Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình/đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 Cytochrome P450 ở người Kinh Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:169

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về đa hình/đột biến của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở người Kinh Việt Nam; xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồng thời phân tích và dự đoán chức năng của các biến thể mới.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình/đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 Cytochrome P450 ở người Kinh Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở NGƯỜI KINH VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở NGƯỜI KINH Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Hải Hà 2. GS. TS. Nông Văn Hải Hà Nội – Năm 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hải Hà và GS.TS. Nông Văn Hải. Những kết quả thu được của luận án là mới, trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các kết quả công bố chung đã được cán bộ hướng dẫn và các đồng tác giả cho phép sử dụng trong Luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Vũ Phương Nhung
ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS.TS. Nông Văn Hải-nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Chủ tịch hội đồng Khoa học Viện Nghiên cứu hệ gen và TS. Nguyễn Hải Hà-Phó trưởng phòng Phân tích hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, tinh thần say mê và nghiêm khắc trong khoa học cùng với sự hướng dẫn tận tình và khích lệ của các thầy là động lực lớn lao giúp tôi không ngừng cố gắng và phấn đấu, vượt qua nhiều khó khăn để có thể hoàn thành Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tôn-Trưởng phòng Phân tích hệ gen cùng các đồng nghiệp công tác tại phòng Phân tích hệ gen đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc chuyên môn tại Phòng. Bằng những tình cảm chân thành nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó. Trong quá trình nghiên cứu và học tập, tôi đã nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các nhà khoa học, các cán bộ nghiên cứu tại Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Những nhận xét và góp ý chuyên môn sâu sắc trong các buổi báo cáo, hội thảo đã giúp tôi hoàn thiện tốt nhất Luận án của mình. Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, tập thể cán bộ Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại đây. Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn tin tưởng và là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Vũ Phương Nhung
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN ........................ vii DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. ix DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ x MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 4 1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan ........................................................... 4 1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc. ...................................................................................................................... 6 1.2.1. Gen CYP2C9 ................................................................................................. 7 1.2.2. Gen CYP2C19 ............................................................................................. 11 1.2.3. Gen CYP2D6 ............................................................................................... 14 1.2.4. Gen CYP3A5................................................................................................ 17 1.3. Ảnh hưởng của đa dạng di truyền các gen dược học đối với các ADR và sự khác biệt trong đáp ứng thuốc ........................................................................................ 20 1.3.1. Khái quát về các ADR ................................................................................. 20 1.3.2. Một số trường hợp đa dạng di truyền các gen dược học gây nên khác biệt trong đáp ứng thuốc ........................................................................................................ 22 1.4. Ứng dụng và triển vọng của di truyền dược học trong lâm sàng ...................... 29 1.5. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen CYP450 ........ 32 1.5.1. Các phương pháp nghiên cứu SNP và indel ................................................. 32 1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu CNV .............................................................. 34 1.6. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền một số gen CYP450 trên người Việt Nam và phạm vi nghiên cứu của luận án ........................................................................ 37 1.6.1. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền của các gen CYP450 tại Việt Nam và trên thế giới ........................................................................................................... 37
