Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:235

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm điều chế được alginate khối lượng phân tử thấp từ rong nâu thu mẫu tại vịnh Nha Trang, có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG ĐÔNG MÁU LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG ĐÔNG MÁU Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 9540105 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. VŨ NGỌC BỘI 2. PGS. TS. TRẦN THỊ THANH VÂN KHÁNH HÒA - 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Một số kết quả trong luận án này được tài trợ kinh phí từ Đề tài hợp tác quốc tế: “Polysaccharide sulfate từ tảo nâu Việt Nam: Cấu trúc và hoạt tính sinh học”, Mã số: VAST.HTQT.NGA. 06/13-14, thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Liên bang Nga, Đề tài “Cấu trúc và hoạt tính sinh học của một vài ionic Polysaccharide chiết tách từ tảo biển ở Nhật Bản và Việt Nam”, Mã số: VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15, thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Nhật Bản và Đề tài: “Nghiên cứu điều chế dẫn xuất polyguluronat sunphat hóa trọng lượng phân tử thấp từ nguồn rong mơ Việt Nam để ứng dụng trong dược phẩm”, Mã số: VAST06.05/12-13 mà tôi là một trong những thành viên tham gia thực hiện và đã được Chủ nhiệm đề tài đồng ý cho phép sử dụng trong báo cáo Luận án. Các kết quả, số liệu nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào. Khánh Hòa, Ngày tháng 3 năm 2019 NGHIÊN CỨU SINH NGUYỄN VĂN THÀNH i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này, Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, Lãnh đạo khoa Sau Đại học sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho các thầy: PGS. TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang và PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân - Nguyên Trưởng phòng Hóa phân tích - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Bùi Minh Lý - người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền cảm hứng, định hướng nghiên cứu cho tôi trong giai đoạn đầu thực hiện Luận án này. Vì lý do sức khỏe nên Thầy đã không thể tiếp tục hướng dẫn nghiên cứu. Xin chân thành cám ơn: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Chủ nhiệm đề tài quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA. 06/13-14, VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15 và VAST06.05/12- 13 đã hỗ trợ kinh phí để tôi hoàn thành Luận án có chất lượng. Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Kiên Giang đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được đi học và hoàn thành Luận án này. Xin chân thành cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quý báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Gia đình và bạn bè thân thiết đã giúp đỡ, chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Khánh Hòa, Ngày tháng 3 năm 2019 NGHIÊN CỨU SINH NGUYỄN VĂN THÀNH ii
MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... viii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................xi MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................4 1.1. NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .............................4 1.1.1. Giới thiệu chung về rong nâu ................................................................................4 1.1.2. Một số thành phần hóa học của rong nâu ..............................................................4 1.1.3. Tình hình sử dụng rong nâu trên thế giới ..............................................................6 1.1.4. Rong nâu Việt Nam ...............................................................................................7 1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE ...............................................................................9 1.2.1. Giới thiệu về alginate ............................................................................................9 1.2.2. Cấu trúc và tính chất hóa học của alginate ..........................................................10 1.2.3. Kỹ thuật tách chiết alginate từ rong nâu ..............................................................13 1.3. ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP ................................ 