Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:180

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án đã khai thác và nghiên cứu cấu trúc của endoglucanase GH5 chứa module FN3 là cấu trúc mới, ít được nghiên cứu và công bố trên thế giới. Module FN3 trong cấu trúc này được chứng minh có khả năng ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất tan là CMC.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Khánh Hoàng Việt NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VÀ VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ MODULE TRONG CẤU TRÚC ENZYME THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG DẠ CỎ CỦA DÊ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Khánh Hoàng Việt NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VÀ VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ MODULE TRONG CẤU TRÚC ENZYME THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG DẠ CỎ CỦA DÊ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. Trương Nam Hải 2. PGS. TS. Đỗ Thị Huyền Hà Nội – 2020
i LỜI CAM ĐOAN Luận án này là công trình nghiên cứu được thực hiện chủ yếu bởi cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. TS. Trƣơng Nam Hải và PGS. TS. Đỗ Thị Huyền. Phần lớn kết quả nghiên cứu đã được đăng tải trên các bài báo khoa học, một phần khác chưa được công bố. Các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Nghiên cứu sinh Nguyễn Khánh Hoàng Việt
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trƣơng Nam Hải, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và PGS. TS. Đỗ Thị Huyền, trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các cán bộ, thầy cô tại Học viện Khoa học và Công nghệ, và Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi kiến thức chuyên môn và các kỹ năng cần thiết, cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm thủ tục bảo vệ luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học - nơi tôi thực hiện luận án này - đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn quý báu. Để hoàn thành luận án này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thủ trưởng và các đồng chí tại nơi tôi công tác là Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học và Công nghệ quân sự đã luôn động viên, khuyến khích, hỗ trợ về mọi mặt cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu luận án. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài độc lập cấp Nhà nước (Mã số: ĐTĐLCN.15/14) và Đề tài thuộc hướng KH&CN ưu tiên cấp Viện Hàn lâm KH- CNVN (Mã số: VAST02.05/18-19) do PGS. TS. Đỗ Thị Huyền làm chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Khánh Hoàng Việt
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT…………….…………….….vii DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………………..……….ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ……...………………………………………… xx MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 5 1.1. Tổng quan về cellulose ....................................................................................... 5 1.1.1. Thành phần và cấu trúc của cellulose .................................................... 5 1.1.2. Vai trò của sinh khối cellulose trong nền kinh tế sinh học ...................... 8 1.2. Cellulase ............................................................................................................ 10 1.2.1. Khái quát chung về celllulase ................................................................... 10 1.2.2. Nguồn gốc của cellulase ........................................................................... 12 1.2.3. Cấu trúc của cellulase .............................................................................. 14 1.2.4. Cellulosome .............................................................................................. 20 1.2.5. Cơ chế thủy phân cellulose ....................................................................... 21 1.2.6. Ứng dụng của cellulase ............................................................................ 23 1.3. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen ........................................ 25 1.3.1. Khái quát về Metagenomics .................................................................. 25 1.3.2. Các phương pháp tiếp cận gen mới bằng kỹ thuật Metagenomics ........ 28 1.3.2.1. Metagenomics dựa vào chức năng ....................................................28 1.3.2.2. Metagenomics dựa vào giải trình tự DNA đa hệ gen ........................29 1.3.3. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen ................................ 30 1.3.3.1. Khai thác gen mới ứng dụng trong công nghiệp ...............................30 1.3.3.2. Khai thác gen mới mã hóa cho cellulase ...........................................31 1.3.3.3. Sàng lọc gen mã hóa cellulase từ dạ cỏ dê ........................................32 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 35 2.1. Đối tƣợng, vật liệu hóa chất và thiết bị máy móc .......................................... 35 2.1.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ......................................................... 35 2.1.2. Hóa chất và thiết bị máy móc ............................................................... 35
