Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng cây Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) tại Sa Pa, Lào Cai

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:200

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng cây Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) tại Sa Pa, Lào Cai" nhằm góp phần xác định được 1-2 mẫu giống Bát giác liên có năng suất, chất lượng dược liệu cao và đề xuất biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng cây Bát giác liên phù hợp tại Sa Pa, Lào Cai.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng cây Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) tại Sa Pa, Lào Cai

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM NGỌC KHÁNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC, BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÀ TRỒNG CÂY BÁT GIÁC LIÊN (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M. Hiroe) TẠI SA PA, LÀO CAI LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP- 2023
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM NGỌC KHÁNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC, BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÀ TRỒNG CÂY BÁT GIÁC LIÊN (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M. Hiroe) TẠI SA PA, LÀO CAI Chuyên ngành : Khoa học cây trồng Mã số : 9 62 01 10 Người hướng dẫn khoa học : 1. PGS.TS. Ninh Thị Phíp 2. PGS.TS. Phạm Thanh Huyền HÀ NỘI - 2023
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Phạm Ngọc Khánh i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS Ninh Thị Phíp và PGS.TS Phạm Thanh Huyền đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Cây công nghiệp và Cây thuốc - Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Dược liệu, Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Sa Pa, Trung tâm Tài nguyên dược liệu, Khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả Phạm Ngọc Khánh ii
MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Mục tiêu 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu 3 1.4. Những đóng góp mới của luận án 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1. Giới thiệu về chi Dysosma Woodson và các loài bát giác liên 5 2.1.1. Vị trí phân loại, nguồn gốc và phân bố chi Dysosma WoodsonError! Bookmark not defined. 2.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của dược liệu các loài trong chi Dysosma Woodson 8 2.2.1. Thành phần hóa học 8 2.2.2. Tác dụng sinh học và sử dụng chi Dysosma Woodson trong y học 11 2.3. Một số kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền và đặc điểm sinh sản của các loài thuộc chi Dysosma Woodson 14 2.3.2. Các nghiên cứu về sinh thái và đặc điểm sinh sản của các loài thuộc chi Dysosma Woodson 15 2.4. Một số kết quả nghiên cứu nhân giống cây dược liệu và các loài thuộc chi Dysosma Woodson 16 2.4.1. Nhân giống hữu tính 16 2.4.2. Nhân giống vô tính 17 2.5. Một số kết quả nghiên cứu trồng cây dược liệu và các loài thuộc chi Dysosma 25 iii
2.5.1. Khái quát về tình hình trồng trọt dược liệu trên thế giới và trong nước 25 2.5.2. Một số kết quả nghiên cứu về biện pháp kỹ thuật trồng cây dược liệu 26 2.5.3. Nghiên cứu về trồng trọt các loài Bát giác liên 32 2.5. Nhận xét chung 36 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 3.1. Vật liệu nghiên cứu 37 3.2. Nội dung nghiên cứu 40 3.2.1. Nội dung 1: Đánh giá đặc điểm nông sinh học các mẫu giống Bát giác liên 40 3.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Bát giác liên 40 3.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên 40 3.3. Phương pháp nghiên cứu 40 3.3.1. Phương pháp nghiên cứu các thí nghiệm 40 3.3.2. Phương pháp tiến hành theo dõi và các chỉ tiêu theo dõi 50 3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 53 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 4.