Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:128

Thêm vào BST

Báo xấu

78
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm làm rõ tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền Bắc, bao gồm vùng đồng bằng sông Hồng và vùng trung du- miền núi. Trên cơ sở xác định được sự lưu hành của PEDV, đặc điểm dịch tễ học được phân tích đa chiều, đi sâu tìm hiểu những biến đổi có liên quan đến đáp ứng miễn dịch trung hòa virus. Đặc biệt, phân tích mối liên hệ về gen được thực hiện trên cơ sở dữ liệu lớn nhằm làm rõ nhiều đặc điểm dịch tễ học phân tử chưa được đề cập trong nhiều nghiên cứu trước đây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN TRUNG TIẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED) TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN TRUNG TIẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED) TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên HÀ NỘI - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Trung Tiến i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy mà luận án của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Trân trọng cảm ơn Lãnh đạo, toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1, các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Trung Tiến ii
MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................................ iii Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. vi Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ............................................................................................................... viii Trích yếu luận án .............................................................................................................. x Thesis abstract................................................................................................................. xii Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1. Giới thiệu chung ................................................................................................... 4 2.2. Lịch sử bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn ............................................................... 4 2.3. Tình hình dịch PED trên thế giới và Việt Nam .................................................... 5 2.3.1. Tình hình dịch PED trên thế giới .......................................................................... 5 2.3.2. Tình hình dịch PED ở Viê ̣t Nam........................................................................... 6 2.4. Căn bệnh ............................................................................................................... 8 2.4.1. Phân loại và hình thái của PEDV.......................................................................... 8 2.4.2. Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh ..................................................................... 9 2.4.3. Đặc tính nuôi cấy của virus ................................................................................ 12 2.4.4. Sức đề kháng của virus gây bệnh PED .............................................................. 12 2.4.5. Dịch tễ học lâm sàng ........................................................................................... 13 2.5. Dịch tễ học phân tử ............................................................................................. 16 2.6. Triệu chứng và bệnh tích của lợn mắc PED ....................................................... 18 2.6.1. Triệu chứng lâm sàng.......................................................................................... 18 2.6.2. Bệnh tích ............................................................................................................. 19 iii
2.7. Các phương pháp chẩn đoán PEDV ................................................................... 20 2.7.1. Phát hiện virus .................................................................................................... 20 2.7.2. Chẩn đoán phân biệt ........................................................................................... 23 2.7.3. Phân lập virus...................................................................................................... 24 2.8. Phòng và điều trị bệnh ........................................................................................ 25 Phần 3. Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu...................................... 30 3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 30 3.2. Thời gian thực hiện đề tài ................................................................................... 30 3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 30 3.3.1. Nghiên cứu tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam ................. 30 3.3.2. Phân tích đặc điểm về trình tự gen...................................................................... 30 3.3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV ............. 30 3.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 31 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 31 3.5.1. Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ ................................................... 32 3.5.2. Phương pháp theo dõi lâm sàng .......................................................................... 