Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thw biểu mô tuyến ở phổi

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:151

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi; đánh giá được tình trạng methyl một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột biến và biểu hiện protein EGFR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thw biểu mô tuyến ở phổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 942 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà 2. TS. BS. Nguyễn Phi Hùng Hà Nội – 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu, cộng tác với các nhà khoa học khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng như các hội nghị trong nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Quang Nguyễn Ngọc Quang
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Thầy không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận án là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. BS. Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K. Thầy đã luôn hướng dẫn, động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc tôi gặp khó khăn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Tạ Văn Tờ, TS. Vương Diệu Linh và các đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công Nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua. Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho bố mẹ, bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp tôi hoàn thành tốt luận án này. Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Quang
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4 1.1. Ung thư phổi......................................................................................................... 4 1.1.1. Thực trạng ung thư phổi .................................................................................... 4 1.1.2. Phân loại ung thư phổi ...................................................................................... 6 1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi ............................................................................... 7 1.2. Ung thư biểu mô tuyến của phổi .......................................................................... 9 1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến ....................................................................... 9 1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến ................................ 11 1.3. Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi ............................................................. 13 1.3.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR ................................................................... 13 1.3.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi .......................................................... 15 1.3.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi ................................................... 17 1.4. Methyl hóa DNA trong ung thư phổi ................................................................. 17 1.4.1. Methyl hóa DNA ............................................................................................. 17 1.4.2. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong ung thư phổi ...................................................................................................... 20 1.5. Điều trị đích trong ung thư và ung thư phổi....................................................... 29 1.5.1. Điều trị đích trong ung thư .............................................................................. 29 1.5.2. Điều trị đích trong ung thư phổi ...................................................................... 31 1.6. Phương pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thư phổi ............................. 33 1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi ................................ 33 1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi ........................ 35 1.7. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thư phổi ở Việt Nam ....................... 37 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................... 39 2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 39 2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................... 39 2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 39 2.2. Thiết bị chính ..................................................................................................... 42 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 43
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA ...................................... 43 2.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số ..................................................................... 44 2.3.3. Phương pháp PCR ........................................................................................... 44 2.3.4. Phương pháp điện di ....................................................................................... 47 2.3.5. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR ..................................................... 47 2.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ......................................................... 48 2.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M.sssI ......................... 49 2.3.8. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học ............................................................. 50 2.4. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................................ 50 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ ...................................................................................... 51 3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu ........................................................................ 51 3.2. Đột biến và biểu hiện gen EGFR ....................................................................... 52 3.2.1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ...................... 52 3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân.............. 56 3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi ................................................................................................................... 59 3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ................ 59 3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân .............. 61 3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ............... 63 3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân ...................... 65 3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ........... 66 3.4. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi ................................................... 68 3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR..................... 68 3.4.2. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ................................................. 71 3.4.3. Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi ............................................................................................ 74 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ...................................................................................... 76 4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi..... 76 4.1.1. Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR ...................................... 76