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống Bát giác liên 54 4.1.1. Thu thập các mẫu giống Bát giác liên 54 4.1.2. Đánh giá đặc điểm hình thái của các mẫu giống Bát giác liên 57 4.1.3. Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống Bát giác liên bằng chỉ thị phân tử 75 4.1.4. Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, năng suất và chất lượng dược liệu các mẫu giống Bát giác liên 83 4.2. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Bát giác liên 90 4.2.1. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nâng cao tỷ lệ đậu quả và nhân giống hữu tính cây Bát giác liên 90 4.2.2. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống vô tính cây Bát giác liên 101 4.2.3. Ảnh hưởng của phương thức nhân giống đến khả năng sinh trưởng và ăng suất cây Bát giác liên 118 4.3. Bước đầu nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên 120 4.3.1. Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến sinh trưởng và năng suấ dược liệu Bát giác liên 120 4.3.2. Ảnh hưởng của mật độ khoảng cách trồng đến sinh trưởng và năng suất iv
dược liệu Bát giác liên 124 4.3.3. Ảnh hưởng của liều lượng phân bón đến sinh trưởng và năng suất dược liệu Bát giác liên 127 4.3.4. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến sinh trưởng, năng suất và chất lượng dược liệu Bát giác liên 132 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 140 5.1. Kết luận 140 5.2. Kiến nghị 141 Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 142 Tài liệu tham khảo 143 Phụ lục 157 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt (Tiếng Anh) AFLP Đa hình độ dài đoạn nhân bản chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) BA Benzyl adenine cs Cộng sự Ct Công thức CV (%) Hệ số biến động (Coefficient of variation) hay còn gọi là sai số thí nghiệm Đc Đối chứng GA3 Gibberellic acid HPLC Sắc ký lỏng hệu năng cao (High performance Liquid Chromatography) IBA Indol butyric acid ISSR Chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter Simple Sequence Repeat) ITS Gen nhân (Nuclear ribosomal internal transcribed spacer) IUCN Liên minh bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (International Union for Conservation of Nature) LSD0.05 Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa với mức ý nghĩa 0,05 (Least Significant Difference) MS Môi trường dinh dưỡng tổng hợp để nuôi cấy mô tế bào thực vật được phát minh bởi Murashige và Skoog PCA Phân tích thành phần chính (Principal components analysis PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) RAPD Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism DNA) RFLP Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism) RP Chỉ số sai khác của các cặp mồi (Resolving power) TB Trung bình Tm Nhiệt độ gắn mồi α - NAA Axit α - naphtyl axetic vi
DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Vị trí của chi Dysosma trong họ Berberidaceae 5 2.2. Hình thái đặc trưng của chi Dysosma Woodson và Podophyllum L 6 2.3. Các hợp chất hóa học của loài D.pleiantha 9 3.1. Thông tin các mẫu giống Bát giác liên sử dụng trong nghiên cứu 37 3.2. Thông tin về các mồi sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 38 4.1. Một số đặc điểm về sinh thái nơi thu thập các mẫu Bát giác liên 55 4.2. Đặc điểm hình thái và vi phẫu rễ các mẫu giống Bát giác liên 57 4.3. Đặc điểm hình thái và giải phẫu thân ngầm của các mẫu giống Bát giác liên 59 4.4a. Đặc điểm hình thái và vi phẫu gân lá các mẫu giống Bát giác liên 62 4.4b. Độ dày các lớp tế bào phiến lá của các mẫu giống Bát giác liên (µm) 63 4.5. Đặc điểm hình thái hoa của các mẫu giống Bát giác liên 66 4.6a. Đánh giá độ hữu dục của hạt phấn và tỷ lệ đậu quả của các mẫu giống Bát giác liên 69 4.6b. Ảnh hưởng của các biện pháp thụ phấn bổ sung đến sự đậu quả của mẫu giống Bát giác liên M11 70 4.7. Đặc điểm hình thái quả và hạt của các mẫu giống Bát giác liên 71 4.8. Đặc điểm lá mầm của các mẫu giống Bát giác liên 73 4.9. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR 75 4.10. Đa hình của 20 mẫu giống Bát giác liên dựa trên chỉ thị ISSR 76 4.11. Hệ số tương đồng di truyền của 20 mẫu giống Bát giác liên được đánh giá bằng chỉ thị ISSR (phía trên) và RAPD (hàng dưới) 77 4.12. Đa hình của 20 mẫu giống Bát giác liên dựa trên chỉ thị RAPD 80 4.13. Thời giai đoạn sinh trưởng và phát triển trong 1 năm của các mẫu giống Bát giác liên 84 4.14. Đặc điểm sinh trưởng của các mẫu giống Bát giác liên 87 4.15. Năng suất và hàm lượng podophyllotoxin của các mẫu giống Bát giác liên 89 4.16. Ảnh hưởng của chế độ phân bón và tỉa định quả đến tỷ lệ đậu quả và kích thước quả Bát giác liên 92 4.17. Ảnh hưởng của chế độ phân bón và tỉa định quả đến hạt giống Bát giác liên 96 vii
4.18. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến thời gian, tỷ lệ nảy mầm và xuất vườn của hạt Bát giác liên 100 4.19. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến đặc điểm sinh trưởng của cây con Bát giác liên tại thời điểm 240 ngày sau gieo 100 4.20. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom thân ngầm đến thời gian và khả năng nhân giống Bát giác liên 102 4.21. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom thân ngầm đến đặc điểm sinh trưởng của cây giống Bát giác liên thời điểm xuất vườn 103 4.22. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom thân ngầm đến thời gian và khả năng nhân giống Bát giác liên 104 4.23. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom thân ngầm đến đặc điểm sinh trưởng của cây giống Bát giác liên hời điểm xuất vườn 105 4.24. Ảnh hưởng của số đốt hom thân ngầm đến thời gian và khả năng nhân giống Bát giác liên 106 4.25. Ảnh hưởng của số đốt hom thân ngầm đến đặc điểm sinh trưởng cây giống Bát giác liên thời điểm xuất vườn 107 4.26. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom rễ đến thời gian và khả năng nhân giống Bát giác liên 110 4.27. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom rễ đến đặc điểm sinh trưởng của cây giống Bát giác liên thời điểm xuất vườn 111 4.28. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom rễ đến thời gian giâm hom và khả năng nhân giống cây Bát giác liên 112 4.29. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom rễ đến đặc điểm sinh trưởng của cây giống Bát giác liên thời điểm xuất vườn 112 4.30. Ảnh hưởng của độ dài hom rễ đến thời gian giâm hom và khả năng nhân giống Bát giác liên 114 4.31. Ảnh hưởng của độ dài hom rễ đến đặc điểm sinh trưởng của cây giống Bát giác liên thời điểm xuất vườn 115 4.32. Ảnh hưởng của xử lý BA và GA3 đến khả năng nhân giống hom rễ Bát giác liên 116 4.33. Ảnh hưởng của phương thức nhân giống đến khả năng sinh trưởng của cây giống Bát giác liên 118 viii
4.34. Ảnh hưởng của phương thức nhân giống đến năng suất và hàm lượng podophyllotoxin của dược liệu Bát giác liên 119 4.35. Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến khả năng sinh trưởng của cây Bát giác liên 121 4.36. Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến năng suất dược liệu Bát giác liên 123 4.37. Ảnh hưởng của mật độ khoảng cách trồng đến khả năng sinh trưởng của cây Bát giác liên 125 4.38. Ảnh hưởng của mật độ khoảng cách trồng đến năng suất dược liệu Bát giác liên 126 4.39. Ảnh hưởng của liều lượng phân bón đến khả năng sinh trưởng của cây Bát giác liên 128 4.40. Ảnh hưởng của liều lượng phân bón đến năng suất và chất lượng dược liệu Bát giác liên 130 4.41. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến khả năng sinh trưởng của cây Bát giác liên 133 4.42. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến đặc điểm hình thái lá cây Bát giác liên 135 4.43. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến đặc điểm vi phẫu lá Bát giác liên 136 4.44. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến năng suất và hàm lượng podophyllotoxin của dược liệu Bát giác liên 138 ix
DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Thân ngầm chi Dysosma Woodson 6 2.2. Thân ngầm chi Podophyllum L 6 2.3. Hoa của chi Dysosma Woodson 6 2.4. Hoa của chi Podophyllum L 6 2.5. Nhị và nhụy của chi Dysosma Woodson 6 2.6. Nhị và nhụy của chi Podophyllum L 6 2.7. Phiến lá của chi Dysosma Woodson 6 2.8. Phiến lá chi Podophyllum L 6 2.9. Một số hợp chất phân lập từ thân ngầm loài D.pleiantha 11 4.1. Địa điểm thu thập các mẫu giống Bát giác liên 54 4.2. Mẫu giống Bát giác liên tại Sìn Hồ - Lai Châu 56 4.3. Mẫu giống Bát giác liên tại Văn Chấn - Yên Bái 56 4.4. Mẫu giống Bát giác liên tại Chiêm Hóa - Tuyên Quang 56 4.5. Mẫu giống Bát giác liên tại Vị Xuyên - Hà Giang 56 4.6. Đặc điểm hình thái và giải phẫu rễ mẫu giống Bát giác liên M11 58 4.7. Đặc điểm hình thái và giải phẫu thân ngầm Bát giác liên 60 4.8. Đặc điểm hình thái và giải phẫu lá Bát giác liên 61 4.9. Lá dị hình trên cành sinh sản của các loài thuộc chi Dysosma và Podophyllum 61 4.10. Các giai đoạn phát triển của hoa ở mẫu giống Bát giác liên M13 64 4.11. Đặc điểm hình thái và giải phẫu hoa của các mẫu giống Bát giác liên 65 4.12. Quả và hạt của mẫu Bát giác liên M12 72 4.13. Các giai đoạn nảy mầm của hạt mẫu Bát giác liên M11 72 4.14. Cây con từ hạt của mẫu Bát giác liên M3 72 4.15. Sơ đồ cây quan hệ di truyền dựa trên trình tự vùng gen ITS được thiết lập thông qua phân tích gen của loài Bát giác liên ở Việt Nam và các loài khác thuộc chi Dysosma và họ Berberidaceae 74 4.16. Sơ đồ cây quan hệ di truyền trong số 20 mẫu giống Bát giác liên được phân tích bằng chỉ thị ISSR 78 4.17. Sơ đồ cây quan hệ di truyền trong số 20 mẫu giống Bát giác liên được x
phân tích bằng chỉ thị RAPD 81 4.18. Ảnh điện di chỉ thị ISSR, mồi UBC829 (hình A) và chỉ thị RAPD, mồi OPB05 (hình B) 81 4.19. Sơ đồ cây quan hệ di truyền trong số 20 mẫu giống Bát giác liên được phân tích bằng chỉ thị ISSR+RAPD 82 4.20. Sơ đồ phân tích PCA của 20 mẫu giống Bát giác liên 83 4.21. Vi phẫu rễ mẫu Bát giác liên M11 tại vị trí chồi bất định 109 4.22. Đặc điểm hình thái thân rễ (c), thân (a) và lá (b, d) Bát giác liên ở các chế độ che sáng 134 4.23. Vi phẫu gân lá và phiến lá Bát giác liên khi trồng trong điều kiện không che sáng (hình a,c) và che sáng 30% (b,d) 137 xi
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Phạm Ngọc Khánh Tên Luận án: “Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng cây Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M. Hiroe) tại Sa Pa, Lào Cai” Chuyên ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 9620110 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu góp phần xác định được 1-2 mẫu giống Bát giác liên có năng suất, chất lượng dược liệu cao và đề xuất biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng trọt cây Bát giác liên phù hợp tại Sa Pa, Lào Cai. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng 20 mẫu giống Bát giác liên thu thập từ các địa phương ở Việt Nam được ký hiệu từ M1 đến M20 và trồng đánh giá tại Trung tâm nghiên cứu dược liệu Sa Pa. Thực hiện nghiên cứu các thí nghiệm đánh giá đặc điểm nông sinh học; các thí nghiệm đánh giá đặc điểm tự bất hợp và biện pháp tác động nâng cao khả năng đậu quả; thí nghiệm nhân giống hữu tính; các thí nghiệm nhân giống vô tính bằng thân ngầm (thời vụ giâm hom, vị trí cắt lấy hom thân ngầm, số đốt của hom thân ngầm) và bằng rễ (thời vụ giâm hom, vị trí cắt lấy hom rễ, độ dài hom rễ, chất kích thích sinh trưởng); thí nghiệm trồng trọt (thời vụ trồng, khoảng cách trồng, lượng phân bón và chế độ che sáng). Các thí nghiệm 1 nhân tố hoặc 2 nhân tố được bố trí thí nghiệm theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) 3 lần nhắc lại; Phân tích giám định tên khoa học bằng phương pháp so sánh hình thái (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2009) tại Trung tâm Tài nguyên dược liệu (Viện Dược liệu) kết hợp với phân tích trình tự vùng gen ITS tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Nghiên cứu hệ gen; Giải phẫu tại Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Sa Pa, Trung tâm Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu; Bộ môn Cây công nhiệp và cây thuốc, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống Bát giác liên bằng chỉ thị ISSR và RAPD. Kỹ thuật PCR đánh giá đa dạng di truyền sử dụng 24 chỉ thị ISSR và 11 chỉ thị RAPD được thực hiện bằng máy PCR (Eppendorf ) tại Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật - Học viện Nông nghiệp Việt Nam xii
Phân tích chất lượng dược liệu Bát giác liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được thực hiện theo Dược điển Việt Nam V (2017) và Zhang & cs. (2014) tại khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Thời gian thực hiện từ năm 2017 - 2022. Kết quả chính và kết luận Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học 20 mẫu giống Bát giác liên thu thập được đã xác định các mẫu giống đều thuộc cùng một loài có tên khoa học Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe; Giữa các mẫu giống Bát giác liên có sự đa dạng di truyền cao, với hệ số tương đồng di truyền trung bình từ 0,69 khi đánh giá bằng chỉ thị ISSR, đến 0,79 khi đánh giá bằng chỉ thị RAPD. Trên cơ sở đánh giá đặc điểm nông sinh học đã tuyển chọn được mẫu giống M11 thu tại Hà Giang có đặc điểm sinh trưởng phát triển tốt, năng suất thực thu 11,75 tạ/ha và hàm lượng podophyllotoxin 3,51% phù hợp để sản xuất dược liệu tại Sa Pa, Lào Cai; Xác định được một số biện pháp kỹ thuật nhân giống Bát giác liên: hạt giống được tách lớp áo hạt, đãi sạch, để ráo và gieo ngay cho tỷ lệ mọc mầm cao. Nhân giống vô tính bằng hom thân ngầm gồm 3 đốt được cắt tại vị trí đầu thân ngầm vào thời vụ tháng 5 cho tỷ lệ hom bật mầm cao nhất. Xác định chồi bất định phát sinh từ rễ sau khi cắt rời khỏi thân ngầm và sử dụng rễ làm vật liệu nhân giống vô tính, với thời vụ giâm hom tháng 5, hom có độ dài 15 cm được cắt tại vị trí cuối rễ; ngâm hom trong dung dịch BA 10 ppm trong 2 giờ, vớt ra để ráo trong 1 giờ sau đó ngâm trong dung dịch GA3 175 ppm trong 2 giờ cho kết quả nhân giống tốt nhất; Xác định được một số biện pháp kỹ thuật trồng Bát giác liên, thời vụ trồng tốt nhất vào tháng tháng 11, mật độ trồng 62.000 cây/ha, lượng phân bón thích hợp gồm 20 tấn phân hữu cơ hoai mục + 70 kg N + 140 kg P2O5 + 70 kg K2O và chế độ che sáng phù hợp cho cây là 60%. xiii
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Pham Ngoc Khanh Thesis title: "Research on agro-biological characteristics, techniques for propagation and cultivation of Dysosma tonkinense (Gagnep.) M. Hiroe in Sa Pa, Lao Cai". Major: Crop Science Code: 9 62 01 10 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives The research aims to determine 1-2 accessions of D. tonkinense with high productivity and quality of medicinal material and propose techniques for propagation and cultivation of D. tonkinense in Sa Pa, Lao Cai. Research Methods The study utilized 20 accessions of D. tonkinense collected from various provinces in Vietnam. The