Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đánh giá định lượng nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus tại bếp ăn tập thể của một số trường tiểu học ở Hà Nội

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:168

Thêm vào BST

Báo xấu

77
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được thực hiện với mục tiêu nhằm đánh giá thực trạng nhiễm S. aureus và độc tố của chúng trong chuỗi cung ứng, chế biến, tiêu thụ một số thức ăn phổ biến có nguy cơ cao tại bếp ăn tập thể ở một số trường tiểu học trên địa bàn Hà Nội. Mô tả định lượng nguy cơ ngộ độc thực phẩm do S. aureus của học sinh tiểu học trên cơ sở phân tích thực trạng nhiễm S. aureus bằng phương pháp đánh giá nguy cơ kết hợp với mô phỏng Monte Carlo. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đánh giá định lượng nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus tại bếp ăn tập thể của một số trường tiểu học ở Hà Nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------------- Nguyễn Thị Giang NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỊNH LƯỢNG NGUY CƠ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO Staphylococcus aureus TẠI BẾP ĂN TẬP THỂ CỦA MỘT SỐ TRƯỜNG TIỂU HỌC Ở HÀ NỘI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------------- Nguyễn Thị Giang NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỊNH LƯỢNG NGUY CƠ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO Staphylococcus aureus TẠI BẾP ĂN TẬP THỂ CỦA MỘT SỐ TRƯỜNG TIỂU HỌC Ở HÀ NỘI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420 101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. PHẠM XUÂN ĐÀ 2. TS. PHẠM THẾ HẢI Hà Nội - 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn của nhóm nghiên cứu. Các số liệu và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Giang
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới hai ngƣời Thầy là PSG.TS. Phạm Xuân Đà - Cục Công tác phía Nam, Bộ Khoa học Công nghệ và TS. Phạm Thế Hải - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên cứu, tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện cho tôi trong thời gian nghiên cứu, thực hiện luận án. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo - Viện trƣởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã quan tâm và tạo mọi điều kiện trong công việc để tôi có thể thực hiện tốt Luận án. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các đồng nghiệp, tập thể cán bộ Khoa Vi sinh vật- Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ, giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Chi cục an toàn vệ sinh thực phẩm Hà Nội đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Hà Huy Tuệ, Viện Dinh Dƣỡng và tập thể cán bộ Khoa sinh học phân tử, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ƣơng đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn Đề tài cấp Sở Khoa học Công nghệ Hà Nội mã số 01C-08/10- 2014-2 đã hỗ trợ kinh phí để tôi hoàn thành Luận án này. Xin chân thành cảm ơn các thành viên tham gia đề tài đã hƣớng dẫn, ủng hộ tôi để hoàn thành tốt nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ của cha mẹ tôi, cha mẹ chồng và sự ủng hộ, động viên, khích lệ của chồng, con. Cảm ơn bạn bè, ngƣời thân đã luôn sát cánh, ủng hộ, quan tâm, động viên để tôi có động lực thực hiện Luận án này. Hà Nội, tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Giang
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 5 DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... 7 DANH MỤC BẢNG................................................................................................... 9 MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 10 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 13 1.1. TỔNG QUAN VỀ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO S. aureus ........................... 13 1.1.1. Tổng quan về S. aureus .............................................................................. 13 1.1.1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố ........................................................... 13 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa .................................................. 14 1.1.2. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus................................................................ 16 1.1.2.1. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus trên thế giới .................................... 16 1.1.2.2. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus ở Việt Nam .................................... 22 1.1.2.3. Triệu chứng ngộ độc thực phẩm do S. aureus .................................... 