4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR ............................................................ 78 4.1.3. Methyl hóa vùng promoter EGFR .................................................................. 80 4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR ........................................ 81 4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi .............................................................. 83 4.2.1. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 .......................................................... 83 4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT .......................................................... 84 4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1 ........................................................... 86 4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A ...................................................... 87 4.3. Tương quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến của phổi ................................................................................................................... 88 4.3.1. Đột biến EGFR với sự methyl hóa quá mức các gen ức chế khối u ............... 88 4.3.2. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u ............................ 90 4.3.3. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi................................................................................................... 91 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 94 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 95 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ ............................................................................... 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 97
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ A260 Độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia quá mức AAH không điển hình) ABL Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 gene ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ) AIS Adenocarcinoma in situ (Ung thư tại chỗ) ALK Anaplastic Lymphoma Kinase gene ALK-EML4, Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL BCR-ABL APC Adenomatous polyposis of the colon gene BAC Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang) BCR Breakpoint Cluster Region gene BRCA1 Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú) BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B CD74 Cluster of Differentiation 74 gene CHFR Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains CK5/6 Cytokeratin 5/6 protein CK7 Cytokeratin 7 protein Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp COBRA Bisulfite và cắt giới hạn) cs. Cộng sự DAB 3, 3 –diaminobenzidine DAPK Death‐associated protein kinase DNA Acid deoxyribonucleic DNMTs DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA)
dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EGFR Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô) ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen) Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm và thuốc FDA Hoa Kỳ) FFPE Formalin fixed paraffin embedded FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang) GTP Guanosine triphosphate GDP Guanosine diphosphate GSTP1 Glutathione S-transferase Pi 1 gene H&E Hematoxylin & Eosin HDACs Histone deacetylase HRM High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy) HPR Horseradish Peroxidase International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên IARC cứu ung thư thế giới) IHC Immunohistochemistry (Hóa mô miễn dịch) MAPK Mitogen-activated protein kinase MDR Multidrug resistance gene MEK Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1 (MAP2K1) MET Mesenchymal-epithelial transition factor MIA Minimally Invasive Adenocarcinoma MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene MLH1 MutL homolog 1 gene MsssI CpG methyltransferase MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl)
MYC Myelocytomatosis genes NGS Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới) NSCLC Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ) PI3K Phosphoinositide 3-kinases PTEN Phosphatase and tensin homologue PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone) RASSF1A Ras association domain family 1A gene RARP2 The retinoic acid receptor P gene Ras Rat sarcoma RB2 Retinoblastoma-like protein 2 RET Rearranged during transfection ROS1 c-ros oncogene 1gene SAM S-adenosylmethionine SCLC Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ) SDC4 Syndecan 4 gene SLC34A2 Solute Carrier Family 34 Member 2 gene SNP Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide) Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi SSCP đơn) TAE Tris-acetate-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine TKIs Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase) TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene TTF-1 Transcription Termination Factor 1 (Yếu tố kết thúc phiên mã 1) WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới) WNT Wingless genes YAP Yes-associated protein
