Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:136

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học "Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra" trình bày các nội dung chính sau: Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam; Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và vùng giàu epitope của gen được lựa chọn; Đánh giá hiệu quả việc tiêm thử nghiệm vắc xin tái tổ hợp trên đàn gia súc tại một số địa phương.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Tuấn Hùng NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY RA LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Tuấn Hùng NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY RA Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy 2. GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội – 2022
LỜI CÁM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh - Nguyên Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen và PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy – Trưởng Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình và khích lệ động viên của các thầy hướng dẫn, đây chính là động lực lớn lao giúp tôi không ngừng phấn đấu và cố gắng vượt qua nhiều khó khăn để có thể hoàn thành Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp tại Phòng Hệ gen học vi sinh, Phòng R&D Công ty Vetvaco đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đơn vị. Bằng những tình cảm chân thành nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Trong quá trình nghiên cứu và học tập, tôi đã nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các nhà khoa học, cán bộ nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Những nhận xét và góp ý chuyên môn sâu sắc trong các buổi báo cáo, hội thảo đã giúp tôi hoàn thiện tốt nhất Luận án của mình. Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, tập thể cán bộ Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại đây. Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn đồng hành và là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nguyễn Tuấn Hùng
LỜI CAM ĐOAN Tôi là: Nguyễn Tuấn Hùng, nghiên cứu sinh Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chuyên ngành Công nghệ sinh học xin cam đoan: 1- Đây là Luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy và GS.TS Nghiêm Ngọc Minh. 2- Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã đƣợc công bố tại Việt Nam. 3- Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã đƣợc xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nguyễn Tuấn Hùng
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt µl Microliter Micro Lít APS Ammonium persulphate Ammonium persulphate bp Base pair Cặp bazơ BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò CBB Coomasie Brilliant Blue Thuốc nhuộm gel SDS cs et.al Cộng sự dH2O Distilled water Nƣớc khử ion DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme nuclease Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotit dNTP Triphosphate Triphosphate E.coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli Ethylene Diamine Tetraacetace EDTA Axit aminopolycarboxylic Acid Isopropyl β-D-1- IPTG Chất cảm ứng biểu hiện gen thiogalactopyranosid Kb Kilobase Kilobasơ kDa Kilo Dalton Kilo Dalton LB Luria - Bertani Môi trƣờng LB LD50 Lethal Dose, 50% Liều gây chết 50% Xoắn khuẩn Leptospira L. interrogans Leptospira interrogans interrogans ml Milliliter Milli Lit OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate buffer saline Nƣớc muối đệm phốt phát PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polimeraza
Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE polyacrylamide gel Điện di trên polyacrylamide electrophoresis TAE buffer Tris-acetate-EDTA Dung dịch đệm TAE Enzyme DNA polymerase chịu Taq Taq polymerase nhiệt TE Tris EDTA Đệm TE chứa Tris N,N,N,N- Hóa chất đƣợc sử dụng trong TEMED Tetramethylethylenediamine đúc gel polyacrylamide