27 1.1.2.4. Điều trị và phòng ngừa ngộ độc thực phẩm do S. aureus ................... 27 1.1.3. Cơ sở bệnh học của ngộ độc thực phẩm do S. aureus ................................ 28 1.1.3.1. Sự phát triển và sinh độc tổ ruột của S. aureus ................................... 28 1.1.3.2. Gen mã hóa độc tố ruột ....................................................................... 30 1.2. GIẢI PHÁP KIẾM SOÁT AN TOÀN THỰC PHẨM ..................................... 32 1.2.1. Biện pháp kiểm soát an toàn thực phẩm trên thế giới ................................ 33 1.2.2. Biện pháp kiểm soát an toàn thực phẩm ở Việt Nam ................................. 35 1.2.3. Thực trạng ATTP bếp ăn tập thể trƣờng học .............................................. 36 1.3. ĐÁNH GIÁ ĐỊNH LƢỢNG NGUY CƠ VI SINH VẬT - CÁCH TIẾP CẬN MỚI/ ƢU VIỆT TRONG KIỂM SOÁT AN TOÀN THỰC PHẨM ....................... 38 1.3.1. Phân tích nguy cơ và vai trò trong kiểm soát an toàn thực phẩm .............. 38 1.3.2. Vai trò của đánh giá nguy cơ ...................................................................... 41 1.3.2.1. Vai trò của đánh giá nguy cơ trong việc đƣa ra các chính sách quản lý an toàn thực phẩm ..................................................................................................... 41 1.3.2.2. Vai trò của đánh giá nguy cơ đối với cơ sở sản xuất thực phẩm ........ 42 1.3.2.3. Vai trò của đánh giá nguy cơ đối với thƣơng mại toàn cầu ................ 42 1
1.3.3. Các khái niệm cơ bản trong đánh giá nguy cơ an toàn thực phẩm............. 42 1.3.4. Phân loại đánh giá nguy cơ vi sinh vật ....................................................... 43 1.3.5. Phƣơng pháp nhận dạng mối nguy trong đánh giá nguy cơ vi sinh vật trong thực phẩm ........................................................................................................ 44 1.3.6. Phƣơng pháp mô tả mối nguy trong đánh giá nguy cơ vi sinh vật ............. 44 1.3.7. Các phƣơng pháp dùng trong đánh giá phơi nhiễm S. aureus ................... 46 1.3.7.1. Phƣơng pháp định lƣợng S. aureus trong các đối tƣợng mẫu thu thập trong chuỗi cung ứng thực phẩm .............................................................................. 47 1.3.7.2. Phƣơng pháp nhận dạng bằng sinh học phân tử: phƣơng pháp PCR phân tích gen coagulase và gen sinh độc tố .............................................................. 47 1.3.7.3. Phƣơng pháp PFGE phân tích sự nhiễm chéo và truy suất nguồn gốc lây nhiễm S. aureus trong thực phẩm ....................................................................... 48 1.3.7.4. Phƣơng pháp điều tra khẩu phần ......................................................... 49 1.3.7.5. Phƣơng pháp mô phỏng Monte Carlo ................................................. 49 1.3.8. Phƣơng pháp dùng trong mô tả nguy cơ .................................................... 50 1.3.9. Đánh giá sự không chắc chắn ..................................................................... 52 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 53 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................................. 53 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................. 53 2.1.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 53 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu................................................................................... 53 2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ................................................................ 54 2.2.1. Hóa chất, môi trƣờng, chủng chuẩn ........................................................... 54 2.2.2. Trang thiết bị .............................................................................................. 55 2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 55 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................... 55 2.4.1. Các phƣơng pháp dùng trong đánh giá thực trạng nhiễm S. aureus và độc tố .................................................................................................................... 55 2.4.1.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................. 55 2.4.1.2. Cỡ mẫu và chọn mẫu ........................................................................... 55 2.4.1.3. Lấy mẫu thực phẩm ............................................................................. 57 2.4.1.4. Phƣơng pháp lấy mẫu dụng cụ chế biến, chứa đựng thực phẩm, mẫu vệ sinh bàn tay................................................................................................... 57 2