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới 5 Hình 1.2 Số ca mắc ung thư mới tại Việt Nam năm 2018 5 Hình 1.3 Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi 7 Hình 1.4 Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến 11 Hình 1.5 Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi 12 Hình 1.6 Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR 14 Hình 1.7 Tần suất các dạng đột biến gen EGFR 15 Hình 1.8 Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư 19 Hình 1.9 Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR 22 Hình 1.10 Cấu trúc gen BRCA1ở người 22 Hình 1.11 Chức năng ức chế khối u của BRCA1 23 Hình 1.12 Cấu trúc gen MLH1 24 Hình 1.13 Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1 24 Hình 1.14 Cấu trúc gen MGMT 26 Hình 1.15 Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT 26 Hình 1.16 Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân 27 Hình 1.17 Chức năng ức chế khối u của RASSF1A 28 Hình 1.18 Điều trị đích trong ung thư phổi 32 Hình 1.19 Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen 35 Hình 1.20 Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA 36 Hình 2.1 Phương pháp xử lý bisulfite 44 Hình 2.2 Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms 48 Hình 2.3 Phương pháp hóa mô miễn dịch 49 Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 50 Hình 3.1 Kết quả phát hiện đột biến EGFR 53
Hình 3.2 Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR 56 Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen EGFR 59 Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen BRCA1 61 Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen MGMT 63 Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa MLH1 65 Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen RASSF1A 67 Hình 4.1 Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và sự biểu hiện EGFR 81
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Kit và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 40 Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 41 Bảng 2.3 Điều kiện các phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu 45 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR trong nghiên cứu 46 Bảng 3.1 Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu 51 Bảng 3.2 Các đột biến gen EGFR được phát hiện trong nghiên cứu 52 Bảng 3.3 Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 54 Bảng 3.4 Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh 55 nhân nam giới Bảng 3.5 Mức độ biểu hiện protein EGFR 57 Bảng 3.6 Tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR với đặc điểm bệnh nhân 58 Bảng 3.7 Tương quan giữa methyl hóa EGFR với đặc điểm bệnh nhân 60 Bảng 3.8 Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân 62 Bảng 3.9 Tương quan giữa methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân 64 Bảng 3.10 Tương quan giữa methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân 66 Bảng 3.11 Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân 68 Bảng 3.12 Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein EGFR 69 Bảng 3.13 Tỷ lệ đột biến, biểu hiện protein ở bệnh nhân methyl hóa EGFR 70 Bảng 3.14 Tương quan giữa đột biến và methyl hóa với biểu hiện EGFR 70
Bảng 3.15 Tương quan giữa đột biến EGFR với sự methyl hóa các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A 72 Bảng 3.16 Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với sự methyl hóa các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A 73 Bảng 3.17 Tương quan về tình trạng methyl các gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyển ở phổi 74
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Ung thư phổi là loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử vong cao nhất trên thế giới hiện nay. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2018 có đến 2,1 triệu trường hợp mắc mới và 1,8 triệu người chết do ung thu phổi. Trong khi đó, số ca mắc mới và tử vong ở Việt Nam là 160 000 và 115 000 người. Ung thư phổi được chia làm hai nhóm chính là ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 10 – 15 % và ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 85 – 90 %. Trong đó, ung thư biểu mô tuyến của phổi là dạng phổ biến nhất, không chỉ gặp ở những người hút thuốc lá mà còn khá phổ biến ở những người không hút thuốc, phụ nữ và những người trẻ tuổi. Ung thư phổi nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng có tiên lượng và mức độ đáp ứng điều trị rất thấp, chỉ 10 – 15 % bệnh nhân ung thư phổi có thể sống sót qua 5 năm. Tuy vậy hiệu quả điều trị sẽ được cải thiện rõ rệt nếu như bệnh nhân được phát hiện ung thư sớm và sử dụng những phác đồ điều trị hiện đại. Một trong những phương pháp điều trị mới đang được áp dụng phổ biến hiện nay là những thuốc điều trị nhắm đích dựa trên những hiểu biết về những biến đổi di truyền của tế bào ung thư. Ở ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng, phác đồ điều trị bằng thuốc nhắm đích TKIs (Tyrosine Kinase Inhibitors) dựa trên những đột biến về gen EGFR (Epidermal growth factor receptor) đang được sử dụng rộng rãi và mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời gian sống thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi. Bên cạnh đó việc đánh giá sự biểu hiện của gen EGFR cũng góp phần quan trọng trong việc đưa ra những tiên lượng tiến triển của bệnh cũng như định hướng liều lượng thuốc cho bệnh nhân. Mặt khác, biểu hiện gen EGFR lại được điều khiển bởi mức độ methyl hóa vùng promoter của gen này. Cùng với EGFR, methyl hóa các gen ức chế khối u cũng được xem là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và phát triển của ung thư. Methyl hóa các gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A…. đã được phát hiện trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư phổi. Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa một số gen ức chế khối u dẫn đến tiên lượng xấu cho bệnh nhân và được xem là marker điển hình trong ung thư phổi. Đồng thời, 1
sự kết hợp thuốc điều trị nhắm đích TKIs với chất loại bỏ nhóm methyl đã mang lại hiệu quả ban đầu cao hơn so với việc chỉ sử dụng TKIs trên những dòng tế bào ung thư phổi điển hình. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi. Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu tổng thể về những biến đổi phân tử của gen EGFR và sự ảnh hưởng của hiện tượng methyl hóa các gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A lên những biến đổi này. Ở Việt Nam hiện nay, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến gen EGFR để đưa ra phác đồ điều trị bằng TKIs. Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến ở phổi” với mục tiêu: 1. Phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyển ở phổi. 2. Đánh giá được tình trạng methyl hóa một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột biến và biểu hiện protein EGFR. Nội dung nghiên cứu 1. Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh. Thu thập mẫu bệnh phẩm ung thư phổi và mẫu phổi liền kề. 2. Xác định tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR. Phân tích sự liên quan của các đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến và biểu hiện gen EGFR. 3. Thiết lập và xây dựng điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đặc hiệu methyl nhằm xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter các gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A và sự tương quan của hiện tượng này với các đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu. 4. Phân tích tương quan giữa đột biến và biểu hiện EGFR với tình trạng methyl hóa các gen liên quan bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A. 2