DANH MỤC CÁC BẢNG Số TT Tên Bảng Trang Bảng 1.1. Nhóm huyết thanh và một số serovar của L.interrogans 6 Bảng 2.1. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR trong nghiên cứu 32 Bảng 2.2. Hỗn hợp phản ứng PCR (10 µl) 33 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt vector 37 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nối gen vào vector 38 Bảng 2.5. Thành phẩn gel acrylamide 40 Bảng 2.6. Công thức chia nhóm và dung dịch tiêm mẫm cảm 46 Bảng 2.7. Chuẩn bị các ống nghiệm và thêm vào các chất 48 Bảng 3.1. Số lƣợng và trình tự các vùng giàu epitop của gen LipL21 đƣợc 66 dự đoán bằng các công cụ tin sinh Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân dòng đoạn gen LipL21 69 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra ngƣng kết với chất bổ trợ nhũ dầu 86 Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin 87 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin trên động vật thí nghiệm 87 Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phản ứng vi ngƣng kết 88 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc 95 Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma 96 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Salmonella 97 Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin trên động vật thí nghiệm 98 Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phản ứng vi ngƣng kết 99 Bảng 3.12. Kết quả tiêm thử nghiệm vắc xin trên bản động vật tại thực địa. 100
DANH MỤC CÁC HÌNH Số TT Tên Hình Trang Hình 1.1. Hình dạng Leptospira interrogans dƣới kính hiển vi điện tử quét 8 Hình 1.2. Leptospira interrogans dƣới KHV nền đen (x400) 9 Hình 1.3. Sơ đồ lây truyền Leptospira 13 Hình 1.4. Tỷ lệ nhiễm Leptospirosis hàng năm 16 Hình 2.1. Chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR nhân gen 33 Hình 2.2. Mô tả quá trình tiêm vắc xin rLipL21 và đánh giá hiệu quả tạo 54 miễn dịch trên chuột thí nghiệm Hình 3.1. Hình ảnh sau khi ly tâm thu xoắn khuẩn 55 Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số 56 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mồi 16S rRNA 56 Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR mồi 16S rRNA sau tinh sạch 57 Hình 3.5. Hình ảnh trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA của 5 chủng 58 Leptospira Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại các chủng xoắn khuẩn nghiên cứu 59 o Hình 3.7 A. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi OmpL1 ở Tm 55 C 61 Hình 3.7 B. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LigA ở Tm 55 oC 61 o Hình 3.7 C. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LigB ở Tm 55 C 61 o Hình 3.7 D. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL21 ở Tm 50 C 61 Hình 3.7 E. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL32 ở Tm 50 oC 62 Hình 3.7 F. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL41 ở Tm50 oC 62 Hình 3.8A. Điện di đồ sản phẩm nhân bản toàn bộ gen LipL21 63 Hình 3.8B. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân bản gen LipL21 63 Hình 3.9. Trình tự nucleotit của gen LipL21 64 Hình 3.10. Trình tự axit amin của gen LipL21 65 Hình 3.11. Cấu trúc 3D gen LipL21 của 5 chủng xoắn khuẩn 65 Hình 3.12. Tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET1.2-LipL21 ở tế 71 bào E.coli DH10b Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của 05 chủng Leptospira và 72 trình tự gen LipL21 trong plasmid
Số TT Tên Hình Trang Hình 3.14. Tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pET32a-LipL21 ở tế 75 bào E.coli BL21 Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của Leptospira interogen và 76 trình tự gen LipL21 trong plasmid Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm protein tái tổ hợp LipL21 ở E. coli BL21 77 Hình 3.17. Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu hiện trong các điều kiện 78 nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau Hình 3.18. Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu hiện trong các điều kiện 79 nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau. Hình 3.19. Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu hiện trong các điều kiện 80 thời gian cảm ứng IPTG khác nhau Hình 3.20. Định lƣợng bằng Bradford các phân đoạn tinh sạch 81 Hình 3.21. Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của pET32a-LipL21 81 ở E. coli BL2 đã tinh sạch Hình 3.22. Kết quả ngƣng kết giữa kháng nguyên là protein tái tổ hợp 82 LipL21 với nồng độ khác nhau 100µg, 250µg, 500µg và kháng thể thu đƣợc từ thỏ Hình 3.23. Kết quả của phản ứng MAT giữa chủng Leptospira sống và 83 huyết thanh thu đƣợc Hình 3.24. Phản ứng vi ngƣng kết của protein tái tổ hợp LipL21 đƣợc phối 86 trộn với nhũ dầu với liều tiêm là 1ml và 2ml Hình 3.25. Tỷ lệ chuột tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 sống/ chết sau công 89 cƣờng độc xoắn khuẩn Leptospira Hình 3.26. Hình ảnh chụp các thay đổi mô bệnh học của thận và gan ở 89 chuột thí nghiệm Hình 3.27. Kết quả phản ứng Western blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp 91 rLipL21 và kháng thể đặc hiệu Hình 3.28. Máy tạo nhũ L4RT (Hãng Silverson - Anh Quốc) 94
MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của luận án 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án 2 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án 3 4. Những đóng góp mới của luận án 3 5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án 3 6. Bố cục của luận án 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 5 1.1. Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis 5 1.1.1. Đặc điểm sinh học của xoắn khuẩn Leptospira 5 1.1.1.1. Phân loại học 5 1.1.1.2. Cấu trúc hình thái 8 1.1.1.3. Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira 8 1.1.1.4. Sức đề kháng của mầm bệnh 9 1.1.1.5. Tính sinh miễn dịch 10 1.1.2. Đặc điểm dịch tễ học 11 1.1.2.1. Nguồn bệnh 11 1.1.2.2. Đường xâm nhập của mầm bệnh 12 1.1.2.3. Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira 13 1.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis 14 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên thế giới 14 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên gia súc và người ở 16 Việt Nam 1.2. Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira 18
1.2.1. Đặc điểm toàn bộ hệ gen xoắn khuẩn Leptospira 18 1.2.2. Đặc điểm hệ gen quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn 19 Leptospira 1.2.3. Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira 20 1.3. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 22 1.3.1. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis trên 22 thế giới 1.3.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis tại 24 Việt Nam CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Nguyên liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 28 2.1.1. Vật liệu 28 2.1.2. Hóa chất 29 2.1.3 Trang thiết bị 29 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Tạo kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 mang các epitope 30 2.2.1.1. Nuôi cấy, tăng sinh 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira 30 2.2.1.2. Tách chiết DNA tổng số 30 2.2.1.3. Định lượng, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số 31 2.2.1.4. Thiết kế cặp mồi của gen 16S rRNA và 6 gen quyết định kháng 31 nguyên: OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, và LigB 2.2.1.5. Kỹ thuật PCR 32 2.2.1.6. Tinh sạch sản phẩm PCR 33 2.2.1.7. Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger 34 2.2.1.8. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và định danh chính xác 5 34 chủng Leptospira về mặt phân tử 2.2.1.9. Xác định mức độ tương đồng về trình tự nucleotit và trình tự axit 35 amin, các vùng giàu epitop trên các đoạn gen quyết định kháng nguyên 2.2.1.10. Phản ứng gắn đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng 35 2.2.1.11. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng 36 phương pháp sốc nhiệt
2.2.1.12. Tách chiết và định lượng DNA plasmid 36 2.2.1.13. Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu và vector biểu 37 hiện bằng enzyme giới hạn 2.2.1.14. Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn 38 2.2.1.15. Gắn gen mã hóa protein LipL21 vào vector biểu hiện 38 2.2.1.16. Biểu hiện gen đích trong chủng E. coli BL21 38 2.2.1.17. Điện di DNA trên gel agarose 39 2.2.1.18. Điện di protein trên gel polyacrylamide có chất khử (SDS- 40 PAGE) 2.2.1.19. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli và thu protein tổng số trong 41 phân đoạn dịch chiết và kết tủa tế bào 2.2.1.20. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký protein 42 qua cột ái lực His-bind 2.2.2. Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc 42 hiệu kháng protein tái tổ hợp rLipL21 2.2.2.1. Chuẩn bị dung dịch tiêm để gây miễn dịch 43 2.2.2.2. Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp 44 rLipL21 2.2.2.3. Kỹ thuật phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 46 2.2.2.4. Kỹ thuật phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination 47 Test: MAT) 2.2.2.5. Kĩ thuật Western Blot xác định kháng nguyên rLipL21 48 2.2.3. Kỹ thuật sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 51 2.2.3.1. Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng protein tái tổ hợp 51 rLipL21 khác nhau 2.2.3.2. Kỹ thuật tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 51 2.2.3.3. Định liều tiêm vắc xin 52 2.2.3.4. Quy trình kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 3 2.2.3.5. Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch 53 2.2.3.6. Chế tạo thử nghiệm 600 liều vacxin tái tổ hợp phòng bệnh 54 Leptospirosis 2.3. Phân tích và xử lý kết quả trong nghiên cứu 54