2.4.1.5. Phƣơng pháp định lƣợng S. aureus trong thực phẩm.......................... 58 2.4.1.6. Phƣơng pháp phân tích gen sinh độc tố dựa trên kĩ thuật PCR .......... 59 2.4.1.7. Phƣơng pháp phân tích độc tố ruột SE ................................................ 60 2.4.1.8. Phƣơng pháp điện di trƣờng xung (PFGE) ......................................... 60 2.4.2. Các phƣơng pháp đánh giá định lƣợng nguy cơ S. aureus ......................... 62 2.4.2.1. Nhận dạng mối nguy ........................................................................... 63 2.4.2.2. Mô tả mối nguy ................................................................................... 65 2.4.2.3. Đánh giá phơi nhiễm S. aureus trong thực phẩm................................ 65 2.4.2.4. Mô tả nguy cơ ..................................................................................... 69 2.4.2.5. Phƣơng pháp điều tra khẩu phần ......................................................... 69 2.4.2.6. Phƣơng pháp điều tra KAP ................................................................. 70 2.4.2.7. Xử lý số liệu ........................................................................................ 70 2.5. CÁCH KHỐNG CHẾ SAI SỐ .......................................................................... 70 2.6. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU ................................................................ 70 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 72 3.1. THỰC TRẠNG NHIỄM S. aureus VÀ ĐỘC TỐ ............................................. 72 3.1.1. Sự nhiễm S. aureus và độc tố của chúng trong nguyên liệu chế biến thực phẩm.................................................................................................................. 72 3.1.2. Sự nhiễm S. aureus và độc tố của chúng trong thực phẩm sau chế biến và trƣớc khi tiêu thụ .................................................................................................. 75 3.1.3. Sự nhiễm S. aureus trong dụng cụ chế biến, chứa đựng thực phẩm và bàn tay ngƣời chế biến thực phẩm ....................................................................... 79 3.1.4. Tỉ lệ các chủng S. aureus chứa gen sinh độc tố trong chuỗi cung ứng, chế biến thực phẩm ................................................................................................... 82 3.2. SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC CHỦNG S. aureus TRONG CHUỖI CUNG ỨNG THỰC PHẨM ........................................................................................................... 87 3.3. MÔ TẢ ĐỊNH LƢỢNG NGUY CƠ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO S. aureus .................................................................................................................... 91 3.3.1. Nhận dạng mối nguy .................................................................................. 91 3.3.1.1. S. aureus là mối nguy đối với sức khỏe con ngƣời ............................. 91 3.3.1.2. S. aureus là mối nguy trong bếp ăn tập thể trƣờng tiểu học tại Hà Nội .................................................................................................................. 92 3
3.3.2. Đánh giá phơi nhiễm .................................................................................. 94 3.3.2.1. Tỉ lệ thức ăn chín (thịt lợn, trứng) bị nhiễm S. aureus........................ 94 3.3.2.2. Mức tiêu thụ trứng gia cầm và thịt lợn của học sinh tiểu học ............. 98 3.3.2.3. Liều nhiễm S. aureus khi học sinh ăn thịt lợn và trứng ...................... 98 3.3.3. Mô tả nguy cơ nhiễm độc S. aureus của học sinh khi ăn thịt lợn và trứng gia cầm bị nhiễm ........................................................................................ 99 3.3.3.1. Nguy cơ nhiễm độc S. aureus của học sinh do ăn thịt lợn bị nhiễm ... 100 3.3.3.2. Nguy cơ nhiễm độc S. aureus của học sinh do ăn trứng bị nhiễm ...... 102 3.3.3.3. Nguy cơ nhiễm độc S. aureus của học sinh do ăn cả thịt lợn và trứng bị nhiễm ....................................................................................................................... 104 3.3.4. Bàn luận .................................................................................................... 106 3.3.5. Đề xuất giải pháp can thiệp ...................................................................... 113 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 120 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ....................................... 121 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................................................................................................... 