iv 1.6.2. Phạm vi nghiên cứu của luận án ................................................................... 39 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 40 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 40 2.2. Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 40 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 41 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số ............................................................................... 41 2.3.2. Xác định nồng độ DNA tổng số ................................................................... 42 2.3.3. Phương pháp PCR Khuếch đại đặc hiệu các gen .......................................... 43 2.3.3.1. Thiết kế mồi .............................................................................................. 43 2.3.3.2. PCR đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ............. 45 2.3.4. Giải trình tự Sanger...................................................................................... 46 2.3.4.1. PCR giải trình tự ....................................................................................... 46 2.3.4.2. Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự ....................................................... 47 2.3.4.3. Biến tính sản phẩm PCR và điện di mao quản trên máy giải trình tự ......... 47 2.3.5. Phương pháp MLPA .................................................................................... 47 2.3.5.1. Thực hiện phản ứng MLPA....................................................................... 48 2.3.5.2. Điện di mao quản phân tách đoạn ............................................................. 49 2.3.5.3. Phân tích kết quả bằng phần mềm Coffalyzer ........................................... 49 2.3.6. Long range (LR) PCR .................................................................................. 50 2.3.7. Real-time PCR ............................................................................................. 51 2.3.8. Phân tích số liệu nghiên cứu ........................................................................ 52 2.3.8.1. Phân tích kết quả giải trình tự Sanger và đánh giá trạng thái cân bằng di truyền Hardy-Weinberg của quần thể ............................................................................... 52 2.3.8.2. Phân tích thống kê .................................................................................... 52 2.3.9. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới ........................................ 53 2.3.9.1. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng mã hóa .................... 53
v 2.3.9.2. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng không mã hóa ......... 53 2.3.9.3. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng promoter ................. 54 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 55 3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 55 3.2. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 và giải trình tự ........................................................................................................................... 55 3.3. Phân tích đa hình/đột biến các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở quần thể người Kinh Việt Nam .............................................................................. 59 3.3.1. Đa hình/đột biến của gen CYP2C9 ............................................................... 59 3.3.2. Đa hình/đột biến của gen CYP2C19 ............................................................. 65 3.3.3. Đa hình/đột biến của gen CYP2D6 ............................................................... 70 3.3.4. Đa hình/đột biến của gen CYP3A5 ............................................................... 83 3.4. Phân tích liên kết giữa các biến thể trên CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 ....... 85 3.5. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới tìm thấy trên CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 ........................................................................................... 87 3.6. So sánh tần số allele của các gen nghiên cứu giữa quần thể người Kinh Việt Nam với các quần thể người khác trên thế giới............................................................... 90 3.6.1. So sánh tần số allele của gen CYP2C9 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 90 3.6.2. So sánh tần số allele của gen CYP2C19 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với các quần thể người khác trên thế giới............................................................... 92 3.6.3. So sánh tần số allele của gen CYP2D6 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 93 3.6.4. So sánh tần số allele của gen CYP3A5 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 96 3.7. Thảo luận........................................................................................................ 98 3.7.1. Sự phân bố của các SNP gây ảnh hưởng chức năng protein CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở các quần thể người trên thế giới ....................... 98
vi 3.7.2. Phân tích liên kế t giữa các biế n thể và ý nghiã trong nghiên cứu đa da ̣ng di truyề n các gen CYP450........................................................................................ 102 3.7.3. Vai trò của các CNV và SV của các gen nghiên cứu trong đa dạng đáp ứng thuốc cá nhân....................................................................................................... 103 3.7.4. Vai trò của các biến thể mới của CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 đối với chức năng của các protein tương ứng ........................................................................... 105 3.7.5. Ý nghĩa của việc sử dụng thông tin di truyền các gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc trong tối ưu hiệu quả dùng thuốc trên người Kinh Việt Nam ............... 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 112 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ..................................................... 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 115 PHỤ LỤC................................................................................................................ 1
vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN Tên viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt dùng trong luận án ADR Adverse drug reaction Phản ứng có hại của thuốc CNV Copy number variant Biến thể số bản sao CPIC Clinical Pharmacogenetics Hiệp hội ứng dụng Di Implementation Consortium truyền dược học lâm sàng CYP2C19 Cytochrome P450 2C19 CYP2C9 Cytochrome P450 2C9 CYP2D6 Cytochrome P450 2D6 CYP3A5 Cytochrome P450 3A5 CYP450 Cytochrome P450 DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EM Extensive metabolizer Chuyển hóa thuốc bình thường FDA U.S. Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ FPR False positive rate Tỉ lệ dương tính giả GWAS Genome-wide association study Nghiên cứu tương quan toàn bộ hệ gen HSF Human Splicing Finder
viii IM Intermediate metabolizer Chuyển hóa thuốc trung bình Indel Insertion/deletion Biến thể thêm/mất nucleotide INR International normalized ratio Chỉ số phản ánh thời gian hình thành cục máu đông LD Linkage disequilibrium Độ liên kết giữa các biến thể LR-PCR Long range PCR MLPA Multiplex ligation dependent probe Khuếch đại đa đầu dò phụ amplification thuộc phản ứng ghép nối PCR Polymerase chain reaction PGRN Pharmacogenomics Research Mạng lưới nghiên cứu hệ Netwwork gen dược học PharmVar Pharmacogene Variation Đa dạng di truyền các gen dược học PM Poor metabolizer Chuyển hóa thuốc yếu SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotide SRS Substrate recognition site Vị trí nhận biết cơ chất SSRI Selective serotonin reuptake Ức chế tái hấp thu inhibitor serotonine SV Structural variant Biến thể cấu trúc TPMT Thiopurine S-methyltransferase enzyme chuyển hóa các thuốc thiopurine UM Ultra rapid metabolizer Chuyển hóa thuốc cực nhanh
ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C9 ................... 43 Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C19 ................. 44 Bảng 2.3. Trình tự các mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2D6 ......................... 44 Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP3A5 ................... 45 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR giải trình tự ................................................. 46 Bảng 2.6. Thông số điện di mao quản trên máy 3500............................................. 49 Bảng 2.7. Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao của mẫu nghiên cứu .............. 50 Bảng 2.8. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho real-time PCR ................................... 52 Bảng 3.1. Các biến thể của CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ............ 60 Bảng 3.2. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C9 của một số mẫu nghiên cứu ........ 62 Bảng 3.3. Tần số kiểu gen CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ............. 65 Bảng 3.4. Tần số các allele CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ........... 65 Bảng 3.5. Các biến thể của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam .......... 66 Bảng 3.6. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C19 của một số mẫu nghiên cứu ...... 68 Bảng 3.7. Tần số kiểu gen của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam .... 69 Bảng 3.8. Tần số các allele CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam.......... 69 Bảng 3.9. Biến thể của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam xác định bằng phương pháp giải trình tự ...................................................................................... 70 Bảng 3.10. Xác định kiểu gen của CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam thông qua kết hợp dữ liệu giải trình tự và MLPA ......................................................................... 78 Bảng 3.11. Tần số allele của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam ......... 80 Bảng 3.12. Tần số kiểu gen và tần số allele CYP3A5 trên người Kinh Việt Nam ... 84 Bảng 3.13. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP3A5 của một số mẫu nghiên cứu ....... 84 Bảng 3.14. So sánh tần số các biến thể CYP2C9 trong nghiên cứu này với các quần thể khác trên thế giới ............................................................................................. 91 Bảng 3.15. So sánh tần số các biến thể CYP2C19 trong nghiên cứu này với các quần thể khác trên thế giới ............................................................................................. 92 Bảng 3.16. So sánh tần số các allele của CYP2D6 có ảnh hưởng đến chức năng protein ở quần thể người Kinh Việt Nam và các quần thể khác trên thế giới ...................... 94 Bảng 3.17. So sánh tần số allele CYP3A5*3 trong nghiên cứu này với các quần thể khác trên thế giới ................................................................................................... 96