2.4. Địa điểm tiến hành nghiên cứu 54 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1. Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh 55 chủng loại 3.1.1. Nuôi cấy, tăng sinh xoắn khuẩn 55 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số 55 3.1.3. Nhân gen 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu 56 3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rRNA 57 3.1.5. Giải trình tự gen 5 chủng xoắn khuẩn 57 3.1.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại 59 3.2. Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và 60 vùng giàu epitop của gen 3.2.1. Nhân gen với các cặp mồi của 6 gen quyết định kháng nguyên 60 3.2.2. Tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quyết định kháng nguyên 63 xuất hiện trên cả 5 chủng xoắn khuẩn 3.2.3. Xác định trình tự nucleotit, trình tự axit amin và vùng giàu 63 epitop của các gen quyết định kháng nguyên LipL21 3.2.3.1. Trình tự nucleotit 63 3.2.3.2. So sánh trình tự axit amin 65 3.3.3.3. Xác định vùng giàu epitop 66 3.3. Nhân dòng gen quyết định kháng nguyên và biểu hiện 69 protein LipL21 3.3.1. Nhân dòng đoạn gen quyết định kháng nguyên vào vector 69 pJET1.2 trong hệ biểu hiện E.coli DH 10B 3.3.2. Chèn gen LipL21 vào vector biểu hiện pET32a 73 3.3.3. Biểu hiện và tối ưu các điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp 76 LipL21 3.4. Kiểm tra tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp rLipL21 82 3.5. Qui trình chế tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 phòng bệnh 84 Leptospirosis 3.5.1. Xác định chất bổ trợ phối trộn đặc hiệu với kháng nguyên tái 84 tổ hợp rLipL21 để tạo vắc xin tái tổ hợp
3.5.2. Định liều tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu cho động 85 vật thí nghiệm 3.5.3. Kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 87 3.5.3.1. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng 87 3.5.3.2. Đánh giá chỉ tiêu an toàn 87 3.5.3.3. Đánh giá chỉ tiêu hiệu lực 88 3.5.3.4. Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch trên động vật thí nghiệm 88 3.6. Sản xuất vắc xin và các đánh giá khác với vắc xin tái tổ hợp 92 rLipL21 3.6.1. Sản xuất 600 liều vắc xin 92 3.6.2. Kiểm tra các chỉ tiêu của vacxin theo tiêu chuẩn ngành 94 3.6.2.1. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm các loại vi khuẩn và nấm mốc 94 3.6.2.2. Kết quả kiểm tra an toàn 97 3.6.2.3. Kết quả kiểm tra hiệu lực 98 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102 4.1. Kết luận 102 4.2. Kiến nghị 103 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO 105 PHỤ LỤC 121
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang ngƣời phổ biến trên thế giới, đƣợc Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (OIE) xếp vào nhóm thứ 2 của Bệnh nguy hiểm và đƣợc bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam. Nguyên nhân gây ra bởi một loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans. Bệnh lây nhiễm sang ngƣời qua niêm mạc, da, mắt hoặc các màng nhầy tiếp xúc với nƣớc bị ô nhiễm nƣớc tiểu động vật nhiễm bệnh. Bệnh Leptospirosis rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm nhƣ động vật ở ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật nuôi trong gia đình, đồng thời Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong môi trƣờng tự nhiên. Đặc biệt bệnh này càng khó kiểm soát ở những nƣớc nông nghiệp phát triển (kéo theo đàn gia súc đông đúc) và có tình trạng vệ sinh môi trƣờng kém (tạo điều kiện mầm bệnh phát triển). Bệnh do xoắn khuẩn Leptospira là loại vi khuẩn gram (-) gây ra nên có thể điều trị khỏi bằng kháng sinh đặc trị penicillin hoặc các kháng sinh thay thế ampicillin, amoxicillin, tetracyclin, doxycyclin, erythromyxin, streptomycin và cephalosporin,... Tuy nhiên cần phát hiện bệnh sớm, xác định type gây bệnh, giai đoạn mắc bệnh thì mới có phác đồ điều trị hiệu quả. Sau khi khỏi bệnh, vật nuôi có miễn dịch nhƣng chỉ với type huyết thanh mắc bệnh. Do vậy vẫn có thể bị lại với type khác. Hiện nay, trong thời đại công nghệ 4.0, sinh học công nghệ cao rất phát triển nên các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu về sinh học phân tử, các gen tiềm năng làm vacxin tái tổ hợp,…Trong quá trình nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam đang tập trung vào các loại vắc xin có khả năng phòng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao và lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng và động vật. Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhƣợc độc đƣợc thiết kế trên cơ sở trình tự gen và các yếu tố độc lực của các tác nhân gây bệnh để tối ƣu hóa mức độ an toàn của các loại vắc xin. Đây là một bƣớc đột phá thực sự, ứng dụng công nghệ di truyền trong chế tạo vắc xin nói