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 123 PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH CÁC TRƢỜNG THAM GIA NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 2: PHIẾU ĐIỀU TRA KHẨU PHẦN PHỤ LỤC 3: BỘ CÂU HỎI ĐIỀU TRA KAP PHỤ LỤC 4: BẢNG KIỂM QUAN SÁT PHỤ LỤC 5: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ SINH ĐỘC TỐ CỦA S. aureus PHỤ LỤC 6: ĐẶC TÍNH CHUNG CỦA SE, NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM SE VÀ VỊ TRÍ GEN MÃ HÓA PHỤ LỤC 7: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU 4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATTP An toàn thực phẩm ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm SX, CB TP Sản xuất, chế biến thực phẩm BĂTT Bếp ăn tập thể CODEX Codex Alimentarius Commission (Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế) CAC Codex Alimentarius Commission (Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm Codex quốc tế) FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Nông lƣơng của Liên hiệp quốc) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) GHP Good Hygienic Practices (Thực hành vệ sinh tốt) GMP Good Manufacturing Practices (Thực hành sản xuất tốt) HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point (Phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn) KAP Knowledge, Attitudes, Practices (Kiến thức, Thái độ, Thực hành) NĐTP Ngộ độc thực phẩm TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam ISO International Organization for Standardization (Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn hóa). PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) SE Staphylococcal enterotoxin (độc tố ruột của tụ cầu) bp Base pair (cặp bazơ) DNA Deoxyribonucleotid acid MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng kháng methicillin). 5
LA-MRSA livestock-associated Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng kháng methicillin liên quan đến vật nuôi) CFU Colony-Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) SD Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) NC Negative Control (Đối chứng âm) PC Positive Control (Đối chứng dƣơng) TSST Toxic shock syndrome toxin (Độc tố gây ra hội chứng sốc nhiễm độc) CI Confident Interval (Khoảng tin cậy) Mean Giá trị trung bình Minimum Giá trị nhỏ nhất Maximum Giá trị lớn nhất Std Dev Standard Deviation: Độ lệch chuẩn 6
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tế bào S. aureus dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 x) ..................... 14 Hình 1.2: S. aureus nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhau .................................. 15 Hình 1.3: Thực phẩm truyền bệnh trong các vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố tụ cầu gây ra ở Châu Âu năm 2010 ..................................................................................... 18 Hình 1.4: Trình tự các amino acid hoàn chỉnh (A) và cấu trúc ba chiều của độc tố SEA (B). .................................................................................................................... 28 Hình 1.5: Đa chức năng sinh học của các SE trong ngộ độc thực phẩm, sốc độc tố và nhiễm trùng .......................................................................................................... 29 Hình 1.6: Cơ chế gây bệnh do độc tố ruột của S. aureus ......................................... 30 Hình 1.7: Cấu trúc chung hệ gen của tụ cầu ............................................................ 31 Hình 1.8: So sánh hệ thống kiểm soát an toàn thực phẩm truyền thống và hiện đại ................................................................................................................. 33 Hình 1.9: Các thành phần của phân tích nguy cơ .................................................... 38 Hình 1.10: Các bƣớc đánh giá nguy cơ .................................................................... 43 Hình 1.11: Phân loại đánh giá nguy cơ vi sinh vật .................................................. 44 Hình 1.12: Đƣờng cong mô tả mối quan hệ liều và đáp ứng ................................... 45 Hình 2.1: Địa điểm lấy mẫu nghiên cứu .................................................................. 53 Hình 2.2: Quy trình phân tích S. aureus .................................................................. 58 Hình 2.3: Quy trình phân tích PFGE ....................................................................... 61 Hình 2.4: Quy trình đánh giá định lƣợng nguy cơ S. aureus trong thực phẩm ....... 63 H nh 2 5: Sơ đồ mô tả quá trình phơi nhiễm với S. aureus trong thực phẩm từ trang trại đến bàn ăn (farm-to-fork) ...................................................................... 