20 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới điều chế alginate khối lượng phân tử thấp ............20 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước điều chế alginate khối lượng phân tử thấp ..............25 1.4. ỨNG DỤNG CỦA ALGINATE VÀ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 28 1.5. QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA ALGINATE ...................................................................................................................32 1.5.1. Lý thuyết của quá trình đông máu .......................................................................32 1.5.2. Các nghiên cứu hoạt tính chống đông máu của alginate .....................................35 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............39 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................................39 2.1.1. Rong mơ nguyên liệu ..........................................................................................39 2.1.2. Nguyên vật liệu dùng cho xác định độc chất trên chuột .....................................41 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................41 2.2.1. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu ....................................................................41 2.2.2. Các phương pháp phân tích fucoidan và sodium alginate ...................................41 2.2.3. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học cơ bản của rong nâu ...............44 iii
2.2.4. Phương pháp đánh giá chất lượng alginate: ........................................................44 2.2.5. Phương pháp định lượng vi sinh vật ....................................................................44 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính chống đông máu và độc tính của SGS ............44 2.2.7. Phương pháp bố trí thực nghiệm .........................................................................47 2.3. HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG .............................58 2.4. PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ...........................................59 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................60 3.1. NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC LOÀI RONG NÂU DÙNG CHO SẢN XUẤT FUCOIDAN VÀ SODIUM ALGINATE ......................................................................60 3.1.1. Đánh giá hàm lượng fucoidan và sodium alginate ở một số loài rong nâu .........60 3.1.2. Xác định thành phần hóa học cơ bản của rong nâu T. ornata .............................66 3.2. NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CÔNG ĐOẠN NẤU CHIẾT SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU T. ORNATA .......................................................................................70 3.3. NGHIÊN CỨU THU NHẬN SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SODIUM ALGINATE ...............................................................83 3.3.1. Nghiên cứu xác định nồng độ ethanol kết tủa thu nhận sodium alginate ............83 3.3.2. Đề xuất quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T. ornata .....................84 3.3.3. Sản xuất thử và đánh giá chất lượng sản phẩm sodium alginate .........................87 3.3.4. Xác định khối lượng phân tử trung bình của sodium alginate ............................89 3.3.5. Xác định các đặc tính cấu trúc của sodium alginate thu nhận từ rong T. ornata 92 3.4. NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP ........................................................................................................104 3.4.1. Xác định hàm lượng các sodium alginate khối lượng phân tử thấp ..................104 3.4.2. Xác định các đặc tính cấu trúc của các alginate khối lượng phân tử thấp ........107 3.4.3. Khối lượng phân tử trung bình của alginate khối lượng phân tử thấp ..............112 3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM GULURONATE SULFATE (SGS) TỪ SODIUM ALGINATE TÁCH CHIẾT TỪ RONG T.ORNATA VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SGS ................................................................................................115 3.5.1. Nghiên cứu điều chế SGS từ sodium alginate tách chiết từ rong nâu T. ornata ....115 3.5.2. Đề xuất quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate của rong nâu T. ornata và đánh giá các đặc tính của SGS .............................................................................................126 3.6. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SGS ..........................................................................................................131 iv