x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của CYP450 và các vị trí nhận biết cơ chất (SRS) . .................... 6 Hình 1.2. Đa dạng di truyền các gen CYP450 và vai trò trong chuyển hóa thuốc . ... 7 Hình 1.3. Các biến thể sai nghĩa và dịch khung của CYP2C9. ................................ 10 Hình 1.4. Phân bố một số biến thể trên gen CYP2C19 . ......................................... 12 Hình 1.5. Cấu trúc gen CYP2D6 và sự phân bố của một số biến thể . .................... 16 Hình 1.6. Phân bố của các biến thể trên gen CYP3A5. ........................................... 18 Hình 1.7. Ảnh hưởng của các ADR tới các cơ quan trong cơ thể. .......................... 21 Hình 1.8. Ứng dụng di truyền dược học trong xây dựng chiến lược sử dụng thuốc phù hợp. ....................................................................................................................... 29 Hình 2.1. Sơ đồ chi tiết thực hiện nghiên cứu ........................................................ 41 Hình 3.1. Điện di đồ 9 mẫu DNA tổng số .............................................................. 55 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C9 của 8 mẫu nghiên cứu .... 56 Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C19 của 8 mẫu nghiên cứu... 57 Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2D6 của 5 mẫu nghiên cứu .... 58 Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP3A5 của 8 mẫu nghiên cứu ..... 58 Hình 3.6. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2C9 ...................... 61 Hình 3.7. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2C9. ....... 63 Hình 3.8. Kết quả Real-time PCR kiểm tra mất số bản sao của CYP2C9 ............... 64 Hình 3.9. Các biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19. ................................ 67 Hình 3.10. Các biến thể mới trong vùng promoter CYP2D6 .................................. 72 Hình 3.11. Các biến thể mới trong intron và exon của CYP2D6 ............................. 73 Hình 3.12. Kết quả MLPA xác định số bản sao bình thường của gen CYP2D6 ...... 74 Hình 3.13. Kết quả MLPA xác định bất thường số bản sao (các exon 1,5,6) gen CYP2D6. ............................................................................................................... 75 Hình 3.14. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2D6. ..... 75 Hình 3.15. LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5. .................................................... 76 Hình 3.16. Các SV của CYP2D6 được xác định trên các mẫu người Kinh ............. 82 Hình 3.17. Kết quả giải trình tự của CYP3A5*3. .................................................... 83 Hình 3.18. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C9 ................................ 86 Hình 3.19. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C19 .............................. 86 Hình 3.20. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2D6 ................................. 87
xi Hình 3.21. Dự đoán chức năng của biến thể CYP2C9 42627C>A bằng Polyphen 2 (a) và PROVEAN (b) .................................................................................................. 88 Hình 3.22. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Proline 363 trên protein CYP2C9 ... 88 Hình 3.23. Dự đoán chức năng của các biến thể 3157G>T và 2988G>A thuộc CYP2D6 ................................................................................................................ 90 Hình 3.24. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Argine 329 trên protein CYP2D6 ... 90
1 MỞ ĐẦU Các enzyme cytochrome P450 (CYP450) thuộc một họ protein-heme lớn, những enzyme này có vai trò thiết yếu đối với các quá trình chuyển hóa hợp chất nội sinh và ngoại sinh. Ở người, có 57 gen chức năng và 58 gen giả đã được báo cáo, trong đó các CYP450 được phân loại thành 18 họ và 44 phân họ. Hầu hết các gen trong nhóm này đều mang những chức năng sinh học trong chuyển hóa các chất nội sinh như acid mật, eicosanoid và steroid. Tuy nhiên, khoảng 12 enzyme CYP450 thuộc các phân họ CYP1, CYP2 và CYP3 là tham gia chuyển hóa thuốc chính. Phần lớn các loại thuốc được kê đơn trong lâm sàng được chuyển hóa bởi các enzyme CYP450, ngoài ra cũng có rất nhiều loại thuốc chỉ được chuyển hóa bởi một CYP450 duy nhất. Có thể thấy, những yếu tố nội sinh và ngoại sinh gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của CYP450 đóng vai trò rất quan trọng đến dược động học của các loại thuốc được đưa vào cơ thể. Đối với một số các CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc như CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6, các biến thể di truyền trong các gen mã hóa cho protein có ảnh hưởng nhiều đến sự khác biệt trong hoạt tính của enzyme, trong khi đó đối với những CYP450 khác (CYP1A2, CYP3A4) thì tỉ lệ này không đáng kể. Các gen mã hóa cho các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc có tính đa hình rất cao. Sự đa dạng di truyền này được thể hiện ở những đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism-SNP) xuất hiện với tần số hiếm (rare) hoặc phổ biến (common), ngoài ra còn có các biến thể số bản sao (Copy number variant-CNV) bao gồm các mất/lặp đoạn. Chức năng của biến thể được phân loại từ không chức năng đến tăng cường chức năng, từ đó mà kiểu hình chuyển hóa được chia thành các cấp độ: chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer-PM), chuyển hóa thuốc trung bình (Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc bình thường (Extensive Metabolizer-EM) và chuyển hóa thuốc cực nhanh (Ultrarapid Metaolizer- UM). Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất hiện nay là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói trên mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được kê đơn.