66 Hình 2.6: Con đƣờng phơi nhiễm S. aureus trong bếp ăn tập thể ........................... 67 Hình 3.1: Tỉ lệ nhiễm S. aureus ở các mẫu thịt nguyên liệu.................................... 73 Hình 3.2: Tỉ lệ mẫu thực phẩm sau chế biến trƣớc tiêu thụ nhiễm S. aureus tính trên tổng số mẫu xét nghiệm.............................................................................. 76 Hình 3.3: Tỉ lệ nhóm mẫu dƣơng tính trên tổng số mẫu bị nhiễm S. aureus........... 77 Hình 3.4: Tỉ lệ S. aureus chứa gen sinh độc tố trên tổng số mẫu dƣơng tính .......... 82 Hình 3.5: Kết quả điện di các chủng dƣơng tính với gen sinh độc tố...................... 83 Hình 3.6: Tỉ lệ phân bố các gen độc tố trên các đối tƣợng mẫu .............................. 83 7
Hình 3.7: Kết quả phân tích PFGE các chủng nghiên cứu ...................................... 88 Hình 3.8: Hàm phân bố xác suất nhiễm S. aureus ở các mật độ khác nhau của thức ăn chế biến từ thịt lợn ................................................................................. 96 Hình 3.9: Hàm phân bố xác suất nhiễm S. aureus ở các mật độ khác nhau của thức ăn chế biến từ trứng .................................................................................... 97 Hình 3.10: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus sau một lần ăn thịt lợn bị nhiễm .......... 101 Hình 3.11: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus sau 1tháng ăn thịt lợn bị nhiễm ........... 101 Hình 3.12: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus sau một lần ăn trứng bị nhiễm ............. 103 Hình 3.13: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus sau 1 tháng ăn trứng bị nhiễm ............. 104 Hình 3.14: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus sau một lần ăn thịt lợn và trứng bị nhiễm .................................................................................................................. 105 Hình 3.15: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus sau 1 tháng ăn trứng và thịt lợn bị nhiễm .................................................................................................................. 106 Hình 3.16: Quyết định hình cây để xác định các điểm kiểm soát trọng điểm (CCP) ...................................................................................................................... 115 8
DANH MỤC BẢNG Bảng 1 1: Ngộ độc thực phẩm trên thế giới do S. aureus (>50 ca và/ hoặc ≥1 tử vong) .................................................................................... 21 Bảng 1 2: Một số vụ ngộ độc thực phẩm tiêu biểu do S. aureus tại Việt Nam từ 2011 đến nay. ........................................................................................................ 24 Bảng 1 3: So sánh mô hình hàm số mũ và hàm Beta-Poisson ................................. 46 Bảng 1 4: So sánh hai phƣơng pháp mô tả nguy cơ trung bình và mô phỏng Monte Carlo .............................................................................................................. 51 Bảng 2 1: Danh mục hóa chất, môi trƣờng, chủng chuẩn ........................................ 54 Bảng 2 2: Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR ............................................. 59 Bảng 2 3: Các bƣớc chính nhận dạng mối nguy [31]............................................... 64 Bảng 2 4: Phƣơng pháp đánh giá phơi nhiễm .......................................................... 65 Bảng 2 5: Mô tả biến số đánh giá phơi nhiễm ......................................................... 68 Bảng 3 1: Kết quả phân tích mẫu nguyên liệu nhiễm S. aureus .............................. 72 Bảng 3 2: Kết quả phân tích S. aureus và ngoại độc tố trên mẫu thực phẩm sau chế biến và trƣớc tiêu thụ ................................................................................... 75 Bảng 3 3: So sánh kết quả phân tích S. aureus với quy định hiện hành .................. 76 Bảng 3 4: Tỉ lệ nhiễm S. aureus trong dụng cụ và bàn tay ngƣời chế biến thực phẩm.................................................................................................................. 79 Bảng 3 5: Các nhóm chủng S. aureus có quan hệ gần ............................................. 89 Bảng 3 6: Kết quả đánh giá kiến thức, thực hành, điều kiện ATTP của BĂTT trƣờng tiểu học Hà Nội ............................................................................................. 93 Bảng 3 7: Mức độ nhiễm S. aureus trong thức ăn chín tại bếp ăn tập thể các trƣờng học ........................................................................................................... 