Đóng góp mới của luận án Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xác định toàn diện các đặc điểm phân tử của EGFR là đột biến, methyl hóa và biểu hiện protein. Đồng thời, đánh giá được tình trạng methyl hóa 4 gen ức chế khối u quan trọng trong ung thư biểu mô tuyến của phổi. Nghiên cứu có một số đóng góp mới và ý nghĩ thực tiễn như sau: 1. Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu hiện của protein EGFR và sự methyl hóa của một số gen liên quan đến sự phát sinh ung thư, tiến triển bệnh và đáp ứng điều trị ung thư biểu mô tuyến ở phổi. 2. Chỉ ra được mối liên quan giữa methyl hóa gen RASSF1A với methyl hóa các gen BRCA1 và MLH1. Sự khác nhau của methyl hóa vùng promoter gen EGFR và BRCA1 với sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến ở phổi. 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Ung thƣ phổi 1.1.1. Thực trạng ung thư phổi Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết do ung thư phổi trong tổng số 9,6 triệu người chết do ung thư (Hình 1.1) [35]. Đây vẫn ung thư phổ biến nhất ở nam giới trên toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số). Tỷ lệ mắc cao nhất là ở Trung Âu và Đông Âu (53,3/100 000 người) và Đông Á (50,4/100 000 người). Tỷ lệ mắc thấp nhất là ở Trung Phi và Tây Phi (2,0 và 1,7/100 000 người). Ở phụ nữ, ung thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4% tổng số). Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở phụ nữ thấp hơn ở nam giới và có sự khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác nhau với thuốc lá. Do đó, tỷ lệ mắc cao nhất là ở Bắc Mỹ (33,8/100 000 người) và Bắc Âu (23,7/100 000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao ở khu vực Đông Á (19,2/100 000 người) và thấp nhất ở Tây Phi và Trung Phi (1,1 và 0,8/100 000 người) [35]. Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính trong năm 2017, đã có thêm 225 500 trường hợp mới mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư được phát hiện. Chỉ có 19% trường hợp bị phát hiện ung thư phổi có thể sống thêm quá 5 năm. Cũng theo thống kê của Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ, năm 2015 có đến 155 800 người chết do căn bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong do ung thư [102]. Số trường hợp tử vong do ung thư phổi lớn hơn tổng số trường hợp tử vong do ba loại ung thư phổ biến khác ở Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư đại tràng cộng lại [102]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới 2018, ở Việt Nam, mỗi năm có khoảng 160 000 trường hợp mắc mới và có tới 115 000 người tử vong do ung thư. Việt Nam đứng ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong 110/100 000 người (Hình 1.2). Ung thư phổi có tỉ lệ mắc đứng hàng thứ 2 ở nam giới và đứng hàng thứ 3 ở nữ giới nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao thứ hai ở cả nam và nữ (sau ung thư gan). Số ca mắc mới ung thư phổi ở nam giới năm 2000 chỉ là 6 905 ca với tỉ lệ 29,3/100 000 dân, đến năm 2018 số ca mắc đã là 23 667 trường hợp 4
(14,4% tổng số ca ung thư) và tăng tỉ lệ lên 35,1/100 000 dân. Dự báo, đến năm 2020, số trường hợp mắc mới có thể lên tới 23 000 ở nam giới và hơn 34 000 ở cả hai giới [35]. Cũng theo WHO, Việt Nam nằm ở nhóm nước có tần suất mắc ung thư phổi cao thuộc hàng thứ hai trên thế giới, với tỉ lệ mắc ở nam giới là 25,5 – 41,5/100 000 dân và ở nữ giới là 7,3 – 13,6/100 000 dân [35]. Hình 1.1. Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới [35]. Hình 1.2. Số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2018 [35]. 5
1.1.2. Phân loại ung thư phổi Ung thư phổi được phân loại dựa trên kết quả xét nghiệm mô bệnh học [84]. Sự phân loại này có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi, điều trị và tiên lượng bệnh. Ung thư phổi được hình thành từ khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô, gọi là ung thư biểu mô. Ung thư biểu mô phổi được phân loại theo kích thước và hình thái của các tế bào ác tính quan sát dưới kính hiển vi. Để phục vụ cho mục đích điều trị, ung thư phổi được chia ra hai loại lớn: Ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC – Small Cell Lung Cancer) (Hình 1.3) [72]. 1.1.2.1. Ung thư phổi không tế bào nhỏ Ung thư phổi không tế bào nhỏ được chia thành các nhóm nhỏ hơn, trong đó ba phân nhóm chính là ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung thư biểu mô tế bào lớn [57]. Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường hợp mắc ung thư phổi và thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [57]. Ung thư biểu mô tuyến xảy ra phổ biến ở nữ giới và những người không hút thuốc [135]. Đây cũng là loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài hơn những nhóm khác [112]. Ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng 25 – 30% số trường hợp ung thư phổi. Chúng thường bắt đầu xuất hiện ở tế bào vẩy, là những tế bào phẳng nằm bên trong đường hô hấp của phổi. Ung thư biểu mô tế bào vẩy có xu hướng được tìm thấy ở phần trung tâm của phổi, gần một đường hô hấp chính (phế quản), thường gặp ở nam giới và có liên quan mật thiết với tiền sử hút thuốc lá nhiều hơn so với hầu hết các loại ung thư phổi khác [65]. Ung thư biểu mô tế bào lớn (LCC – Large Cell Cancer) chiếm khoảng 10 – 15% số trường hợp mắc ung thư phổi. Sở dĩ tên gọi như vậy vì tế bào ung thư có kích thước rất lớn, với sự dư thừa tế bào chất, nhân tế bào lớn và hạch nhân dễ thấy [84]. Ung thư biểu mô tế bào lớn có thể xuất hiện ở bất kỳ phần nào của phổi. Nó có xu hướng phát triển và lan truyền nhanh chóng, điều này có thể làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Một phân nhóm của ung thư biểu mô tế bào lớn, được gọi là ung thư biểu mô tế bào thần kinh lớn, là một loại ung thư phát triển nhanh, rất giống với ung thư phổi tế bào nhỏ [84]. 6