2 chung và vắc xin Leprospirosis nói riêng. Thực tế, nhiều protein ngoài màng của xoắn khuẩn Leptospira đã đƣợc tìm thấy và thu hoạch, đó là ứng cử viên cho công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp. Quá trình thu hoạch, tái tổ hợp và tinh sạch các protein này đơn giản, hơn nữa protein tái tổ hợp có giá trị tƣơng tự nhƣ kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để phát hiện Leptospires. Các báo cáo cũng cho thấy rằng vắc xin phòng bệnh Leptospirosis tái tổ hợp có miễn dịch cao hơn so với các loại vắc xin thông thƣờng. Do đó, các nghiên cứu về công thức tối ƣu, chất bổ trợ, liều lƣợng và liệu trình để phát triển các loại vắc xin Leptospirosis đạt hiệu quả cao, an toàn cho ngƣời và động vật sử dụng là rất cần thiết. Cho đến thời điểm hiện tại, Việt Nam chƣa có đơn vị nào sản xuất vắc xin Leptospirosis tái tổ hợp trong khi đó dịch tễ của bệnh cho thấy có 5 serovar khác nhau gây bệnh trên động vật nên việc tìm ra gen quyết định kháng nguyên cùng xuất hiện trên cả 5 chủng Leptospira gây bệnh để làm cơ sở sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis là rất cần thiết. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra.” 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Xác định một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng trong chế vắc xin tái tổ hợp chống lại Leptospirosis tại Việt Nam. Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng và chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam. Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và vùng giàu epitope của gen đƣợc lựa chọn. Nhân dòng đoạn gen quyết định kháng nguyên vào vector PJET1.2 trong hệ biểu hiện E.coli DH10b. Biểu hiện gen đích trong chủng E. coli BL21. Sản xuất và tinh sạch protein tái tổ hợp rLipL21. Kiểm tra khả năng gây miễn dịch cho thỏ của kháng nguyên rLipL21.
3 Sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 và kiểm nghiệm vắc xin trong qui mô phòng thí nghiệm. Sản xuất qui mô pilot 600 liều vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis. Đánh giá hiệu quả việc tiêm thử nghiệm vắc xin tái tổ hợp trên đàn gia súc tại một số địa phƣơng. 4. Những đóng góp mới của luận án Bộ dữ liệu phân tử về các gen quyết định kháng nguyên tiềm năng có thể sử dụng cho sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh Leptospirosis phù hợp với đặc điểm dịch bệnh của Việt Nam. Tạo thành công protein tái tổ hợp rLipL21 phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh Leptospirosis. Hoàn chỉnh quy trình sản xuất vắc xin tái tổ hợp Leptospira đạt tiêu chuẩn Việt Nam. Lần đầu tiên sản xuất và thử nghiệm thành công vắc xin tái tổ hợp Leptospira trên quy mô pilot. 5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án Xác định đƣợc các gen gây đáp ứng miễn dịch của xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam, đây là các gen tiềm năng để sử dụng trong nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh Leptospirosis cho động vật tại Việt Nam. Tạo đƣợc protein tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis đảm bảo tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch cao. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin tái tổ hợp Leptospira đạt tiêu chuẩn Việt Nam Sản xuất thử nghiệm 600 liều vắc xin tái tổ hợp Leptospira, kiểm chứng chất lƣợng và các chỉ số an toàn, khả năng bảo hộ miễn dịch trên mô hình in vivo. Sau quá trình thử nghiệm pilot thành công, quy trình sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis sẽ đƣợc chuyển giao cho Công ty Thuốc Thú y Trung ƣơng VETVACO để sản xuất quy mô công nghiệp, phục vụ cho công tác phòng chống dịch bệnh cho động vật tại Việt Nam. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 121 trang, trong đó phần Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài liệu 23 trang; Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 27 trang; Kết quả và thảo luận 47
4 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục công trình của tác giả 1 trang; Tài liệu tham khảo 17 trang gồm 140 tài liệu; Trong luận án có 20 bảng, 34 hình và 4 bài báo trong phần Phụ lục.