accessions were marked as M1 to M20 and planted at Sa Pa Research Centre of Medicinal Materials for evaluation purposes. The research encompassed experiments to evaluate biological and agronomical traits, assess self- incompatibility traits, improve fruiting ratio, sexual and asexual propagation by rhizome and root cutting, and cultivation practices (planting seasonals, distances, fertilizer amounts, and shading canopy). One-factor or two-factor experiments were conducted following the Randomized Complete Block Design with three replications. To identify scientific names, morphological comparison (Nguyen Nghia Thin, 2009) was conducted at the Center of Medicinal Resources, National Institute of Medicinal Materials, along with nrDNA-ITS (ITS region) sequence analysis at Vietnam National Museum of Nature and Institute of Genome Research. Anatomical assessments were conducted at Sa Pa Research Center of Medicinal Materials, Center of Medicinal Resources, and Faculty of Analysis and Standard Chemical, National Institute of Medicinal Materials. The genetic diversity of 20 accessions of D. tonkinense was evaluated using ISSR and RAPD markers. PCR technique was employed to assess genetic diversity using 24 ISSR markers and 11 RAPD markers, performed by a PCR machine (Eppendorf) at the Department of Plant Biotechnology, Vietnam National University of Agriculture. The quality of D. tonkinense medicinal materials was analyzed using High- performance Liquid Chromatography (HPLC) according to Vietnam Pharmacopoeia V xiv
(2017) and Zhang et al. (2014) at the Faculty of Analysis and Standard Chemical, National Institute of Medicinal Materials. The study was implemented over a period of five years, from 2017 to 2022. Main findings and conclusions The study investigated the agro-biological characteristics of 20 accessions collected from various provinces in Vietnam and determined that all of them belonged to the Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe species. The accessions displayed high genetic diversity, with genetic similarity coefficients ranging from 0.69 to 0.79, as evaluated by the ISSR and RAPD markers. Based on their agro-biological features, the M13 accession, collected from Vi Xuyen district, Ha Giang province, was identified as having good growth and development characteristics, with a yield of 11.75 quintals/ha and a podophyllotoxin content of 3.51% for medicinal material production in Sa Pa district, Lao Cai province. The optimal propagation techniques for D. tonkinense were identified as follows: for seed propagation, seeds were extracted from the aril, washed, dried, and sown to achieve high sprouting rates. For sexual propagation, rhizome cuttings consisting of three segments were taken from the top of the underground stem in May, resulting in the highest percentage of sprouting. An effective technique for asexual propagation involves inducing adventitious bud regeneration from roots separated from the rhizome. Root explants of approximately 15 cm in length, obtained by cutting the distal end of the root in May, should be treated with BA (benzyladenine) at a concentration of 10 ppm for 2 hours, followed by treatment with GA3 (gibberellic acid) at a concentration of 175 ppm for 2 hours. This protocol has been found to yield favorable results in terms of propagation efficiency. In addition, appropriate cultivation methods for D. tonkinense were established: the best planting season was in November, with a planting density of 62,000 plants/ha and a fertilizer amount of 20 tons of manure + 70 kg N + 140 kg P 2O5 + 70 kg K2O. A shading canopy of 60% direct light was found to be suitable. xv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) là