheamolyticus (32%), 4 strains of Vibrio vulnificus (16%), 5 strains of Vibrio fluvialis (20%) and 2 strains of Vibrio alginolyticus (8%). The serotyping results showed that all of 6 Vibrio cholerae belong to biotype O1, with 50% (3/6) positive to Inaba, and 50% (3/6) positive to Ogawa. No strain belongs to biotype O139. Nucleotide sequence comparison of gene16S rRNA of 6 Vibrio cholerae strains with that of MS6 strain (Thailand), O395 strain (India), M66-62 strain (Indonesia), LMA 3894-4 strain (Brazil) and N16961 strain (India). The results showed that one out of 6 strains were 100% homogeneous with 56 strains, 99% homogeneous with 32 strains and 99% homogeneous with 12 close strains. Separately, 2 strains (T1 and T3) containing antibiotic iv
resistance gene were 97% homogeneous with 10 strains, 96% homogeneous with 01 strain and 94% homogeneous with 02 strains. Antibiotic resistance to 8 antibiotics (streptomycin, norfloxacine, ampicillin, tetracycline, azithromycin, amoxillin/clavulanic acid, trimethotrime/sulfamethazol and vancomycin) of 6 Vibrio cholerae strains was tested by Kirby-Bauer method (CLSI, 2010). The results showed that there 50% (3/6) of isolates which was resistant to streptomycin, 33% (2/6) was resistant to tetracycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. Two out of 6 strains had antibitotic resistance gene (gene tetA) encoding for tetracycline resistant factor. Gene blaSHV, gene aac(3)-IV and gene dhfrI which encode for β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim resistant factors were not detected. Nucleotide sequence comparison of gene tetA of T1 và T3 with that of wild strain (N16961) showed that there were 1- 3 nucleotide more or less in 10 codon positions of gene tetA in T1 strain and 6 codon positions in T3 strain. Results of experiments on rabbits demonstrated that adhesion indexes of V. cholerae T1 and T3 strains in the intestinal mucosa of rabbits which were not orally used cholera vaccine after 9 hours of oral administration of these bacteria were 55,7±13,9 and 59,3±4,2, respectively. These indexes were higher than those of rabbits with cholera vaccination were 12,4±0,6 and 1,9±7,41, respectively. After 16 hours of bacteria administration, there was no bacterial adhesion in the intestinal mucosa of all the rabbits. It showed that T1 and T3 strains shared the same antigens with bacteria used to produce cholera vaccine (MicroVAX) which is available in Vietnam. Keyword: Vibrio, V. cholerae , antibiotic resistance v
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh” này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa từng được sử dụng hoặc công bố cho một luận án nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Thị Đấu vi
MỤC LỤC Trang TT TÓM TẮT …………………………………………………….. ii ABSTRACT …………………………………………………... vi CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU …………………………………. 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài ………………………………………. 1 1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ……………………………. 3 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………….. 3 1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu ………………………………………..... 3 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu …………………………..... 3 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu …………………………..... 4 1.5 Những đóng góp của luận án …………………………………. 4 1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án ………….. 4 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………... 5 2.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả …………………………………... 5 2.2 Tổng quan về Vibrio. …………………………………………. 6 2.2.1 Đặc điểm các loài thuộc giống Vibrio......................................... 7 2.2.2 Phân loại vi khuẩn V. cholerae …………………………... 9 2.2.3 Đặc điểm hình dạng của V. cholerae …………………………. 11 2.2.4 Đặc điểm sinh thái của V. cholerae ………………………………. 11 2.2.5 Sức đề kháng của V. cholerae …………………………………….. 