3.6.1. Đánh giá hoạt tính chống đông máu in vitro của SGS ......................................131 3.6.2. Đánh giá độc tính của SGS trên chuột thí nghiệm ............................................137 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN..........................................................................147 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN........149 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................150 PHỤ LỤC v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APTT : Activated partial thromboplastin time (Thời gian đông máu nội sinh) cP : Centipoise (đơn vị đo độ nhớt) DS : Degree of substitution (Độ thay thế) FT-IR : Fourrier Transformation InfraRed spectroscopy (Quang phổ hồng ngoại) G : Guluronate (guluronic acid) GPC : Gel Permeation Chromatography (Sắc ký thẩm thấu gel) IR : InfraRed spectroscopy (Phổ hồng ngoại) M : Mannuronate (mannuronic acid) NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) PT : Prothrombin time (Thời gian đông máu ngoại sinh) SG : Sodium guluronate SGS : Sodium guluronate sulfate SM : Sodium mannuronate S. mcclurei : Sargassum mcclurei SMG : Sodium mannuronate - sodium guluronate S. polycystum : Sargassum polycystum TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam T. ornata : Turbinaria ornata TT : Thrombin time (Thời gian đông máu chung) v : Volume (Thể tích) w : Weight (Khối lượng) vi
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thiết kế nghiên cứu độc tính của SGS ..........................................................46 Bảng 2.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính của SGS ...............46 Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của rong nâu T. ornata .....................................67 Bảng 3.2. Điều kiện thí nghiệm được chọn ...................................................................70 Bảng 3.3. Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I ................................................71 Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo hàm lượng sodium alginate ..................75 Bảng 3.5. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo độ nhớt sodium alginate .......................80 Bảng 3.6. Hệ số của phương trình hàm đa mục tiêu .....................................................81 Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm tối ưu hàm đa mục tiêu ..................................................82 Bảng 3.8. Trạng thái chất lượng của sodium alginate ...................................................87 Bảng 3.9. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu lý hóa của sodium alginate......................88 Bảng 3.10. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh của sodium alginate ...................88 Bảng 3.11. Kết quả phổ IR của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ........................93 Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của sodium alginate từ rong T. ornata ...96 Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của sodium alginate từ rong T. ornata ....98 Bảng 3.14. Tương tác proton từ phổ 1H-1H COSY của sodium alginate từ rong Turbinaria ornata ........................................................................................................100 Bảng 3.15. Khối lượng trung bình của chuột nhóm I (đánh giá độc tính cấp) ............138 Bảng 3.16. Khối lượng trung bình của chuột nhóm II (giai đoạn hồi phục) ...............139 Bảng 3.17. Tổng hợp kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm I .............................141 Bảng 3.18. Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm II ...........................................142 Bảng 3.19. Kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu .......................................143 Bảng 3.20. Kết quả quan sát xác định khối lượng tươi của gan, lách, thận của chuột thí nghiệm .........................................................................................................................144 vii
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Liên kết (14) glycosidic giữa các uronic ...................................................11 Hình 1.2. Cấu trúc 2 gốc uronic trong phân tử alginate ................................................11 Hình 1.3. Độ dài trung bình giữa các uronic trong các block của alginate ...................11 Hình 1.4. Sự sắp xếp các block polysaccharide trong phân tử alginate ........................12 Hình 1.5. Các giai đoạn của quá trình đông máu ..........................................................33 Hình 1.6. Cơ chế tạo thành phức hợp prothrombinase theo con đường nội sinh và ngoại sinh.................................................................................................................................34 Hình 2.1. Hình ảnh về rong mơ Sargassum mcclurei Setchell .....................................39 Hình 2.2. Hình ảnh về rong mơ Sargassum polycystum C. Agardh .............................39 Hình 2.3. Hình ảnh về rong cùi bắp Turbinaria ornata (Turner) J. Agardh .................39 Hình 2.4. Vị trí thu mẫu rong mơ ..................................................................................39 Hình 2.5. Sơ đồ cách thức tiếp cận các nội dung nghiên cứu của luận án ...................47 Hình 2.6. Sơ đồ sàng lọc loài rong nâu .........................................................................49 Hình 2.7. Sơ đồ tối ưu hóa công đoạn nấu chiết sodium alginate .................................50 Hình 2.8. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol kết tủa sodium alginate .....51 Hình 2.10. Sơ đồ điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp ...........................52 Hình 2.10. Phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa.......................................................53 Hình 2.11. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS .........................................................................................54 Hình 2.12. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS .........................................................................................54 Hình 2.13. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS ....................................................................55 Hình 2.14. Phản ứng tổng hợp sodium guluronate sulfate ............................................55 Hình 2.15. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS .........................................................................................................................56 viii
Hình 2.16. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS .........................................................................................................................57 Hình 2.17. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaNO2/SG phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS............................................................................................................57 Hình 2.18. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS ................................................................................................................................ 58 Hình 3.1. Sự biến đổi hàm lượng fucoidan ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu ..60 Hình 3.2. Sự biến đổi hàm lượng sodium alginate ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu ................................................................................................................................ 64 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng sodium alginate thu được sau kết tủa ............................................................................................................................83 Hình 3.4. Sơ đồ quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T. ornata ..................85 Hình 3.5. Sắc ký đồ GPC của sodium alginate .............................................................90 Hình 3.6. Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium alginate ....................................90 Hình 3.7. Phổ hồng ngoại của sodium alginate từ rong nâu T. ornata..........................92 Hình 3.8. Phổ ESI-MS của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ..............................93 Hình 3.9. Phổ ESI-MS của disaccharide tại m/z 369 ....................................................94 Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của sodium alginate từ rong nâu T. ornata .........................95 Hình 3.11. Phổ 1H -NMR của sodium alginate thu được từ rong nâu T. ornata ..........97 Hình 3.12. Phổ COSY của sodium alginate từ rong nâu T. ornata .............................100 Hình 3.13. Phổ HSQC của sodium alginate từ rong nâu T. ornata .............................101 Hình 3.14. Phổ HMBC của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ............................102 Hình 3.15. Phổ ROESY của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ..........................103 Hình 3.16. Tương tác của các proton trên phổ ROESY của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ......................................................................................................................104 Hình 3.17. Hàm lượng các sodium alginate khối lượng phân tử thấp.........................105 Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của sodium guluronate .......................................................107 Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của sodium guluronate ........................................................109 Hình 3.20. Phổ 13C-NMR của sodium polymannuronate ............................................110 ix
Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của sodium polymannuronate .............................................111 Hình 3.22. Sắc ký đồ của GPC của sodium guluronate ..............................................112 Hình 3.23. Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium guluronate ............................112 Hình 3.24. Sắc ký đồ của GPC của sodium mannuronate ...........................................114 Hình 3.25. Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium mannuronate ........................114 Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS .................................................................................................................116 Hình 3.27. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS .................................................................................................................118 Hình 3.28. Ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 của phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS .......................................................................................119 Hình 3.29. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS ...121 Hình 3.30. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS.....122 Hình 3.31. Ảnh hưởng tỷ lệ nồng độ NaNO2/SG đến độ thay thế của SGS ...............123 Hình 3.32. Ảnh hưởng của pH phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS .............125 Hình 3.33. Quy trình điều chế sodium guluronate sulfate...........................................127 Hình 3.34. Phổ FT-IR của (a) sodium guluronate và (b) sodium guluronate sulfate ..129 Hình 3.35. Sắc ký đồ GPC của SGS ............................................................................130 Hình 3.36. Sự phân bố khối lượng phân tử của SGS ..................................................130 Hình 3.37. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử trung bình của SGS đến thời gian đông máu ..............................................................................................................................132 Hình 3.38. Ảnh hưởng của nồng độ SGS có khối lượng phân tử trung bình 25 kDa đến thời gian đông máu ......................................................................................................134 Hình 3.39. Hình ảnh vi thể của gan, lách, thận chuột lang uống SGS ........................145 x
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: Nguyễn Văn Thành Khóa: 2012 Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. Vũ Ngọc Bội 2. PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất alginate và alginate khối lượng phân tử thấp từ rong mơ: 1) Luận án đã xác định được 3 loài rong mơ S. mcclurei, S. polycystum và T. ornata có hàm lượng fucoidan cao nhất khi thu hoạch vào các tháng 4 và tháng 5. Ngoài ra, 2 loài rong nâu S. mcclurei và T. ornata có hàm lượng alginate đạt cao nhất khi thu hoạch vào tháng 4 và loài S. polycystum có hàm lượng alginate đạt cao nhất khi thu hoạch vào tháng 5. Trong số 3 loài rong đã nghiên cứu thì T. ornata là loài thích hợp dùng làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất đồng thời cả fucoidan và alginate. 2) Luận án đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình nấu chiết sodium alginate có độ nhớt cao từ rong mơ T. ornata: dung dịch nấu chiết có pH thích hợp là 11 (điều chỉnh bằng Na2CO3), nhiệt độ nấu chiết thích hợp là 59oC và thời gian nấu chiết là 1,5 giờ, nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa sodium alginate từ dịch chiết là 70%. Sodium alginate sản xuất từ rong mơ T. ornata có độ tinh sạch cao, có tỷ lệ M/G là 1,06 và có khối lượng phân tử trung bình 648,32 kDal, độ polymer hóa phân tử trung bình là 1037, chỉ số đa phân tán là 3,56 với hiệu suất nấu chiết đạt 87,93%. Sản phẩm sodium alginate sản xuất theo quy trình đạt tiêu chuẩn cảm quan, hóa học và vi sinh vật theo quy định hiện hành của Bộ Y tế. 3) Luận án đã điều chế được sodium alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp thủy phân bằng acid. Sản phẩm sodium alginate khối lượng phân tử thấp thu được bao gồm sodium guluronate chiếm 49,17 ± 1,21%, sodium mannuronate chiếm 38,13 ± 1,16% và sodium guluronate - mannuronate chiếm 3,96 ± 1,08%. Sodium guluronate và sodium mannuronate thu được đều có độ tinh sạch cao, có khối lượng xi
phân tử trung bình tương ứng là 21,661 kDa và 33,759 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình tương ứng là 89 và 128, chỉ số đa phân tán tương ứng là 1,38 và 1,49. 4) Luận án đã xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình điều chế SGS như sau: các điều kiện của phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa là: tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 là 4,25/1 mol/g, nhiệt độ phản ứng 90oC và thời gian phản ứng 90 phút; các điều kiện của quá trình tổng hợp SGS là: pH = 9, tỷ lệ nồng độ tác nhân sulfate hóa/sodium guluronate là 2/198 mol/g, nhiệt độ phản ứng là 40oC và thời gian phản ứng tổng hợp là 4 giờ. Từ đó, xây dựng được quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate của rong nâu T. ornata. Chế phẩm SGS sản xuất theo quy trình có độ tinh sạch cao, có khối lượng phân tử trung bình 25,408 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình là 107, chỉ số đa phân tán là 1,35. 