5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis 1.1.1. Đặc điểm vi sinh vật học của xoắn khuẩn Leptospira 1.1.1.1. Phân loại học Theo khóa phân loại khoa học Leptospira đƣợc xếp vào Giới: Bacteria Ngành: Spirochaetes Lớp: Spirochaetes Bộ: Spirochaetales Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira Dựa trên sự tƣơng đồng của bộ gen, các xoắn khuẩn thuộc giống Leptospira spp. đã đƣợc chia thành 20 loài [1], bao gồm những loài gây bệnh và không gây bệnh (hoại sinh): Những loài xoắn khuẩn gây bệnh: L. Interrogans, L. Kirschneri, L. Borgpetersenii, L. Santarosai, L. Noguchii, L. Weilii, L. Alexanderi và L. Alstonii. Những loài hoại sinh (không gây bệnh): L. Biflexa, L. Wolbachii, L. Kmetyi, L. Meyeri, L. Vanthielii, L. Terpstrae và L. Yanagawae. Trƣớc năm 1989, chi Leptospira đƣợc chia thành hai loài Leptospira interrogans bao gồm tất cả các chủng gây bệnh và Leptospira biflexa gồm các chủng hoại sinh (không gây bệnh). Sự phân chia này dựa trên các đặc tính kiểu hình và sự sinh trƣởng của chúng nhƣ các chủng hoại sinh có khả năng mọc đƣợc ở nhiệt độ 11-13oC và sinh trƣởng với sự có mặt của 8-azaguanine (225 μg/ml) [2]. Một số loài trung gian gây bệnh hoặc hoại sinh: L. Inadai, L. Broomii, L. Fainei, L. Wolffii và L. Licerasiae [3, 4]. Tuy nhiên, cũng có một số loài lại bao gồm cả các chủng xoắn khuẩn gây bệnh và không gây bệnh. Ngày nay hệ thống phân loại mới dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử và khác hẳn với hệ thống phân loại trƣớc đây dựa trên khảo sát huyết thanh học [5]. Các serovar Leptospira gây bệnh đƣợc xếp vào các nhóm khác nhau dựa vào mối quan hệ kháng nguyên, thông qua việc xác định bằng phản ứng ngƣng kết hay
6 theo kiểu hấp phụ ngƣng kết chéo với kháng nguyên tƣơng đồng [3]. Mặc dù không dựa vào nhóm huyết thanh để phân loại Leptospira nhƣng chúng rất có ý nghĩa về mặt dịch tễ học. Các nhóm huyết thanh của L. interrogans và một số phân loài phổ biến đƣợc thể hiện qua Bảng 1.1 Bảng 1.1. Nhóm huyết thanh và một số serovar của L. interrogans Số TT Nhóm Serovar (s) huyết thanh 1 Icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae, copenhageni, lai, zimbabwe 2 Hebdomadis hebdomadis, jules, kremastos 3 Autumnalis autumnalis, fortbragg, bim, weerasinghe 4 Pyrogenes pyrogenes 5 Bataviae bataviae 6 Gryppotyphosa gryppotyphosa, canalzonae, ratnapura 7 Canicola canicola 8 Australis australis, bratislava, lora 9 Pomona pomona 10 Javanica javanica 11 Sejroe sejroe, saxkoebing, hardjo 12 Panama panama, mangus 13 Cynopteri cynopteri 14 Djasiman djasiman 15 Sarmin sarmin 16 Mini mini, georgia 17 Tarassovi tarassovi 18 Ballum ballum, aroborea 19 Celledoni celledoni 20 Louisiana louisiana, lanka