32 3.5.3. Phương pháp mổ khám ....................................................................................... 32 3.5.4. Phương pháp lấy mẫu ......................................................................................... 32 3.5.5. Phương pháp tách ARN tổng số ......................................................................... 32 3.5.6. Phương pháp tổng hợp cDNA ............................................................................ 33 3.5.7. Phương pháp phát hiện PEDV ............................................................................ 34 3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen............................................................................. 34 3.5.9. Phương pháp xác định khoảng cách di truyền .................................................... 35 3.5.10. Phương pháp xây dựng cây phả hệ ..................................................................... 35 3.5.11. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử ........................................ 35 3.5.12. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 36 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 37 4.1. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc từ 2013-2015 ............................... 37 4.1.1. Kết quả thiết lập phản ứng RT-PCR phát hiện PEDV ........................................ 37 4.1.2. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015 .......................... 41 4.1.3. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại............................... 42 4.1.4. Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED ................................. 44 iv
4.2. Kết quả phân tích đặc điểm về trình tự gen ........................................................ 48 4.2.1. Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam ............................. 48 4.2.2. Đặc điểm gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam....................................... 61 4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm về dịch tễ học phân tử của PEDV ........................ 67 4.3.1. Đặc điểm về sự lưu hành của PEDV theo nhóm di truyền ................................. 67 4.3.2. Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam ..................................... 73 4.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV theo không gian và thời gian ............. 75 Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 85 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 85 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 85 Danh mục công trình công bố có liên quan đến luận án ................................................. 87 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 87 Phụ lục .......................................................................................................................... 103 v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ CPE Cytopathogenic effect cs. Cộng sự DMEM Dulbecco's Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide E Envelope EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid ELISA Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization FBS Fetal Bovine Serum M Membrane MOI Multiplicity of Infection N Nucleocapsid ORF Open Reading Frame ORF3 Open Reading Frame 3 PBS Phosphate Buffer Saline PDCoV Porcine deltacoronavirus PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction S Spike protein TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGE Transmissible Gastroenteritis TGEV Transmissible Gastroenteritis Virus TPB Tryptose Phosphate Broth vi
DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1. Thông tin về mồi đặc hiệu được dùng trong nghiên cứu ....................................... 31 3.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .................................................................. 34 4.1. Tương đồng trình tự nucleotide và amino acid của 11 chủng PEDV với các chủng tham chiếu ................................................................................................... 39 4.2. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015.................................. 41 4.3. Tình hình dịch PED ở lợn của một số tỉnh miền Bắc theo trang trại..................... 43 4.4. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PED ................................ 44 4.5. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED ....................................... 46 4.6. Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 1 ................................................... 75 4.7. Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 2 nhóm châu Á ............................ 80 vii
DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Hạt virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc ........................................ 9 2.2. Mô hình cấu trúc và bộ gen PEDV ........................................................................ 10 2.3. Hiệu giá của PEDV tồn tại trên bề mặt vật liệu theo thời gian ............................. 13 2.4. Con đường truyền lây của PEDV .......................................................................... 17 2.5. Bệnh tích đại thể ở lợn sơ sinh mắc PED .............................................................. 19 2.6. So sánh độ nhạy của một số phương pháp phát hiện PEDV ................................. 22 4.1. Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm .................................... 37 4.2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR nhân lên bởi cặp mồi P1/P2 ......................... 38 4.3. Triệu chứng của lợn con theo mẹ mắc PED .......................................................... 45 4.4. Bệnh tích đại thể của lợn con theo mẹ mắc PED .................................................. 47 4.5. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV .................................. 49 4.6. Phân loại các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen S ......................... 50 4.7. Khoảng cách di truyền của gen S giữa các chủng PEDV ...................................... 51 4.8. Đột biến thêm- xóa ở gen S của 38 chủng PEDV ................................................. 52 4.9. Tốc độ thay đổi nucleotide tại các vị trí codon của gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên................................................................................................. 54 4.10. Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV ........................................ 56 4.11. Trình tự amino acid ở vùng S1D của 38 chủng PEDV ......................................... 58 4.12. Trình tự amino acid ở vùng S10 của 38 chủng PEDV ........................................... 60 4.13. Trình tự nucleotide gen ORF3 của 12 chủng PEDV ............................................. 62 4.14. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen ORF3 của 12 chủng PEDV .......................... 63 4.15. Phân loại chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen ORF3 ........................ 64 4.16. Khoảng cách di truyền của gen ORF3 giữa các chủng PEDV .............................. 65 4.17. Trình tự amino acid ORF3 protein của 12 chủng PEDV....................................... 66 4.18. Cây phả hệ của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S ...................................... 68 4.19. Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dẫn tới các chủng của Việt Nam dựa vào trình tự gen S ........................................................................... 69 4.20. Cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen ORF3 ............................................... 70 viii
4.21. Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dựa vào gen ORF3 của genogroup 1 của Việt Nam................................................................................................................ 72 4.22. Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và một phần gen S (n =43) ......................................................................................................... 73 4.23. Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và một phần gen S (n =911) ....................................................................................................... 74 4.24. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào trình tự gen ORF3 ............................................................................................................... 76 4.25. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào trình tự gen S ...................................................................................................................... 77 4.26. Sự phát tán theo không gian của genogroup 2 dựa vào gen ORF3 ....................... 79 4.27. Sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV nhánh châu Á ..................... 81 4.28. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV genogroup 2 nhánh châu Á .................................................................................... 82 4.29. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV genogroup 2 nhánh Bắc Mỹ................................................................................... 83 ix
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Trung Tiến Tên Luận án: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Trong nghiên cứu này trước tiên làm rõ tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền Bắc, bao gồm vùng đồng bằng sông Hồng và vùng trung du- miền núi. Trên cơ sở xác định được sự lưu hành của PEDV, đặc điểm dịch tễ học được phân tích đa chiều, đi sâu tìm hiểu những biến đổi có liên quan đến đáp ứng miễn dịch trung hòa virus. Đặc biệt, phân tích mối liên hệ về gen được thực hiện trên cơ sở dữ liệu lớn nhằm làm rõ nhiều đặc điểm dịch tễ học phân tử chưa được đề cập trong nhiều nghiên cứu trước đây. Phương pháp nghiên cứu Có hai nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) phương pháp RT-PCR dùng trong phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm và giải trình tự gen virus. (ii) Phương pháp phân tích đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm dịch tễ học phân tử dựa vào các phần mềm như BioEdit, MEGA, MAFFT, BEAST, v.v... Kết quả chính và kết luận Có 5 nhóm kết quả nghiên cứu chính đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) Bằng phản ứng RT-PCR, đã xác định được dịch PED đã xuất hiện ở một không gian trải rộng ở 10/10 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình là 41,98% và liên tục theo thời gian (trong các năm thu thập mẫu từ 2013-2015). Các trang trại ở vùng đồng bằng có tỷ lệ trang trại dương tính PEDV cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở các tỉnh trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%). (ii) Lợn mắc PED có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh: phân tanh và có mùi gây đặc trưng (64%), phân có sữa không tiêu (38%); ruột non trong (60%) và có cục sữa không tiêu ở các đoạn ruột (20%). (iii) Tính đa dạng di truyền của gen S và gen ORF3 của 38 chủng PEDV của Việt Nam được phân tích đa chiều về tỷ lệ % tương đồng, phân loại theo nhóm di truyền và khoảng cách di truyền giữa các chủng virus. Qua đó đã xác định được PEDV lưu hành ở x