95 Bảng 3 8: Mức tiêu thụ trứng gia cầm và thịt lợn của học sinh tiểu học ................. 98 Bảng 3 9: Liều nhiễm S. aureus trong một lần ăn thịt lợn và trứng gia cầm ........... 98 Bảng 3 10: Các thông số và công thức trong đánh giá nguy cơ nhiễm độc S. aureus của học sinh khi ăn thịt lợn và trứng ......................................................................... 99 Bảng 3 11: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus do ăn thịt lợn bị nhiễm ........................ 100 Bảng 3 12: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus do ăn trứng bị nhiễm ........................... 102 Bảng 3 13: Nguy cơ nhiễm độc S. aureus do ăn cả thịt lợn và trứng bị nhiễm ..... 105 Bảng 3 14: Phân tích mối nguy S. aureus trong quy trình chế biến thực phẩm (trứng, thịt) tại trƣờng học ...................................................................................... 116 Bảng 3 15: Kế hoạch HACCP ................................................................................ 118 9
MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm và các bệnh do thực phẩm gây ra thƣờng nằm trong số những bệnh phổ biến nhất ảnh hƣớng tới sức khỏe cộng đồng, tạo gánh nặng kinh tế và xã hội do đó đây là mối quan tâm mà tất cả các quốc gia cần phải giải quyết [163]. Mức độ nghiêm trọng của ngộ độc thực phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố: số lƣợng vi khuẩn ăn phải, điều kiện sinh độc tố, độc lực, lứa tuổi, tình trạng sức khỏe... Cùng một mức độ tiêu thụ nhƣng các đối tƣợng chịu hậu quả nghiêm trọng hơn là trẻ nhỏ, ngƣời già, ngƣời ốm, ngƣời suy giảm miễn dịch. Do vậy, đây là những đối tƣợng cần đƣợc quan tâm đúng mức để làm giảm áp lực trong cuộc sống và góp phần thúc đẩy sự phát triển kinh tế xã hội. Mô hình trƣờng tiểu học bán trú phổ biến hiện nay có nhiều ƣu điểm, song cũng còn nhiều tồn tại cần khắc phục liên quan đến các bếp ăn tập thể phục vụ học sinh, cụ thể là: vẫn còn xảy ra ngộ độc thực phẩm nhân viên phục vụ bếp ăn vẫn còn chƣa thực hiện đúng quy định đối với ngƣời chế biến thực phẩm [21, 34, 35, 48, 50, 54] nên tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm chéo... Do vậy, ngộ độc thực phẩm vẫn luôn là nguy cơ đe dọa sức khỏe học đƣờng bất chấp những cố gắng, nỗ lực của chính quyền nhằm cải thiện an toàn vệ sinh thực phẩm. Theo số liệu thống kê của Cục An toàn thực phẩm trong giai đoạn từ năm 2014-2018, các vụ ngộ độc thực phẩm tại bếp ăn tập thể, bếp ăn trƣờng học đứng thứ hai chiếm 26,6% và căn nguyên gây ngộ độc do vi sinh vật đứng đầu chiếm 40,22%. Staphylococcus aureus (S. aureus) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật ở bếp ăn tập thể nói chung và bếp ăn trƣờng học nói riêng [14]. Với vai trò là trung tâm kinh tế, chính trị, văn hóa của cả nƣớc, Hà Nội thu hút số lƣợng dân di cƣ từ các vùng lân cận đến sinh sống, làm việc nên dân số ngày một tăng, kéo theo chăm sóc y tế và vấn đề sử dụng thực phẩm cũng gia tăng tƣơng ứng. Số lƣợng BĂTT ngày càng gia tăng theo từng năm, đặc biệt khi nhu cầu ăn bán trú tại các trƣờng học cần đƣợc đáp ứng để phù hợp với nhịp sống đô 10
thị. Các BĂTT nếu không tuân thủ nghiêm ngặt theo quy định về ATTP sẽ dẫn đến các vụ ngộ độc thực phẩm và khi đó hậu quả để lại sẽ khó lƣờng. Thực trạng trên đặt ra yêu cầu cấp thiết phải có các giải pháp hiệu quả để khắc phục, đặc biệt trong công tác đánh giá nguy cơ ngộ độc thực phẩm để ngăn chặn, phòng tránh. Trong các mô hình kiểm soát an toàn thực phẩm tiên tiến đƣợc áp dụng trên thế giới mang lại hiệu quả thiết thực đều có bƣớc phân tích và đánh giá định lƣợng nguy cơ của các mối nguy trong thực phẩm. Cách tiếp cận mới này giúp đánh giá xác thực hơn mối liên quan giữa các mối nguy trong thực phẩm với các rủi ro về sức khỏe con ngƣời, việc mà trƣớc kia chƣa làm đƣợc. Dựa trên khoa học phân tích mối nguy, các quy trình ra quyết định, phân tích nguy cơ sẽ góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh do thực phẩm gây ra và liên tục cải thiện an toàn thực phẩm [85]. Vì nhiều nguyên nhân về điều kiện kinh tế, xã hội, Việt Nam đi chậm hơn các nƣớc trong việc áp dụng mô hình phân tích và đánh giá định lƣợng nguy cơ để đảm bảo an toàn thực phẩm. Đến nay, các dự án, chƣơng trình đánh giá nguy cơ an toàn thực phẩm ở Việt Nam còn rất hạn chế và chƣa đầy đủ. Các đề tài, dự án thƣờng dừng lại ở mức độ giám sát, đƣa ra tỉ lệ nhiễm trung bình mà chƣa chỉ ra đƣợc nguy cơ ngộ độc cụ thể, chƣa thực sự đi sâu vào toàn bộ hệ thống sản xuất, chế biến và đặc biệt là dịch vụ ăn uống. Các nghiên cứu về ngộ độc thực phẩm ở nƣớc ta chủ yếu là hồi cứu sau