15 2.3 Tình hình dịch tễ học của bệnh tả do V. cholerae …………….. 15 2.3.1 Tình hình dịch tễ do V. cholerae ở các nước trên thế giới …. 15 2.3.2 Tình hình dịch tễ do V. cholerae ở Việt Nam ………………. 20 2.3.3 Nguồn truyền nhiễm và các phương thức truyền lây của V. 22 cholerae………………………………………………………. 2.4 Đặc điểm di truyền của V. cholerae ………………………….. 25 2.4.1 Độc lực của V. cholerae .................................................... 26 2.4.2 Đặc tính di truyền về độc lực của V. cholerae ………………. 27 2.4.3 Các yếu tố về độc lực ………………………………………… 29 2.5 Cơ chế gây bệnh của V. cholerae …………………………….. 31 2.6 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ……………………. 33 2.6.1 Khái niệm …………………………………………………….. 33 2.6.2 Cơ chế kháng kháng sinh …………………………………….. 33 2.6.3 Sự kháng kháng sinh do V. cholerae ở các nước trên thế giới 35 2.6.4 Sự kháng kháng sinh của V. cholerae ở Việt Nam .................... 37 2.6.5 Cơ chế kháng kháng sinh của V. cholerae ……………………. 39 2.6.6 Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn đối với tetracycline ………. 41 2.7 Tính miễn dịch đối với vaccine phòng bệnh tả trên người……. 45 vii
2.7.1 Nguyên lý sử dụng vaccine ………………………………….. 45 2.7.2 Cơ chế hoạt động của vaccine ………………………. 46 CHƯƠNG III: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ 47 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………………. 3.1 Nội dung nghiên cứu ……………………………………….. 47 3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu …………………… 47 3.2.1 Phương tiện nghiên cứu……………………………………… 47 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………. 49 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………... 66 4.1 Kết quả phân lập và định danh Vibrio spp. …………………… 66 4.1.1 Kết quả phân lập Vibrio spp. ...............................................….. 66 4.1.2 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng phản ứng sinh hóa ........... 67 4.1.3 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng máy định danh tự động …. 69 4.1.4 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR ………….. 70 4.1.5. Tỉ lệ phát hiện Vibrio spp. trên các loại mẫu phân lập ……… 71 4.1.6 Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu ở huyện Cầu Ngang và 74 Duyên Hải……………………………………………………... 4.1.7 Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên huyết heo tại một số huyện ……. 75 4.2 Kết quả định type huyết thanh học ……………………………. 76 4.3 Kết quả tính tương đồng giữa các loài thuộc Vibrio trên Genbank bằng công cụ BLAST ………………………………. 77 4.4 Sự kháng kháng sinh của V. cholerae …………………….. 84 4.4.1 Kết quả khảo sát sự kháng kháng sinh của V. cholerae bằng phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010) …………………….. 84 4.4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ………………………………. 87 4.4.3 Sự hiện diện một số gene kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân lập …………………………………………………………….. 89 4.4.4 Kết quả giải trình tự các đoạn gen kháng kháng sinh……… 90 4.4.5 So sánh trình tự nucleotid của chủng V. cholerae T1, T3 với chủng V. cholerae hoang dại N16961……………………….. 92 4.4.6 Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene 96 kháng kháng sinh tetA………………………………………… 4.5 Thử nghiệm độc lực chủng V. cholerae và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên thỏ..................................................…... 100 4.5.1 Kết quả đánh giá chủng V. cholerae không uống vaccine phòng bệnh tả ......................................................... ………….. 100 4.5.2 Kết quả đánh giá tính đáp ứng miễn dịch trên thỏ đã uống vaccine phòng bệnh tả ................................................................ 103 viii