Việt Nam không có nguồn gốc từ các chủng virus vacxin và có tính đa dạng di truyền với mức tương đồng trình tự gen S là 63,7% - 87,9% và gen ORF3 là 93% - 99%. Các chủng virus mang đột biến thêm- xóa và đột biến điểm ở vùng quyết định kháng nguyên của gen S được dự đoán không dẫn tới dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa. (iv) Phân tích cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 được thực hiện với dung lượng mẫu lớn (n = 911 trình tự gen S, n = 886 trình tự gen ORF3) được tạo ra trong nghiên cứu này và thu thập từ ngân hàng gen. Nghiên cứu này đã khẳng định sự lưu hành của 2 genogroup PEDV ở Việt Nam. Trong đó genogroup 2 bao gồm nhóm châu Á và nhóm Bắc Mỹ. Một số chủng là kết quả của quá trình tái tổ hợp ở gen S giữa 2 chủng virus thuộc genogroup 1 và genogroup 2 (v) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV lưu hành ở Việt Nam được cho từng genogroup virus, với hai kết luận quan trọng được rút ra. Thứ nhất, PEDV lưu hành ở Việt Nam có nguồn gốc đa dạng: virus thuộc genogroup 1 và nhánh châu Á của genogroup 2 có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc. Trong khi đó virus thuộc nhánh Bắc Mỹ có nguồn gốc từ Mỹ. Thứ hai, chủng virus tổ tiên của PEDV hiện lưu hành được dự đoán tồn tại trước thời điểm xảy ra dịch PED khoảng 6-9 năm. Sau khi xâm nhập, các chủng PEDV của Việt Nam bắt đầu tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và lây lan ra các địa phương khác. xi
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Nguyen Trung Tien Thesis title: Epidemiological study of porcine epidemic diarrhea in pig populations in the north of Vietnam Major: Veterinary epidemiology Code: 9.64.01.08 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives This study firstly investigated the prevalence of PED in northern provinces which were divided in to the river delta and the mountainous areas. Based on the identification of PEDV in each region, the molecular epidemiology of PEDV was analyzed under different aspects. For example, genetic substitutions which are related to neutralizing epitopes were focused. Especially, based on a large data for phylogenetic inferences, this study revealed several important aspect of molecular epidemiology which was missed in several publications. Materials and Methods This study used two major methods, which were: (i) RT-PCR based method for viral detection and Sanger sequencing. (ii) Method for molecular epidemiological analyses was relied on several state-of-the-art tools, such as: BioEdit, MEGA, MAFFT, BEAST, etc. Main findings and conclusions Five main results were drawn from this study, as the follows. (i) The result of RT-PCR screening confirmed the emergence of PED in all 10/10 investigated provinces. The outbreaks were found consecutively from 2013-2015, and the average rate of prevalence was 41.98%. Farms located in the river delta region tended to have a higher PEDV positive rate (68.42%) in compare to those located in the mountainous area (35.29%). (ii) PEDV infected piglets displayed typical clinical symptoms as well as gross lesions of PED, such as: typical odor (64%), un-digested milk in feces (38%); thin-wall small intestine (60%) and milk curved in the intestinal lumen (20%). (iii) The genetic diversities of S and ORF3 genes of 38 field strains were analyzed under different aspects. It was concluded that field strains of PEDV in Vietnam were xii
not related to vaccine strain. The sequence similarities between field viruses were 63.7% - 87.9% for the S gene and were 93% - 99% for the ORF3 gene. Genetic insertion- deletions as well as point mutations in important epitopes of the spike protein were predicted not resulting escape mutants. (iv) Phylogenetic analyses were done on the large data of both S and ORF3 gene. The results confirmed the prevalence both genogroup 1 and genogroup 2 of PEDV in pig population in Vietnam. Of the genogroup 2, PEDVs in Vietnam were separated into the emerging Asian and North American clades. Several strains were determined to be the result of recombination on the S gene between genogroup 1 and genogroup 2. (v) The molecular epidemiology was inferred for each genogroup. Firstly, Vietnamese PEDVs were predicted originating from the viruses circulating in China (for genogroup 1 and Asian clade of genogroup 2). Meanwhile, the North American clade was predicted to derive from USA. Secondly, the most recent common ancestor of Vietnamese PEDV was predicted to emerge in Vietnam 6-9 years prior to the first PED outbreak. After the introduction, the viruses diversified locally to form Vietnamese clade and started to diffuse spatial-temporally into different locations. xiii