khi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra để tìm nguyên nhân mà chƣa có sự cảnh báo định lƣợng về nguy cơ trƣớc đó. Phƣơng pháp đánh giá nguy cơ kết hợp với mô phỏng Monte Carlo có thể đƣa ra số liệu định lƣợng nguy cơ và dự báo nguy cơ tiềm ẩn, qua đó có thể làm nổi bật nguy cơ cần kiểm soát. Do vậy sẽ làm tăng hiệu quả trong tập huấn và truyền thông nguy cơ cũng nhƣ giúp các cơ quan quản lý đƣa ra các chính sách cụ thể và thiết thực nhằm hạn chế ngộ độc thực phẩm. Xuất phát từ những điểm phân tích trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá định lƣợng nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus tại bếp ăn tập thể của một số trƣờng tiểu học ở Hà Nội ” với kết quả đƣợc báo cáo trong luận án này. 11
Mục tiêu của luận án: 1. Đánh giá thực trạng nhiễm S. aureus và độc tố của chúng trong chuỗi cung ứng, chế biến, tiêu thụ một số thức ăn phổ biến có nguy cơ cao tại bếp ăn tập thể ở một số trƣờng tiểu học trên địa bàn Hà Nội. 2. Mô tả định lƣợng nguy cơ ngộ độc thực phẩm do S. aureus của học sinh tiểu học trên cơ sở phân tích thực trạng nhiễm S. aureus bằng phƣơng pháp đánh giá nguy cơ kết hợp với mô phỏng Monte Carlo. 3. Đƣa ra cảnh báo nguồn và con đƣờng lây nhiễm S. aureus trong thực phẩm đã chế biến, từ đó đề xuất giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu ngộ độc thực phẩm do S. aureus tại các bếp ăn tập thể trƣờng tiểu học. Những đóng góp mới của Luận án: 1. Đây là công trình đầu tiên đánh giá định lƣợng nguy cơ ngộ độc thực phẩm do S. aureus trong bếp ăn tập thể ở một số trƣờng tiểu học tại Hà Nội thông qua việc áp dụng đánh giá nguy cơ vi sinh vật kết hợp với phƣơng pháp mô phỏng Monte Carlo để tăng độ chính xác trong dự báo nguy cơ và khắc phục đƣợc một số hạn chế của cả hai phƣơng pháp khi áp dụng riêng rẽ. 2. Đã đánh giá đƣợc thực trạng nhiễm S. aureus và đƣa ra cảnh báo nguy cơ ngộ độc thực phẩm do S. aureus trong một số loại thực phẩm nguy cơ cao ở điều kiện chế biến và tiêu thụ tại bếp ăn tập thể một số trƣờng tiểu học Hà Nội. 3. Đã đƣa ra đƣợc bằng chứng khoa học giúp cảnh báo về nguồn và con đƣờng lây nhiễm S. aureus trong thực phẩm đã chế biến, từ đó đề xuất giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu ngộ độc thực phẩm do S. aureus tại các bếp ăn tập thể trƣờng tiểu học. 12
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO S. aureus 1.1.1. Tổng quan về S. aureus 1.1.1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố Phân loại Tụ cầu (Staphylococcus) thuộc họ Micrococcaceae, chi Staphylococcus đã đƣợc phân loại thành hơn ba mƣơi loài và dƣới loài bởi sự phân tích sinh hóa và sự lai DNA-DNA. Các loài thuộc chi này gồm S. aureus, S. intermedius, S. chromogens, S. cohnii, S. caprae,S. caseolyticus, S. delphini, S. epidermidis, S. felis, S. allinarum..., S. aureus là loài đầu tiên trong chi Staphylococcus liên quan đến ngộ độc thực phẩm [7, 61]. Đặc điểm phân bố S. aureus là vi khuẩn gây bệnh cơ hội cƣ trú bình thƣờng ở da và màng nhày ở ngƣời. S. aureus đƣợc ƣớc tính cƣ trú thƣờng xuyên ở 20 - 30% dân cƣ và cƣ trú không liên tục ở 60% dân cƣ nói chung. S. aureus thƣờng có ở trên bề mặt da do khả năng chịu đƣợc độ ẩm thấp và nồng độ muối cao lên đến 15% [134]. S. aureus có khả năng sống sót trên các môi trƣờng khô và có nhiều chất ức chế nhƣ mũi ngƣời, da và các bề mặt môi trƣờng, quần áo. S. aureus dễ lây truyền từ ngƣời sang ngƣời qua đƣờng tiếp xúc trực tiếp [74, 86]. Nó có thể xâm nhập vào sâu trong tế bào da do bị bỏng, có các vết thƣơng hở, có vết côn trùng cắn hoặc bị mắc các bệnh về da nhƣ trứng cá, vẩy nến, eczema...tạo thành các mụn mủ trên da, các ổ apxe. Khi mụn mủ hoặc ổ apxe vỡ sẽ giải phóng ra vi khuẩn và độc tố. Vì S. aureus không có tính cạnh tranh cao với hệ vi sinh vật trong thực phẩm sống nên sự nhiễm vào thực phẩm chủ yếu là do bàn tay ngƣời chế biến thực phẩm, tiếp theo là do quá trình bảo quản không thích hợp giúp cho vi khuẩn phát triển và sinh độc tố. Tuy nhiên, S. aureus cũng có mặt trong các thực phẩm nguồn gốc động vật, sữa động vật, đặc biệt sữa vắt từ các động vật bị viêm vú. Không khí, bụi và các bề mặt tiếp xúc cũng là đƣờng truyền S. aureus vào thực phẩm [60]. 13