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107 5.1 Kết luận ………………………………………………………. 107 5.2 Đề nghị ……………………………………………………….. 107 Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án.. 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………….. 109 -123 PHỤ LỤC 1a Sắc phổ chuỗi trình tự chủng Ng3 (F11) …………................... 124-125 1b NCBI Blast V.cholerae (F11) ………………………………… 126-130 2a Sắc phổ chuỗi trình tự chủng N8 (F17) ………………………. 131 2b NCBI Blast V.cholerae N8 (F17) …………………………….. 132-136 3 NCBI Blast V.cholerae O3.2 (F13) ………………………… 137-141 4 NCBI Blast V.cholerae O1.2 (F14) ………………………… 142-146 5a Sắc phổ chuỗi trình tự 16S rRNA chủng O9.1 (F15) 147 5b NCBI Blast V.paraheamolyticus O9.1 (F15) ………………… 148-152 6a Sắc phổ chuỗi trình tự gen kháng KS TetA chủng T1………... 153 6b NCBI Blast gene kháng kháng sinh T1………………………. 154-157 7 NCBI Blast gene kháng kháng sinh T3………………………. 158-159 8 Sự tương đồng về trình tự Nucleotide của các chủng V. 160-161 cholerae phân lập và các chủng V. cholerae trên Genbank....... 9 Tổng hợp kết quả thử kháng sinh đồ đối với V. cholerae…….. 162 10 Chủng V. cholerae kháng thuốc chủ yếu từ năm 2003 – 2009 ở 163-165 một số nước trên thế giới …………………………………….. 11 Các acid amin trình tự chủng T1………………………………. 166 12 Các acid amin trình tự chủng T3 ……………………………… 167 13 Các acid amin chủng hoang dại N16961……………………… 168 14 Kết quả xử lý thống kê ………………………………………... 169-174 15 Thành phần môi trường, hoá chất dùng trong thí nghiệm……. 175-178 16 Hệ thống định danh trực khuẩn Gram âm (IDS 14 GNR)…… 179 17 Vaccine tả dùng trong thí nghiệm ……………………………. 179 18 Kết quả các phản ứng sinh hoá ……………………................. 25 chủng ix
DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Tổng hợp sự phân bố tác nhân gây bệnh trên thế giới ................ 20 2.2 Tổng hợp nhóm type huyết thanh gây bệnh ở Việt Nam …….... 21 2.3 Tình hình nhiễm V. cholerae trên các loại thức ăn...................... 24 2.4 Tổng hợp về độ tuổi và giới tính mắc bệnh do V. cholerae …… 25 2.5 Cơ chế kháng kháng sinh của V. cholerae …………………….. 41 3.1 Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae ………. 54 3.2 Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa trên 56 gen 16S rDNA………………………………………………….. 3.3 Chủng V. cholerae sử dụng so sánh và phân tích di truyền…… 57 3.4 Tiêu chuẩn đánh giá sự nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn 59 đường ruột …………………………………………………….. 3.5 Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR xác định 61 gene kháng kháng sinh ………………………………………… 3.6 Các chủng vi khuẩn kháng KS sử dụng để so sánh với trình tự 62 các chủng V. cholerae…………………………………………. 4.1 Tổng hợp đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn….. 66 4.2 Kết quả thử sinh hoá các loài thuộc Vibrio spp………… 67 4.3 Tỉ lệ dương tính của các loài thuộc Vibrio spp………….. 69 4.4 Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên các loại mẫu …………………… 72 4.5 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. theo chủng …………………. 73 4.6 Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu tại 2 huyện………………. 74 4.7 Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên huyết heo tại một số huyện …….. 75 4.8 Kết quả xác định type huyết thanh học ……………………….. 76 4.9 Bảng trình tự nucleotide V. cholerae_Ng3-TraVinhVN-2014… 78 4.10 Bảng trình tự nucleotide V. cholerae_N8-TraVinhVN-2014…. 79 4.11 Mức tương đồng của V. cholerae (F11) với các chủng V. 81 cholerae khác trên Genbank bằng công cụ BLAST…………… 4.12 Sự nhạy cảm và kháng kháng sinh của V. cholerae ………... 84 x
4.13 Sự đa kháng kháng sinh của V. cholerae ……………........... 86 4.14 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh 88 đối với V. cholerae …………………………………………… 4.15 Bảng trình tự nucleotide Gene_DKKS_T1_TraVinhVN_2014... 90 4.16 Bảng trình tự nucleotide Gene_DKKS_T3_TraVinhVN_2014... 91 4.17 So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại 94 N16961 với chủng V. cholerae T1 ……………………........... 4.18 So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại 95 N16961 với chủng V. cholerae T3 ……………………………. 4.19 Mức độ tương đồng đoạn gen kháng kháng sinh của V. 97 cholerae (T1 và T3) ………………………………………....... 4.20 Lượng dịch lỏng (FA) thu từ ruột non của thỏ không uống 100 vaccine ………………………………………………………... 4.21 Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ 102 không uống vaccine ………………………………………….. 4.22 Lượng dịch lỏng (FA) thu từ ruột non của thỏ đã uống vaccine 103 4.23 Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ đã 104 uống vaccine ………………………………………………... xi
DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Phân loại type huyết thanh V. cholerae …………………………. 10 2.2 Cấu tạo vi khuẩn V. cholerae ………………………………......... 11 2.3 Sinh thái vi khuẩn V. cholerae ………………………………...... 15 2.4 Các giai đoạn đại dịch tả .............................................................. 19 2.5 Sự lan rộng của các đại dịch tả từ năm năm 1961 đến 1971......... 19 2.6 Thời gian mắc bệnh do V. cholerae trong năm ………………….. 24 2.7 Nhiễm sắc thể 1 và nhiễm sắc thể 2 của V. cholerae ……………. 26 2.8 Sự hình thành chủng V. cholerae có độc tố …………………....... 28 2.9 Sự chuyển giao gene theo chiều ngang ………………………… 28 2.10 Trình tự di truyền của V. cholerae …………………………….... 29 2.11 Vi khuẩn đột biến roi ……………………………………………. 30 2.12 Cơ chế tạo độc tố ở ruột của V. cholerae ……………………....... 32 2.13 Sự di truyền Plasmid từ vi khuẩn sang vi khuẩn ………………... 37 2.14 Cấu trúc của các dẫn xuất của tetracycline ……………………… 42 2.15 Cơ chế kháng tetracycline của vi khuẩn ………………………… 43 2.16 Cơ chế tác động của kháng sinh .................................................... 44 2.17 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn ......................................... 45 3.1 Thỏ thí nghiệm …………………………………………………... 49 3.2 Quy trình phân lập và định danh Vibrio spp. ……………………. 53 3.3 Thử nghiệm sự ngưng kết với kháng huyết thanh của V. cholerae 55 xii
3.4 Thỏ được gây mê ………………………………………………... 64 3.5 Dịch thu từ niêm mạc ruột non thỏ ……………………………… 64 3.6 Pha loãng mẫu theo dãy thập phân ……………………………… 65 4.1 Khuẩn lạc trên môi trường TCBS ……………………………….. 66 4.2 Test sinh hoá …………………………………………………….. 68 4.3 Nồng độ muối từ 0% - 10% ……………………………………... 68 4.4 Vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử …………………………....... 69 4.5 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen 16S-27F và 1492R ……………. 70 4.6 Cây biễu diễn mối quan hệ di truyền dựa trên 16srDNA của các Vibrio 80 spp. phân lập và một số chủng tham khảo………………………… 4.7 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ ………………………………… 85 4.8 Tỷ lệ nhạy cảm và kháng kháng sinh đối với V. cholerae ………. 86 4.9 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen tetAF và testAR ………………… 89 4.10 So sánh các vị trí nucleotid được chèn vào và mất đi …………… 93 4.11 Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng 98 kháng sinh tetA…………………………………………………………. 4.12 Biểu đồ dịch lỏng sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ……… 100 4.13 Biểu đồ V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ.......... 102 4.14 Biểu đồ lượng dịch lỏng sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non 103 thỏ……………………………………………………………….. 4.15 Biểu đồ V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non ……….. 104 xiii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Chữ viết đầy đủ Nghĩa tiếng Việt APW Alkaline peptone water Nước peptone kiềm ASPW Alkaline saline peptone water Nước peptone muối kiềm ADH Arginine Dihydrolase CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CTX Cholerae toxin Độc tố bệnh tả CTXΦ Cholerae toxin XΦ Thực khuẩn thể của Vibrio cholerae mang gen có độc tố tả CTXP Cholerae toxin pili Độc tố bệnh tả (pili) CTXA Cholera toxin gene A Gen mã hoá độc tố tả trên tiểu đơn vị A CTXB Cholera toxin gene B Gen mã hoá độc tố tả trên tiểu đơn vị B CLSI Clinical and Laboratory Standard Viện tiêu chuẩn phòng thí nghiệm và Institute lâm sàng CDC Centers for Disease Control Trung tâm kiểm soát dịch bệnh cAMP Cycle Adenosin monophosphat DNA Deoxyribo nucleic acid Phân tử acid nucleic mang thông tin di truyền FA Fluid accumulation Tích tụ chất lỏng IgG Immunoglobulin G Kháng thể dịch thể lớp IgG IgA Immunoglobulin A Kháng thể dịch thể lớp IgA IVI The International Vaccine Institute Viện Vaccine Quốc tế KN Kháng nguyên LDC Lysin decarboxylase MDR Multidrug resistance Đa đề kháng MHA Mueller Hinton agar MIC Minimum Inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu Concentration NA Nutrient agar Thạch dinh dưỡng NAG Non-agglutinable Không ngưng kết NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen xiv