2 Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu: Sự khác nhau trong đáp ứng thuốc giữa các cá nhân là điều khó tránh khỏi trong điều trị, trong đó có các phản ứng có hại của thuốc (Adverse drugs reaction/ADR). Các ADR là một trong những nguyên nhân chính của các trường hợp bệnh nhân phải nhập viện, một số có thể dẫn tới tử vong. Ingelman-Sunberg và cộng sự đã ước tính ADR làm tiêu tốn khoảng 100 tỉ đô la Mỹ, đây cũng là nguyên nhân dẫn tới 100.000 ca tử vong mỗi năm tại Mỹ. Khoảng 7% các ca nhập viện tại Anh và Thụy Điển cũng có nguyên nhân từ các ADR. Từ năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium- CPIC) đã cung cấp các thông tin về việc xét nghiệm di truyền có thể được sử dụng trong tối ưu hóa phác đồ sử dụng thuốc. Đối với một vài loại cặp gen-thuốc, CPIC cũng đã đưa ra những chỉ dẫn về liều dùng cụ thể. Như đã trình bày ở trên, các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 là 4 trong số các gen CYP450 có tính đa hình cao mà các dạng đa hình của chúng khiến cho bệnh nhân có khả năng chuyển hóa từng loại thuốc cụ thể rất khác nhau, từ mạnh tới yếu. Cho tới nay, các hiểu biết về đa dạng di truyền của nhóm gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc ở người Việt Nam còn rất hạn chế. Ngày nay, vai trò của dược lý học di truyền liên quan đến chuyển hóa thuốc và tương tác thuốc trong lâm sàng mang tính cấp bách và rất cần đầu tư nghiên cứu. Hiểu biết về tính đa dạng di truyền của các gen tham gia chuyển hóa thuốc ở người Việt Nam được coi là tiền đề để phát triển lĩnh vực này. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát hiện các allele đã biết cũng như xác định cả những allele mới ở người Việt Nam. Do vậy, số liệu thu được từ nghiên cứu sẽ cung cấp những thông tin khoa học về đa dạng di truyền của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Việt Nam. Đây cũng là những tiền đề có ý nghĩa và đóng góp một phần cho sự phát triển của lĩnh vực di truyền dược học và y học cá thể. Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng cơ sở dữ liê ̣u về đa hình/đô ̣t biế n của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở người Kinh Viê ̣t Nam. - Xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồ ng thời phân tích và dự đoán chức năng của các biế n thể mới.
3 Cách tiếp cận nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là 136 người Kinh khỏe mạnh không có quan hệ huyết thống. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác định tất cả các biến thể nằm trong vùng promoter cùng với tất cả 9 exon và vùng biên của 03 gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6. Đối với gen CYP3A5, phương pháp giải trình tự Sanger cũng được áp dụng nhằm xác định các biến thể đã được công bố là có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bao gồm: *3, *6, *8 và *9. Các CNV của các gen nghiên cứu được xác định bằng phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc phản ứng ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA). Những mẫu được xác định là có bất thường số bản sao được kiểm tra lại bằng phương pháp Long range PCR hoặc real-time PCR. Các biến thể sau khi đã được xác định sẽ tiếp tục được tổng hợp số liệu để tính toán tần số allele cũng như tần số kiểu gen trên tổng số mẫu nghiên cứu đối với mỗi gen. Tiến hành so sánh về tần số và phân bố của các allele của mỗi gen ở quần thể người Kinh Việt Nam so với các quần thể người khác. Bên cạnh đó, những biến thể mới được tiến hành phân tích in silico nhằm dự đoán ảnh hưởng của các biến thể này đến chức năng của protein tương ứng. Những đóng góp mới của luận án: Xác định được một số biến thể mới trong promoter và intron của các gen CYP450, cụ thể: 5 biến thể mới trong in tron của CYP2C9, 3 biến thể mới trong intron của CYP2C19, 3 biến thể mới trong promoter và 2 biến thể mới trong intron của CYP2D6 và 3 biến thể mới thuộc vùng mã hóa của 2 gen CYP2C9 và CYP2D6. Đã phân tích in silico cho thấy những biến thể này gây ảnh hưởng có hại đến chức năng của protein. Các biến thể CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*13 và CYP2D6*36-*10 đã được xác định trên người Kinh ở Việt Nam là những biến thể làm giảm hoặc mất hoạt tính của enzyme đã được xác định với tỉ lệ lần lượt là: 8,09%, 43,75%, 1,547% và 12,13%.