loài cây thuốc quý hiếm thuộc chi Dysosma Woodson được sử dụng trong y học cổ truyền của Việt Nam để chữa rắn cắn, ung nhọt, và làm thuốc giải độc, tiêu phù (Đỗ Tất Lợi, 2004; Đỗ Huy Bích & cs., 2006). Thân ngầm và rễ của cây Bát giác liên chứa các hợp chất hóa học thuộc nhóm flavonoid và nhóm lignan (Nguyễn Thị Dung, 2018) trong đó podophyllotoxin (Tan & cs., 2018; Wang & cs., 2019; Karuppaiya & Tsay, 2019; Karuppaiya & Wu, 2020; Bui Van Thanh & cs., 2022), các dẫn xuất và các chất bán tổng hợp từ podophyllotoxin (Shah & cs., 2021) đều là những chất có hoạt tính sinh học cao, đã được nghiên cứu phát triển thành các loại thuốc chữa bệnh sử sụng trong y học có thị trường lớn. Điển hình là nhóm thuốc chữa mụn cóc sinh dục, sùi mào gà (Warts) có giá trị thương mại rất cao, đạt trên 1,6 tỷ USD vào năm 2021 và ước đạt giá trị khoảng 2,3 tỷ USD vào năm 2028 (Coherent Market Insight, 2021; Data Bridge Market Research, 2022). Dạng thuốc etoposide dùng để điều trị cho người bệnh ung thư và người bệnh Covid-19 có hội chứng cơn bão cytokine cũng có giá trị thương mại cao, đạt 639,3 triệu USD vào năm 2021 và ước đạt 896,6 triệu USD vào năm 2027 (Maximize Market Research, 2021). Với giá trị về mặt y học cũng như giá trị kinh tế rất lớn của hoạt chất được chiết xuất từ dược liệu như trên, Bát giác liên là đối tượng cây thuốc có tiềm năng cao để phát triển trồng sản xuất. Mặc dù là nguồn gen cây thuốc quý, nhưng do khai thác quá mức và thiếu kiểm soát trong thời gian dài dẫn đến suy giảm nghiêm trọng trữ lượng cây Bát giác liên trong tự nhiên. Đặc biệt là tình trạng chặt phá rừng đã ảnh hưởng trực tiếp, làm suy giảm môi trường sống của chúng. Do đó Bát giác liên đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (2007) và Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (2019) với mức đánh giá nguy cấp (EN); hạn chế khai thác với mục đích thương mại, khuyến cáo bảo tồn nguyên vị và thu thập nguồn gen để nhân giống, bảo tồn chuyển vị tại các cơ sở có chức năng, đảm bảo sự an toàn cho nguồn gen cây thuốc quý hiếm này. Những nghiên cứu về loài Bát giác liên ở Việt Nam còn ít và tập trung chủ yếu vào thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các hoạt chất được chiết từ dược liệu. Đối với vấn đề xác định loài, Lê Thị Thu Hiền & cs. (2018) đã thu thập được một số mẫu Bát giác liên tại khu vực Vườn Quốc gia Hoàng liên để nghiên cứu trình tự vùng gen ITS, 18S và xác định chúng có quan hệ gần với loài 1
D. difformis với mức tương đồng về kiểu gen trung bình là 98,7% và giá trị boostrap thấp là 67. Nghiên cứu cũng đã cho rằng đây có thể là loài riêng biệt thuộc chi Dysosma Woodson hoặc do ảnh hưởng của vùng phân bố. Theo Thực vật chí Trung Quốc và một số quan điểm khác lại cho rằng loài D.tonkinense có phân bố tự nhiên ở khu vực miền núi phía Bắc của Việt Nam là đồng danh của loài D.difformis và D.versipellis có tại Trung Quốc. Cho nên việc xác định tên khoa học cho loài Bát giác liên có phân bố ở Việt Nam là rất cần thiết. Đối với nghiên cứu về đa dạng di truyền, Lưu Thúy Hòa & cs. (2018) đã thu thập một số mẫu Bát giác liên ở vùng sinh thái Đông Bắc và đánh giá mức độ đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD. Để có cái nhìn bao quát hơn về đa dạng di truyền của nguồn gen Bát giác liên ở Việt Nam cần mở rộng phạm vi thu thập mẫu tại các khu vực khác có phân bố tự nhiên và trồng trọt cây Bát giác liên. Đồng thời sử dụng thêm những chỉ thị phân tử khác, điển hình như chỉ thị ISSR là chỉ thị đã được sử dụng phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền các loài Bát giác liên tại Trung Quốc. Về lĩnh vực phát triển trồng trọt, loài Bát giác liên (D.tonkinense) đã được thu thập trồng bảo tồn tại