5) Kết quả đánh giá hoạt tính chống đông máu của SGS cho thấy hoạt tính chống đông máu phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình và nồng độ của SGS. Chế phẩm SGS có tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) và thời gian đông máu chung (TT), nhưng tác dụng kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT) không đáng kể. Bên cạnh đó, SGS không độc đối với chuột thí nghiệm. Do vậy, chế phẩm SGS có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu ở người. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH PGS. TS. Vũ Ngọc Bội PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân Nguyễn Văn Thành xii
MỞ ĐẦU Rong biển là một nguồn lợi sinh vật biển tự nhiên, quý giá đã và đang được sử dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và một số ngành công nghiệp khác. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc, sản lượng thu hoạch rong biển của thế giới đạt 25 triệu tấn tươi/năm, khoảng 80% sản lượng rong biển thế giới được cung cấp từ các nước châu Á Thái Bình Dương. Trong nguồn lợi rong biển, ngành rong râu có giá trị cao, với tổng giá trị thương mại rong nâu khô trên toàn thế giới hằng năm vào khoảng trên 300 triệu đô la. Hàng năm, ngành công nghiệp chế biến rong biển sản xuất ra nhiều loại sản phẩm với giá trị vào khoảng 6,4 tỷ đô la [75]. Trong đó, các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ rong biển có giá trị khoảng 5 tỷ đô la và ngày càng có xu hướng tăng [186]. Việt Nam có hơn 3200 km bờ biển trải dài từ Bắc vào Nam với diện tích mặt nước biển hơn 1 triệu km2. Biển Việt Nam có nguồn tài nguyên rong nâu khá đa dạng và phong phú, với hơn 120 loài đã được phân loại, sản lượng thu hoạch rong nâu ước đạt 35 nghìn tấn khô/năm [206]. Rong nâu có một số loại polysaccharide có giá trị như alginate, laminaran, fucoidan, ... Do vậy, chúng được coi là nguồn nguyên liệu quý giá để sản xuất dược phẩm [182], thực phẩm chức năng [191] và mỹ phẩm [220]. Trong rong nâu, hàm lượng fucoidan chiếm khoảng 4 ÷ 8% khối lượng rong khô [18]. Fucoidan là polysaccharide sulfate có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý như hoạt tính chống đông máu [228], kháng khối u [218], kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV) [121], chống ung thư [20, 69], chống viêm khớp, viêm nhiễm [124], giảm cholesterol máu [190]. Ở nước ta, hiện nay bên cạnh thu hoạch rong nâu để làm phân bón hoặc bán dưới dạng nguyên liệu thô cho thương lái nước ngoài, rong nâu còn được dùng để sản xuất fucoidan thô với sản lượng ước đạt khoảng 400 ÷ 800 tấn/năm [18]. Sau khi sản xuất fucoidan, phần bã rong nâu còn lại chỉ dùng làm phân bón hoặc bỏ đi trong khi phần bã rong vẫn còn chứa alginate với hàm lượng cao. Do vậy, cần sử dụng rong nâu để thu nhận đồng thời fucoidan và alginate nhằm hạn chế sự lãng phí tài nguyên biển. Hàm lượng alginate ở rong nâu có thể chiếm tới 40% khối lượng rong khô [194]. Hiện alginate được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [194], [209, [213]. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy alginate khối lượng phân tử thấp có nhiều hoạt tính sinh học quý giá hơn hẳn alginate khối lượng phân tử lớn. Alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống 1
oxy hóa (anti-oxidant) [73], [117], kháng viêm (anti-inflammatory) [224], [241], chống dị ứng (anti-allergy) [227], kháng khuẩn (anti-bacteria) [41], [232], chống béo phì (anti- obesity) [110], chống đông máu (anti-coagulant) [60], [181], [229], [230], kháng ung thư (anti-cancer) [59], ngăn ngừa tăng huyết áp (anti-hypertensive) [52], giảm cholesterol và giảm lượng đường huyết [172]. Nhiều nghiên cứu còn cho thấy alginate không có hoạt tính chống đông máu, nhưng alginate sulfate (alginate được sulfate hóa) nhất là alginate sulfate khối lượng phân tử thấp lại có khả năng tương thích cao với máu do có cấu trúc tương tự như cấu trúc của heparin và có hoạt tính chống đông máu [37], [240]. Hoạt tính chống đông máu của alginate sulfate phụ thuộc vào khối lượng phân tử, tỷ lệ M/G, trình tự sắp xếp các uronic,… [136]. Ngày nay các nhà khoa học tập trung nghiên cứu alginate sulfate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu nhằm ứng dụng trong y dược và thực phẩm chức năng [151], [191]. Hiện chưa có một công trình nào công bố nghiên cứu về alginate sulfate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu từ rong nâu Việt Nam. Do vậy, việc “Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu” từ rong nâu Việt Nam là cần thiết. * Mục tiêu chính của luận án: Điều chế được alginate khối lượng phân tử thấp từ rong nâu thu mẫu tại vịnh Nha Trang, có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng. * Mục tiêu cụ thể của luận án: 1) Xác định được loài rong nâu thu mẫu tại vịnh Nha Trang dùng làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất fucoidan và alginate. 