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan Thuốc là những chế phẩm có chứa dược chất dùng với mục đích phòng-chữa bệnh hay điều trị giảm nhẹ. Enzyme chuyển hóa thuốc được biết đến nhiều nhất là các enzyme CYP450, đây là những enzyme tham gia vào các quá trình oxi hóa khử và thủy phân. Mục tiêu chính của quá trình chuyển hóa thuốc đó là giúp đào thải thuốc ra khỏi cơ thể. Ví dụ như các tiền chất (không có hoạt tính dược lý) sau khi được hấp thụ vào cơ thể sẽ được chuyển đổi thành thuốc có hoạt tính. Mặt khác đa số các loại thuốc sau khi chuyển hóa sẽ chuyển sang trạng thái kém hoạt động hơn. Quá trình chuyển hóa thuốc xảy ra ở nhiều cơ quan trong cơ thể như gan, thành ruột, phổi, thận và huyết tương. Trong số đó, gan là cơ quan chuyển hóa thuốc đầu tiên, đóng vai trò như vị trí thải độc và loại thải các chất ngoại lai bằng cách biến đổi các hợp chất tan trong lipid trở nên ưa nước hơn, quá trình này có sự tham gia của các enzyme. Quá trình chuyển hóa thuốc tại gan trải qua 3 giai đoạn: pha I, pha II và pha III. Trong đó pha I có sự tham gia của các enzyme CYP450, pha II được thực hiện bởi các enzyme vận chuyển acid glucuronic của UDP (UDP-glucuronosyltransferase) (chuyển hóa 40-70% các loại thuốc) và trong pha III thì các enzyme vận chuyển thuốc (drug transporter) sẽ giúp đưa sản phẩm chuyển hóa thuốc tới mật. Klingenberg lần đầu tiên phát hiện ra CYP450 vào năm 1954 trong nghiên cứu về chuyển hóa hoocmon steroid, khi ông trích xuất một loại protein mới từ tế bào gan [1]. Gần một thập kỷ sau, chức năng và tầm quan trọng của CYP450 đã được xác định. Năm 1963, Estabrook và cộng sự đã mô tả vai trò của CYP450 như một chất xúc tác trong quá trình tổng hợp hormone steroid và chuyển hóa thuốc. Cooper và các đồng nghiệp sau đó đã xác nhận CYP450 là một enzyme chủ chốt liên quan đến phản ứng hydroxyl hóa thuốc và steroid [2]. Nhiều protein CYP450 đã được phát hiện rộng khắp cơ thể, chứng tỏ sự tham gia đáng kể vào hoạt hóa hóa học, khử hoạt tính và gây ung thư [3]. Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I là các protein biểu hiện chủ yếu trên mạng lưới nội chất trơn và ti thể của các tế bào gan và biểu mô ruột non (ngoài ra cũng còn ở một số cơ quan khác). Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm
5 cả các gen giả, được đặt tên bắt đầu từ CYP1A1 và kết thúc bởi CYP51P3. Các protein được mã hóa bởi các CYP450 được phân loại dựa trên mức độ tương đồng về trình tự của các amino acid thành các cấp độ từ họ (ví dụ: họ CYP1, CYP2…), phân họ (ví dụ: phân họ CYP1A, CYP2B…) và từng enzyme riêng lẻ (ví dụ: enzyme CYP1A1, CYP2D6…). Trong số các CYP450 biểu hiện trong gan thì CYP3A4 có mức độ biểu hiện mạnh nhất (chiếm 22,1%), tiếp theo là 2 enzyme CYP2E1 (15,3%) và CYP2C9 (14,6%) tính trên tổng số protein trong gan. Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vòng (nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất không vòng, khử (tách) nhóm N-alkyl, khử (tách) nhóm O-alkyl (alkoxy). Trong số các phản ứng này, phản ứng oxi hóa là phản ứng giúp thêm một nguyên tử oxy vào phân tử thuốc, được biểu diễn bằng phương trình sau: NADPH + H+ + O2 + RH → NADP+ + H2O + ROH Về mặt cấu trúc, CYP450 là những protein có khoảng 400-500 amino acid và chứa một nhóm heme với nguyên tử Fe ở trung tâm. Tất cả các CYP450 đều có chung cấu trúc bảo thủ được tạo nên bởi bốn vòng xoắn D, L, I và