Thực phẩm có nguy cơ cao ngộ độc thực phẩm do S. aureus bao gồm thịt và sản phẩm thịt, gia cầm, trứng và sản phẩm từ trứng, sữa và sản phẩm sữa, salad, bánh phủ kem, sandwich.... những thực phẩm cần có giai đoạn chuẩn bị bằng tay và đƣợc giữ ở nhiệt độ cao hơn 4°C trong một thời gian dài sau khi chế biến [60, 86]. 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa S. aureus là cầu khuẩn Gram dƣơng (đƣờng kính khoảng 1 µm), có thể đứng riêng rẽ, xếp đôi hoặc tụ thành đám hình chùm nho. S. aureus tạo khuẩn lạc màu vàng trên thạch dinh dƣỡng. Thành tế bào chứa 3 thành phần chính: peptidoglycan bao gồm các đơn vị N-acetyl glucosamine β-1,4 liên kết với axit muramic N-acetyl; một axit teichoic ribitol liên kết với một muramyl-6-phosphate và Protein A qua N- acetyl mannosaminyl-β-1,4-N-acetyl glucosamine. Chúng liên kết cộng hóa trị với peptidoglycan và đặc biệt đƣợc đặc trƣng bởi khả năng liên kết với thành phần Fc của globulin miễn dịch trong huyết tƣơng gây ra sự tự ngƣng kết. Hầu hết các loài khác của tụ cầu thiếu protein A trong thành tế bào của chúng [61]. Hình 1.1: Tế bào S. aureus dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 x) [61] S. aureus là vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, khả năng sống và phát triển của S. aureus phụ thuộc vào một số điều kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, nƣớc hoạt tính (aw), pH, oxy, thành phần và cấu trúc thực phẩm (xem Phụ lục 5) [143]. S. aureus có thể sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng (từ 7-48,5oC; tối ƣu ở 30-37oC), pH (từ 4,2-9,3; tối ƣu ở 7-7,50 và nồng độ muối lên đến 15% NaCl [60]. 14
S. aureus sinh enzym catalase, lên men đƣờng glucose, mannitol và có phản ứng oxydase âm tính. Nó gây đông huyết tƣơng thỏ và sinh nuclease chịu nhiệt. S. aureus nhạy cảm với lysostaphin [61]. Nhờ các đặc tính trên mà S. aureus có thể phát hiện trên các môi trƣờng khác nhau:  Trên thạch Manitol salt: khuẩn lạc màu vàng do lên men đƣờng manitol. Đây là môi trƣờng chọn lọc rất tốt cho sự hồi phục của S. aureus khi nuôi cấy mẫu phân để điều tra ngộ độc thực phẩm (S. epidermidis khuẩn lạc trắng không lên men đƣờng manitol; S. saprophyticus khuẩn lạc màu vàng, lên men đƣờng manitol nhƣng không có enzyme coagulase) [19].  Trên thạch máu (cừu hoặc thỏ): khuẩn lạc màu vàng, phân giải máu dạng β (xuất hiện vòng trong xung quanh khuẩn lạc do phân giải máu hoàn toàn) khi nuôi cấy ở điều kiện có 20% CO2 (trong khi đó, S. epidermidis, S. saprophyticus không phân giải hồng cầu) [19].  Trên môi trƣờng Bair - Parker: khuẩn lạc điển hình có màu đen nhánh, bóng, lồi, đƣờng kính 1-1,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vòng trong (do lecithinase thủy phân lecithin trong lòng đỏ trứng) và vòng đục (do lipase thủy phân lipid) [3]. S. aureus trên Chapman S. aureus trên thạch máu S. aureus trên thạch Bair agar [147]. (gây tan huyết beta) [62]. parker (kết quả của tác giả). Hình 1.2: S. aureus nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhau S. aureus sinh ra nhiều loại enzyme và các độc tố, bao gồm 4 loại hemolysins gây tan huyết (alpha, beta, gamma và delta), các enzyme nucleases, proteases, 15
lipases, lyaluronidase và enzyme collagenase. Một số chủng sinh ra nhiều protein ngoại bào nhƣ độc tố gây hoại tử da (exfoliative toxins), leukocidin, độc tố TSST- 1 (toxic shock syndrome toxin 1 và enterotoxin (độc tố ruột gây nôn và tiêu chảy, thƣờng xảy ra ở các vụ ngộ độc thực phẩm) [124, 134]. Sau đây là đặc điểm cụ thể của một số thành phần trên:  Lyaluronidase: làm giảm chất gian bào của tế bào chủ và giúp tụ cầu lan rộng sang các vùng xung quanh  Leukocidin: protein đa thành phần giúp hủy máu nhƣng yếu hơn alpha hemolysin  TSST- 1 (toxic shock syndrome toxin 1): độc tố gây ra hội chứng sốc nhiễm độc tụ cầu  Enterotoxin: độc tố ruột gây nôn và tiêu chảy, thƣờng xảy ra ở các vụ ngộ độc thực phẩm 1.1.2. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus ―Ngộ độc thực phẩm‖ là hội chứng cấp tính xảy ra do ăn, uống phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu chứng dạ dày - ruột, thần kinh hoặc những triệu chứng khác tuỳ theo tác nhân gây ngộ độc [9]. ―Vụ ngộ độc thực phẩm‖ là tình trạng ngộ độc cấp xảy ra với 2 ngƣời trở lên có dấu hiệu ngộ độc khi ăn cùng một loại thực phẩm tại cùng một địa điểm, thời gian. Trƣờng hợp chỉ có một ngƣời mắc và bị tử vong cũng đƣợc coi là một vụ ngộ độc thực phẩm [9]. 1.1.2.1. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus trên thế giới An toàn thực phẩm là vấn đề đƣợc quan tâm hàng đầu trên toàn thế giới và là một trong 13 mục tiêu chiến lƣợc của WHO giai đoạn 2008 - 2013. Ở Châu Âu, năm 2009 có tới 5.550 vụ ngộ độc thực phẩm với 49.000 ngƣời mắc và 46 ngƣời chết. Trong số đó, 293 vụ có nguyên nhân là do Staphylococcus spp. và các độc tố vi khuẩn (của Bacillus, Clostridium và Staphylococcus) [143]. Theo báo cáo thƣờng niên của tổ chức Y tế thế giới (WHO), mỗi năm trên thế giới có khoảng 40 triệu vụ ngộ độc xảy ra, riêng khu vực Châu Á - Thái Bình Dƣơng chiếm tới 50%. Nghiêm trọng hơn là có tới 50% ca tử vong trên toàn cầu liên quan đến vấn đề an toàn thực 16