2) Thu nhận được alginate từ rong nâu và đánh giá chất lượng alginate đã thu nhận được. 3) Điều chế được alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu từ alginate thu nhận từ rong nâu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng. * Nội dung nghiên cứu của luận án: 1) Nghiên cứu sàng lọc nguyên liệu rong nâu thích hợp dùng cho cho sản xuất fucoidan và alginate. 2) Nghiên cứu tối ưu hóa công đoạn nấu chiết alginate từ rong nâu và đánh giá chất lượng alginate đã sản xuất. 2
3) Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp và xác định các đặc tính của alginate khối lượng phân tử thấp. 4) Nghiên cứu quy trình sản xuất sodium guluronate sulfate (SGS) từ alginate của rong nâu T. ornata và đánh giá các đặc tính của SGS. 5) Đánh giá in vitro hoạt tính chống đông máu và đánh giá độc tính của SGS đã sản xuất. * Ý nghĩa khoa học của luận án: Lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án xây dựng được quy trình điều chế alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu từ rong nâu Turbinaria ornata. Kết quả nghiên cứu của luận án tạo dữ liệu khoa học mới về khối lượng phân tử, cấu trúc của alginate và alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu. Đồng thời, kết quả nghiên cứu của luận án tạo bộ dữ liệu khoa học mới được nghiên cứu một cách có hệ thống, có giá trị tham khảo cho các nhà nghiên cứu, giảng viên, sinh viên và doanh nghiệp chế biến Thủy sản nghiên cứu, sản xuất alginate và alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng. * Ý nghĩa thực tiễn của luận án: Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ nâng cao hiệu quả khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên rong nâu dồi dào của Việt Nam. Mặt khác, kết quả nghiên của luận án tạo ra một sản phẩm mới và quy trình chuẩn cho điều chế alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu để doanh nghiệp lựa chọn dùng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe cộng đồng, nâng cao giá trị nguồn nguyên liệu rong nâu, góp phần tạo công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo và nâng cao chất lượng cuộc sống cho cư dân ven biển. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1. Giới thiệu chung về rong nâu Rong nâu là nhóm thực vật đa bào, tự dưỡng, thuộc ngành tảo nâu Phaeophyta [4]. Rong nâu có chứa các sắc tố là diệp lục a, diệp lục c, Xanthophyll, carotene và fucoxanthin (đây là loại sắc tố có màu nâu, không tan trong nước và chỉ có ở rong nâu). Vì vậy, rong nâu có nhiều màu sắc khác nhau (nâu đậm, nâu vàng) và mầu sắc của rong nâu phụ thuộc vào thành phần và tỷ lệ các sắc tố trên [15]. Trên thế giới đã tìm thấy khoảng 2060 loài rong nâu [187], trong đó trên 95% loài rong có nguồn gốc ở biển [221]. Đa số loài rong nâu phân bố chủ yếu ở vùng biển nhiệt đới, trong đó bộ Fucales là phổ biến nhất và có giá trị kinh tế hơn cả, mà đại diện là họ Sargassaceae với hai chi Sargassum và Turbinaria [138]. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc, tính theo sản lượng của 3 ngành rong chủ yếu (rong nâu - Phaeophyta; rong đỏ - Rhodophyta và rong lục - Chlorophyta) thì Trung Quốc là nước có sản lượng thu hoạch rong nâu lớn nhất thế giới với trên 667 nghìn tấn rong khô/năm (chủ yếu 3 chi chính là Laminaria, Udaria, Ascophyllum). Tiếp theo là Hàn Quốc với sản lượng khoảng 96 nghìn tấn rong khô/ năm (với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria). Sản lượng thu hoạch rong nâu của Nhật Bản đứng thứ ba trên thế giới và đạt vào khoảng 51 nghìn tấn rong khô/ năm (với 3 chi Laminaria, Udaria, Cladosiphon). Các nước Na Uy và Chile có sản lượng thu hoạch rong nâu tương ứng khoảng 40 nghìn tấn rong khô/ năm và 27 nghìn tấn rong khô/ năm. Tổng giá trị thương mại của rong nâu khô trên toàn thế giới hằng năm đạt trên 300 triệu USD [75]. 1.1.2. Một số thành phần hóa học của rong nâu Thành phần chủ yếu trong thành tế bào rong nâu là các anionic polysaccharide như alginate, fucoidan, fucin [173] và phlorotannin [83]. Hàm lượng các thành phần hóa học của rong nâu thay đổi tùy theo loài rong, mùa vụ, vị trí cơ thể rong, điều kiện môi trường, vị trí địa lý [118]. Hàm lượng carbohydrate ở rong nâu tương đối cao, có thể đạt đến 75% khối lượng rong khô đối với loài Eiseina bicyclis [125]. Trong đó, alginate có hàm lượng cao nhất, có thể đạt đến 40% so với khối lượng rong khô [194]. Hàm lượng alginate thay đổi tùy 4