E. Trong đó nhóm heme nằm giữa vòng xoắn I và L. Mặc dù cấu trúc dạng gấp cuộn của CYP450 có tính bảo thủ cao, vẫn có sự đa dạng trong cấu trúc của các họ CYP450 khác nhau từ đó cho phép protein này kết hợp với các cơ chất với kích thước khác nhau và mức độ đặc hiệu khác nhau. Một số CYP450 có tính đặc hiệu cao trong quá trình oxi hóa cơ chất, trong khi đó CYP3A4 lại tham gia chuyển hóa hơn 50% các loại thuốc trên thị trường hiện nay. Ở mức độ đơn giản nhất về mặt cấu hình nhận biết và kết hợp với cơ chất thì có 6 vị trí nhận biết cơ chất (Substrate recognition site-SRS). Các vị trí này bao gồm vùng xoắn B' (SRS1), một phần của các chuỗi xoắn F và G (SRS2 và SRS3), một phần của chuỗi xoắn I (SRS4), vùng β2 của chuỗi xoắn K (SRS6) và cấu trúc kẹp tóc β4 (SRS5) ở trung tâm hoạt động của CYP450 (Hình 1.1). Trên thực tế, các SRS định trước tính đặc hiệu cơ chất của các CYP450 và những đột biến điểm xảy ra tại các vị trí này do đó có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu đối với cơ chất [4]. Các SRS là những vùng cấu trúc linh hoạt, có thể di chuyển khi kết hợp với cơ chất và có khả năng cảm ứng phù hợp với cơ chất, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho mối liên kết enzyme-cơ chất và sau đó là phản ứng xúc tác [5].
6 Hình 1.1. Cấu trúc của CYP450 và các vị trí nhận biết cơ chất (SRS) [6]. CYP450 có cấu trúc gấp nếp bảo thủ và được thể hiện bởi các vòng xoắn (đánh dấu bằng các chữ cái in hoa). Các SRS được tô đậm tối màu. 1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc. Các gen chuyển hóa là một phần của hệ các gen dược học. Đây là những gen đóng vai trò quan trọng trong biến đổi sinh học của thuốc, những thay đổi trong di truyền của các gen này góp phần tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong đáp ứng thuốc [7]. Các gen liên quan đến chuyển hóa thuốc bao gồm gen mã hóa cho các enzyme tham gia chuyển hóa thuốc pha I và pha II. Các enzyme chuyển hóa thuốc có mức độ đa hình rất cao trong biểu hiện và hoạt tính của chúng. Các CYP450 chính là nguồn gốc chính gây ra sự đa dạng trong dược động học và dược lý học của thuốc. Các protein CYP450 biểu hiện mạnh nhất trong gan bao gồm CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19, CYP2C8, CYP2E1 và CYP1A2. Trong khi đó các protein CYP2A6, CYP2D6, CYP2B6 và CYP3A5 biểu hiện ít hơn. Các CYP450 khác như CYP2J2, CYP1A1 và CYP1B1 biểu hiện chủ yếu ở ngoài gan. Các kiểu đa
7 hình di truyền khác nhau của các gen CYP450 sẽ quyết định về mặt chức năng và kiểu hình chuyển hóa thuốc (PM, IM, EM và UM). Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất hiện nay là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói trên mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được kê đơn. Trong số các protein thuộc 18 họ CYP450, các protein có tính đa hình cao nhất là CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6 và CYP2C19. Bên cạnh đó có một số protein CYP450 thuộc các phân họ khác có tính đa hình thấp hơn như CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1. Về chức năng chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất, tiếp theo là các enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 và CYP2E (Hình 1.2). Phần tổng quan này trình bày khái quát về đa hình 04 gen mã hóa cho các enzyme CYP450 chính tham gia chuyển hóa thuốc pha I bao gồm: CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5. Hình 1.2. Đa dạng di truyền các gen CYP450 và vai trò trong chuyển hóa thuốc [8]. (a)Số lượng SNP trong một số gen CYP450. (b) Số lượng thuốc được chuyển hóa bởi các enzyme CYP450. Các số trong biểu đồ thể hiện số lượng SNP/thuốc được chuyển hóa. 1.2.1. Gen CYP2C9 Gen CYP2C9 nằm ở vai dài của nhiễm sắc thể số 10, mã hóa cho protein có 490 amino acid và có khối lượng phân tử là 55,6 kDa. Vùng gen chứa CYP2C9 cũng