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bê ̣nh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ Coronaviridae. Về mặt lâm sàng, biểu hiện của bệnh PED rất giống với bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) mặc dù chúng là hai virus hoàn toàn khác nhau cùng họ Cornonaviridae. Bệnh gây ra trên lợn ở tất cả các lứa tuổi với triệu chứng lâm sàng là nôn và tiêu chảy. Tỷ lệ lây lan và tử vong ở lợn con dưới 5 ngày tuổi có thể tới 100% bởi tiêu chảy và mất nước nặng. Bê ̣nh PED xảy ra quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và trên 90% ca bệnh xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Dịch PED xuất hiện lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều quốc gia khác ở châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan. Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phân tích đặc điểm di truyền của các chủng virus gây bệnh PED, so sánh sự khác nhau về mặt di truyền, đặc điểm phát sinh loài của các chủng phân lập ở những địa điểm khác nhau, từ đó đưa ra các dự đoán, khuyến cáo và biện pháp đối phó hiệu quả trước sự biến đổi của virus. Park et al. (2007) đã phân tích sự phát triển di truyền của gen S (spike glycoprotein gene) và gen M trên các mẫu virus PED thực địa phân lập tại Hàn Quốc và chia các chủng virus thành 3 nhóm G1, G2, G3, (G1 có 3dưới nhóm: G1-1, G1-2 và G1-3), các chủng đó rất khác biệt với các chủng từ Châu Âu. Khi phân tích trình tự gen mã hóa cho màng virus (gen M) từ các mẫu phân lập tại Trung Quốc, Chen et al. (2008) đã phát hiện có một nhóm mới (genotype) của virus PED đang lưu hành. Ở Việt Nam, bê ̣nh tiêu chảy thành dịch ở lợn lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008, đầu năm 2009 (Do Tien Duy et al., 2011; Nguyễn Tất Toàn và cs., 2012). Theo các nghiên cứu đã công bố bệnh tiêu chảy thành dịch xảy ra trên lợn mọi lứa tuổi, lần đầu tiên được xác định là do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) tại Việt Nam. Bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam bộ, gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế chăn nuôi heo do làm tăng 1
tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết cao đặc biệt trên lợn con theo mẹ từ 50 - 100%. Cho đến nay có rất ít công trình trong nước tiến hành nghiên cứu về loại virus này. Do Tien Duy et al. (2011) ở Thái Lan đã phân lập và giải trình một số chủng virus PED trên các mẫu được lấy ở miền Nam Việt Nam trong thời gian từ 2009 đến 2010. Ở miền Bắc, theo báo cáo không chính thức từ các công ty, trang trại, dịch tiêu chảy do PEDV đã xảy ra nghiêm trọng từ đầu năm 2010. Việc phòng chống bệnh tiêu chảy do PEDV gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vacxin. Trong khi các chủng virus thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt di truyền, do đó việc nắm bắt và cập nhật được các đặc tính phân tử của các chủng PEDV đóng vai trò quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vacxin thích hợp và hiệu quả phục vụ cho công tác tiêm phòng. Trong khi đó, việc đánh giá và phân tích đặc điểm di truyền của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam còn hạn chế, đã gây khó khăn trong việc định hướng sử dụng vacxin trong công tác phòng bệnh. Do đó, nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, xác định các type virus đang lưu hành trong nước cũng như tìm hiểu nguồn gốc phát sinh phân loại, biến đổi di truyền của các type virus này là rất cần thiết cho việc phòng chống dịch PED cũng như định hướng cho việc nhập khẩu và triển khai sử dụng vacxin một cách hiệu quả, đồng thời cũng là một nền tảng quan trọng trong việc định hướng sản xuất vacxin trong nước nhằm đạt hiệu quả miễn dịch cao hơn cũng như chủ động được nguồn vacxin và tiết kiệm chi phí cho việc nhập khẩu. Để hạn chế dịch PED, việc nghiên cứu xác định được các chủng virus gây bệnh, đồng thời giải mã, phân tích hệ gen, xác định được nguồn gốc tiến hóa và sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV là vô cùng quan trọng và là công việc nghiên cứu hết sức cần thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn để từ đó góp phần quan trọng trong định hướng chiến lược cho việc sản xuất vacxin phòng bệnh trong tương lai. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc; - Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc. 2
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trang trại nuôi lợn tại 10 tỉnh miền Bắc có lợn mắc tiêu chảy nghi do PEDV giai đoạn 2013 - 2015. Các tỉnh/ thành phố thuộc đồng bằng châu thổ sông Hồng (Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình và Vĩnh Phúc) và Trung du - Miền núi (Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên và Lào Cai). 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đây là một nghiên cứu có hệ thống về PED và PEDV ở Việt Nam. - Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trên địa bàn 10 tỉnh/ thành phố của miền Bắc Việt Nam. Trên cơ sở xác định những biểu hiện bệnh lý của bệnh, đặc điểm dịch tễ học phân tử của căn bệnh, đã khẳng định sự lưu hành phổ biến của PED trong các trang trại chăn nuôi. - Nghiên cứu này đã giải mã được 15 trình tự gen S hoàn chỉnh và 8 trình tự gen ORF3, so sánh và chứng minh được những chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa không có cùng nguồn gốc với các chủng vacxin đang sử dụng. - Xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử, từ đó chứng minh được nguồn gốc đa dạng của các chủng PEDV đang lưu hành tại Việt nam. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Luận án đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học của PED tại 10 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam và mức độ lưu hành của bệnh, chứng minh được nguồn gốc của các chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa. - Là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu về PED và PEDV; là tư liệu tham khảo cho giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi-Thú y. - Từ kết quả phân tích dịch tễ học phân tử của PEDV đã chỉ rõ mức tương đồng trình tự gen giữa những chủng PEDV phân lập từ thực địa và những chủng vacxin đang sử dụng, từ đó giúp cho việc hoạch định các biện pháp phòng chống bệnh, trong đó có lựa chọn vacxin phòng bệnh phù hợp. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG Dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra. Dịch PED thường xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Dịch PED đã và đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Laude et al., 1993; Lee, 2015). Dịch PED lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971, sau đó các ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy ra phổ biến ở các quốc gia châu Âu khác như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ, và ở châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan (Chen et al., 2010; Chen et al., 2008; Song and Park, 2012; Puranaveja et al., 2009). Ở Việt Nam, dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn trong cả nước (Do Tien Duy et al., 2011). 2.2. LỊCH SỬ BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN Bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn được phát hiện đầu tiên tại nước Anh vào năm 1971 (Oldham, 1972). Bệnh xảy ra trên lợn vỗ béo với các biểu hiện lâm sàng giống với bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE), chỉ khác một đặc điểm quan trọng đó là lợn con đang bú mẹ không mắc bệnh. TGEV và các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác đã được xác định không phải là nguyên nhân gây ra bệnh trên. Sau đó căn bệnh này đã lây lan sang các nước châu Âu và được gọi là bệnh “tiêu chảy thành dịch do virus” (Epidemic viral diarrhea - EVD). Năm 1976 căn bệnh tiêu chảy giống TGE lại xuất hiện nhưng xảy ra trên tất cả lợn ở mọi lứa tuổi, gồm cả lợn con đang trong giai đoạn bú sữa mẹ (Wood, 1977), khả năng nguyên nhân gây bệnh là TGEV và các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác cũng đã được loại trừ. Khi đó, tên EVD loại 2 được đưa ra để phân biệt với EVD loại 1 là bệnh bùng phát năm 1971 với sự khác nhau đó là lợn con đang bú mẹ chỉ mắc EDV loại 2 mà không mắc EDV loại 1. 4
Năm 1978, Coronavirus đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra các đợt bùng phát EVD loại 2 (Chasey and Cartwright, 1978). Kết quả gây bệnh nghiệm thực cho lợn bằng một chủng virus phân lập được (CV777) cho thấy bệnh tích đường tiêu hoá biểu hiện điển hình trên cả lợn con và lợn vỗ béo. Rõ ràng là Coronavirus này liên quan tới sự bùng phát EVD loại 1 và loại 2, từ đó tên bệnh đã được đổi thành “tiêu chảy thành dịch trên lợn” (Porcine Epidemic Diarrhea, PED). 2.3. TÌNH HÌNH DỊCH PED TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.3.1. Tình hình dịch PED trên thế giới Từ đầu những năm 2000 trở lại đây, những trận dịch bùng phát cấp tính đã trở nên hiếm có ở những vùng mà virus trước kia đã từng lan rộng. Hiện nay, các ổ dịch PED ít được ghi nhận ở châu Âu và ngày càng có ít nghiên cứu về bệnh này. Hơn nữa, bệnh thường được thấy nhất ở lợn choai, lợn trưởng thành và lợn mới sinh sản, trong khi lợn con bú mẹ lại ít khi nhiễm bệnh. Trong thập niên 70 và 80 của thế kỷ XX, dịch PED lưu hành rộng rãi ở châu Âu, gây bệnh ở lợn mọi lứa tuổi. Trong khoảng thời gian từ cuối thập niên 80 đến thập niên 90, dịch có xu hướng giảm đáng kể, với rất ít ổ dịch rời rạc được ghi nhận ở một số nước như Tây Ba Nha, Hungary, Anh và cộng hòa Séc (Carvajal et al., 2015). Trong năm 2005- 2006, dịch PED xảy ra nghiêm trọng ở Ý, với tỷ lệ chết ở lợn con theo mẹ từ 8,3% đến 11,9% (Martelli et al., 2008). Từ năm 2014 đến nay, PED được mô tả xuất hiện trở lại ở một số nước như Đức (Hanke et al., 2015), Ý (Boniotti et al., 2016), Bỉ, Pháp (Grasland et al., 2014) v.v... Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các quốc gia châu Á, đặc biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and Park, 2012). Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm PEDV đầu tiên được phát hiện năm 1973, sau hơn hai thập kỷ sử dụng vaccine vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở lại của PEDV tương đối ít. Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và bùng phát ngày càng trầm trọng ở các tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn. Từ tháng 2 năm 2010 đến tháng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100% (tương ứng 50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2012). Ở Nhật, dịch PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, gây chết 14.000 con, tỉ lệ chết từ 30 tới 5