theo loài rong, mùa vụ, thời kỳ sinh trưởng, vị trí địa lý [116]. Fucoidan có hàm lượng từ 4 ÷ 8% khối lượng rong khô, là polysaccharide sulfate có từ 20 ÷ 60% L-fucose gồm galactose, mannose, xylose, glucose và acid glucuronic [18]. Hàm lượng fucoidan ở rong nâu khác nhau tùy thuộc vào mùa vụ thu hoạch, điều kiện khí hậu, loài rong [118]. Hàm lượng mannitol chiếm tỷ lệ tương đối cao và thay đổi theo từng bộ phận của rong, loài rong, thời tiết, môi trường địa lý [244]. Chẳng hạn, đối với các họ rong Laminaria và Saccharina có hàm lượng mannitol từ 20 ÷ 30% khối lượng rong khô, nhưng với loài Ascophyllum nodosum thì hàm lượng mannitol chỉ khoảng 16% khối lượng rong khô [106]. Mannitol tan được trong alcol, dễ tan trong nước và có vị ngọt. Mannitol được ứng dụng tương đối rộng rãi trong các ngành công nghiệp sản xuất bánh kẹo, trong y học, thực phẩm và mỹ phẩm [225]. Mannitol được bổ sung vào thành phần của thực phẩm để tăng cường khả năng chống các chất có khả năng oxy hóa cơ thể [86]. Laminaran có hàm lượng từ 2 ÷ 30% khối lượng rong khô tùy theo loài rong, độ tuổi, vị trí trên cơ thể, mùa vụ [123]. Khả năng hòa tan của laminaran phụ thuộc vào loại M-Laminaran (gốc khử cuối gắn với mannitol) hay G-Laminaran (gốc khử cuối gắn với glucose) [246]. Laminaran có khả năng kháng u, chống đông máu, kháng ung thư [152]. Rong nâu có hàm lượng protein từ 3 ÷ 15% khối lượng rong khô [198], thấp hơn so với hàm lượng protein ở rong đỏ và rong lục (từ 10 ÷ 47% khối lượng rong khô) [137]. Hàm lượng protein và thành phần các amino acid trong rong nâu thay đổi theo loài rong, mùa vụ [198]. Hàm lượng lipid ở rong nâu thấp từ 1÷ 5% khối lượng rong khô [87]. So với thực vật trên cạn thì hàm lượng các acid béo không no (như omega 3 và omega 6) của rong nâu cao hơn rất nhiều. Chính vì thế, rong nâu có tác dụng phòng trị bệnh suy nhược cơ thể, viêm xương khớp, tiểu đường [158]. Thành phần và hàm lượng các acid béo trong rong phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, giống loài, mùa vụ, vị trí địa lý [153]. Hàm lượng các chất khoáng ở rong nâu cao gấp từ 10 ÷ 20 lần so với thực vật trên cạn, đặc biệt rất giàu calcium, potassium, phosphorus, magnesium và iodine [198]. Hằng ngày chỉ dùng với một lượng nhỏ rong nâu (khoảng 25 gam) có thể cung cấp đầy đủ nhu cầu về khoáng chất cho người trưởng thành [157]. Hàm lượng khoáng cũng thay đổi theo loài rong, thời kỳ sinh trưởng, vị trí địa lý [198]. 5
Rong nâu có các sắc tố rất có lợi cho sức khỏe con người, đặc biệt là nhóm chất carotenoid có chức năng là tiền vitamin A có tác dụng kháng viêm và kháng ung thư. Ngoài ra, hàm lượng fucoxanthin chiếm từ 3 ÷ 6% tổng hàm lượng carotenoid có trong rong nâu và là chất có khả năng chống oxy hóa, chống bệnh tiểu đường và béo phì, giúp làm trắng da [159]. Vitamin có trong rong nâu ở cả 2 dạng hòa tan trong nước và hòa tan trong dầu, gồm có beta-caroten, thiamin (B1), riboflavin, (B2), cobalamin (B12), acid ascorbic (C) [187]. Hàm lượng vitamin C ở rong nâu cao hơn các loài rong đỏ và rong lục [143]. Đặc biệt, trong rong nâu có cả α-, - và - tocopherol (vitamin E) (trong khi rong đỏ và rong lục chỉ có α-tocopherol) nên rong nâu có tác dụng chữa bệnh tim mạch và bảo vệ sức khỏe [78]. Hàm lượng vitamin ở rong nâu thay đổi phụ thuộc vào giống loài, thời kỳ sinh trưởng, điều kiện môi trường sống [44]. Các hợp chất phenolic trong rong nâu có tác dụng hỗ trợ tích cực cho sức khỏe con người [237], đặc biệt là phlorotannin. Phlorotannin chỉ có ở rong nâu, hàm lượng có thể lên đến 25% khối lượng rong khô, là hợp chất sinh học đã được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm [48]. Hàm lượng các hợp chất phenolic ở rong nâu phụ thuộc vào giống loài, vị trí địa lý, mùa vụ [147]. 1.1.3. Tình hình sử dụng rong nâu trên thế giới Rong nâu giàu protein, vitamin, carbohydrate, khoáng chất và amino acid nên các họ rong nâu như Durvillaea, Ecklonia, Fucus, Hizikia, Laminaria và Undaria đã được con người sử dụng làm thực phẩm từ rất xa xưa ở các nước phương Tây và phương Đông [143]. Chúng thường được sử dụng ở dạng tươi hoặc chế biến như salat, súp, sushi, muối chua, chất tạo đông, … hoặc trong các dạng bánh biscuit, snack và trà. Sử dụng rong nâu làm thực phẩm có độ an toàn cao đối với con người [119]. Bên cạnh đó, rong nâu còn được sử dụng với tỷ lệ bổ sung từ 5 ÷ 10% thay cho lượng protein trong thức ăn gia cầm, dùng làm thức ăn cho ngựa, cừu, heo, chim, bò sữa [71], [195]. Ngày nay, rong nâu đã được đưa vào sản xuất thực phẩm chức năng, đóng vai trò tích cực hỗ trợ và bảo vệ sức khỏe cho con người [191]. Trong các ngành công nghiệp, các họ rong nâu Ascophyllum, Laminaria, Macrocystis, Durvellia, Sargassum, Cystoseira và Ecklonia được sử dụng làm nguồn nguyên liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như fucoidan, mannitol, laminaran và alginate [91], [96], [213]. 6