một số đơn vị trong mạng lưới quỹ gen cây thuốc thuộc Viện Dược liệu như Trung tâm nghiên cứu dược liệu Sa Pa, Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Tam Đảo. Một số khu bảo tồn thiên nhiên và Vườn Quốc gia nơi có cây Bát giác liên phân bố tự nhiên như KBTTN Bát Đại Sơn (Hà Giang), KBTTN Na Hang (Tuyên Quang), VQG Hoàng Liên (Lào Cai)...cũng đã quan tâm đến công tác bảo tồn loài cây thuốc quý này. Bên cạnh đó, để thu dược liệu làm thuốc theo kinh nghiệm truyền thống, cây Bát giác liên đã được người dân thu hái trong tự nhiên và trồng trọt tại vườn nhà và vườn rừng với quy mô nhỏ. Cho đến nay nghiên cứu có hệ thống về các biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng trọt cây Bát giác liên (D.tonkinense) ở trong nước cũng như trên Thế giới còn rất hạn chế. Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, việc thực hiện nghiên cứu để cung cấp những dẫn liệu khoa học về đặc điểm nông sinh học, đa dạng di truyền nguồn gen làm cơ sở tuyển chọn mẫu giống Bát giác liên có năng suất cao, chất lượng dược liệu tốt. Đồng thời nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng trọt cây thuốc Bát giác liên phục vụ cho mục đích phát triển sản xuất dược liệu là hết sức cần thiết. 1.2. MỤC TIÊU 1.2.1. Mục tiêu chung Nghiên cứu góp phần xác định được 1-2 mẫu giống Bát giác liên có năng suất, chất lượng dược liệu cao và đề xuất biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng cây Bát giác liên phù hợp tại Sa Pa, Lào Cai. 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Thu thập và đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống Bát giác liên, từ đó chọn ra được 1-2 mẫu giống có tiềm năng về năng suất và chất lượng tốt phục vụ công tác phát triển dược liệu Bát giác liên tại Sa Pa, Lào Cai; - Từ mẫu giống Bát giác liên đã chọn lọc: + Xác định được một số biện pháp kỹ thuật nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính cây Bát giác liên; + Xác định được một số biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên tại Sa Pa, Lào Cai. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Các mẫu giống Bát giác liên được thu thập ở Việt Nam từ năm 2014 đến năm 2017 và trồng đánh giá tại Trung tâm nghiên cứu dược liệu Sa Pa. 1.3.2. Địa điểm thực hiên nghiên cứu - Đánh giá đặc điểm hình thái, sinh trưởng, phát triển, nhân giống và trồng các mẫu giống Bát giác liên được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu dược liệu Sa Pa - Viện Dược liệu; - Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu cơ quan sinh dưỡng và sinh sản của các mẫu giống Bát giác liên được thực hiện tại Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Trung tâm Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu; - Nghiên cứu về phân loại các mẫu giống Bát giác liên dựa trên trình tự vùng gen ITS được thực hiện tại Bảo tàng Thiên Nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; - Nghiên cứu đa dạng di truyền các mẫu giống Bát giác liên được thực hiện tại Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; - Đánh giá hàm lượng podophyllotoxin trong dược liệu các mẫu giống Bát giác liên tại Khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn - Viện Dược liệu. 1.3.3. Thời gian thực hiện Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2017 đến năm 2022. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Từ 20 mẫu giống Bát giác liên (D.tonkinense) thu thập, đã xác định được các đặc điểm nông sinh học, đa dạng di truyền giữa các mẫu giống và tuyển chọn được mẫu giống Bát giác liên M11 thu tại Vị Xuyên - Hà Giang. Mẫu giống này có đặc điểm thân ngầm dạng chuỗi với các đốt hình trụ dẹt; thân khí sinh màu xanh nhạt, mặt trên phiến lá có vết loang hình đa giác màu nâu đỏ, tràng hoa màu 3