NIHE National Institute of Hygiene and Viện Vệ sinh và Dịch tễ Quốc gia Epidemiology ORF Open Reading Frame Khung đọc mở PAD Phenyl Alanin Deaminase PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi Polymerase PAD Phenyl Alanin Deaminase RND Resistance-nodulation-division RITARD Removable intestinal tie-adult Cột – tháo đoạn ruột trên thỏ tiêu chảy rabbit diarrhoea TCPA Toxin co-regulated pilus gene Gen quy định mã hóa độc tố pili ToxR ToxR Gen quy định mã hóa Protein màng TCP Toxin coregulated pili Gen mã hoá độc tố pili TCBS Thiosunfat-Citrat-Bile-Sacaroza Thạch muối mật – đường TSI Triple sugar iron agar Thạch sắt và 3 loại đường VcAM VcAM Gen VcAM quy định đa đề kháng KS VPI Vibrio pathogenicity Island Vùng quy định tính gây bệnh của Vibrios SXT Sulfamethoxazole–trimethoprim Gen SXT quy định đa đề kháng kháng sinh tương ứng SNA Saline Nutrient agar Thạch dinh dưỡng – muối WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới xv
Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên người, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình thức dịch địa phương và đại dịch. Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ năm 1816 đến năm 1923 đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều bắt đầu từ Ấn Ðộ và đều do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại dịch thứ 7 khác với 6 đại dịch trước, đại dịch này do V. cholerae type sinh học El Tor gây ra và có nguồn gốc từ đảo Celebes của Indonesia năm 1961. Đại dịch này kéo dài nhất và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay còn nhiều nước thông báo những đợt bùng phát dịch tả cũng do nguyên nhân này gây ra (Hayes, 2005). Ở Việt Nam, bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra tiêu chảy hơn một thế kỷ nay, với 2.000.000 trường hợp được báo cáo trong năm 1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả với tỉ lệ tử vong lên đến 50% và đến năm 1910-1930 có 5.000 đến 30.000 trường hợp bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962). Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xảy ra 3 đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm ở 18 tỉnh, thành thuộc cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Năm 2009 - 2010, dịch tả lại xuất hiện tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam (Nguyen et al., 2012). Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy do vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Hoàng Vũ, 2011). Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh dịch tả vì có bờ biển kéo dài khoảng 65 km và trên địa bàn Trà Vinh có hệ thống sông chính với tổng chiều dài 578 km, trong đó có các sông lớn là sông Hậu, sông Cổ Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy ra dịch bệnh vào năm 2010. Biển Duyên Hải và Cầu Ngang thuộc tỉnh Trà Vinh là vùng chuyên nuôi trồng thủy sản, trong đó phổ biến nhất là nghêu và tôm. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh thức ăn hải sản là nguồn lưu trữ vi khuẩn gây bệnh tả được xác định là V. cholerae. Vi khuẩn này có cấu trúc gene của chủng thuộc type sinh học El tor, nhưng lại mang gene độc lực của type sinh học cổ điển, khiến nó tăng độc lực và gây bệnh với triệu chứng lâm sàng nặng hơn, người khỏe mang trùng và thời gian mang trùng dài hơn, khả năng tồn tại lâu hơn trong môi trường (Boyd et al., 2008). 1
Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy triệu chứng chính của bệnh tả trên người là do độc tố của vi khuẩn V. cholerae gây ra. Vi khuẩn có mặt ở các môi trường nước biển và nguồn nước bị ô nhiễm (Nguyen Binh Minh et al., 2002). Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi khuẩn này, trong đó có V. cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị bệnh và là mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng. Nhiễm sắc thể được chứng minh là yếu tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn. Việc thu nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu tố di truyền như plasmid, integrons và transposons (Ghosh et al., 2011). Một trong những yếu tố di truyền được tích hợp và sao chép trên nhiễm sắc thể và được truyền gene kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn cùng loài trong môi trường (Burrus et al., 2004). Thực phẩm và nước ô nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, càng quan tâm hơn nữa là kháng sinh được bổ sung vào thức ăn cho động vật đã góp phần vào việc kháng kháng sinh khi điều trị bệnh trên người (Smith et al, 1999). Nhiều nghiên cứu về V. cholerae được phân lập từ các nguồn nước sông và nước biển, trên các loại mẫu thức ăn hải sản đều cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại hầu hết các kháng sinh thường được sử dụng, điều này có thể khẳng định trong thực tế việc kháng kháng sinh đang gia tăng cả trong lĩnh vực chăn nuôi trang trại và y tế công cộng, đây cũng là vấn đề toàn cầu trong những thập kỷ gần đây do sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh trong các trang trại chăn nuôi và thực phẩm làm thức ăn gia súc, gia cầm (Teuber, 2001; Bywater, 2004). Với tính chất lây lan và nguy hiểm của bệnh dịch tả, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu này được thực hiện nhằm góp phần xác định tỉ lệ nhiễm của vi khuẩn V. cholerae và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn đang gia tăng cả trong môi trường và thức ăn từ hải sản, cùng với mục tiêu xác định mối liên quan về đặc điểm di truyền gene kháng kháng sinh của V. cholerae phân lập được từ môi trường nước và trên các loại mẫu có nguồn gốc từ hải sản. Nghiên cứu đã tiến hành từ năm 2012 đến 2014 với nội dung: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế trong khu vực. 2
1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V. cholerae phân lập được. - Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng V. cholerae. - Xác định các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc của các chủng Vibrio cholerae và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường. - Định danh các chủng vi khuẩn phân lập và đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố. 1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập, định danh các loài thuộc Vibrio spp., trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản (tôm, nghêu) ở huyện Duyên Hải và Cầu Ngang; mẫu nước (sông, ao nuôi tôm, nước biển) tại thành phố Trà Vinh bắt nguồn từ sông Cổ Chiên và nước ao nuôi tôm tại huyện Duyên Hải; mẫu huyết heo từ các cơ sở giết mổ ở Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang, huyện Càng Long; mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa Trà Vinh. Các giống vi khuẩn thuộc Vibrio được kiểm tra độ dài DNA bằng kỹ thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA, sau đó tìm sự tương đồng về trình tự nucleotide với những chủng khác bằng công cụ BLAST. Xác định sự kháng kháng sinh của các chủng V. cholerae dựa trên các cặp mồi blaSHV (gene mã hoá kháng β-Lactam), aac(3)-IV (gene mã hoá kháng aminogly-cosid), tetA (gene mã hoá tính kháng tetracycline), dhfrI (gene mã hoá kháng trimethoprim); so sánh tính đột biến với các chủng V. cholerae hoang dại. Thử nghiệm trên thỏ nhằm khảo sát tính miễn dịch đối với vaccine hiện hành và sự đột biến đối với vi khuẩn phân lập được. 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio trong đó loài V. cholerae được nghiên cứu về sự đột biến và tính kháng kháng sinh. 3