iv 2.1.2.1. Hoá chất và môi trường .....................................................................35 2.1.2.2. Máy móc và thiết bị ............................................................................37 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 38 2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử, vi sinh vật .................................... 38 2.2.1.1. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli......................................38 2.2.1.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli ...........................38 2.2.1.3. Cắt và ghép nối gen ...........................................................................38 2.2.1.4. Điện di trên gel agarose ....................................................................39 2.2.1.5. Tinh chế DNA từ gel agarose.............................................................40 2.2.1.6. Tối ưu mã và tổng hợp gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose ......40 2.2.1.7. Thiết kế vector biểu hiện ....................................................................40 2.2.2. Các phương pháp hóa sinh protein ....................................................... 43 2.2.2.1. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli ..........................................43 2.2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide ............................................43 2.2.2.3. Tinh chế protein bằng sắc kí ái lực his-tag .......................................44 2.2.2.4. Xác định độ sạch của enzyme bằng Quantity One.............................45 2.2.2.5. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford .............................45 2.2.2.6. Xác định hoạt tính endoglucanase .....................................................46 2.2.2.7. Đánh giá ảnh hưởng của SFn3 và SXFn3 đến CMC và giấy lọc ......48 2.2.2.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại, hóa chất lên enzyme ......50 2.2.2.9. Xác định độ bền nhiệt của enzyme .....................................................51 2.2.2.10. Xác định thông số động học của enzyme .........................................51 2.2.3. Các phương pháp tin sinh học .............................................................. 43 2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu Pfam của các trình tự ...............................52 2.2.3.2. Nghiên cứu vùng bảo thủ và cấu trúc bậc ba của các trình tự ..........52 2.2.3.3. Dự đoán khả năng chịu kiềm/acid .....................................................53 2.2.3.4. Dự đoán khả năng chịu nhiệt của enzyme .........................................54 2.2.4. Xử lý số liệu .......................................................................................... 54 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 55 3.1. Đánh giá sự đa dạng GH và cấu trúc module của cellulase ......................... 55 3.1.1. Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc các họ GH cellulase ......................... 55 3.1.2. Đánh giá đa dạng cấu trúc cellulase hoàn thiện có cấu trúc module ... 57 3.1.3. Đánh giá đa dạng nguồn gốc các ORF mã hóa cellulase ..................... 61 3.1.4. Đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự axit amin suy diễn ....... 64
v 3.1.5. Ước đoán một số tính chất vật lý của enzyme suy diễn từ trình tự ........ 65 3.2. Nghiên cứu lựa chọn các trình tự có cấu trúc module điển hình ................ 68 3.2.1. Khảo sát cấu trúc bậc 3 của trình tự chứa module FN3 .......................... 68 3.2.2. Khảo sát giá trị pI, pH của trình tự chứa module FN3 ............................ 70 3.3. Tách dòng gen XFn3Egc .................................................................................. 72 3.3.1. Phân tích tối ưu mã bộ ba của trình tự XFn3Egc ................................. 72 3.3.2. Tạo vector biểu hiện pETSUMO mang các gen .................................... 74 3.3.3. Chọn dòng các plasmid pETSUMO mang gen ...................................... 74 3.3.3.1. Chọn dòng vector pETSUMO-Fn3 ....................................................75 3.3.3.2. Chọn dòng vector pETSUMO-Egc ....................................................76 3.3.3.3. Chọn dòng vector pETSUMO-Fn3Egc ..............................................76 3.3.3.4. Chọn dòng vector pETSUMO-XFn3Egc............................................77 3.3.3.5. Chọn dòng vector pETSUMO-XFn3 ..................................................78 3.4. Biểu hiện các gen trong tế bào E. coli ............................................................. 79 3.4.1. Khảo sát điều kiện biểu hiện các gen .................................................... 79 3.4.2. Kiểm tra protein tái tổ hợp được biểu hiện ở pha tan ........................... 81 3.4.3. Kiểm tra hoạt tính endoglucanase ........................................................ 82 3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp và xác định hoạt tính ......................................... 85 3.5.1. Tinh chế protein tái tổ hợp ................................................................... 85 3.5.1.1. Tinh chế protein SFn3 ........................................................................85 3.5.1.2. Tinh chế protein SFn3Egc .................................................................86 3.5.1.3. Tinh chế protein SXFn3Egc ...............................................................87 3.5.1.4. Tinh chế protein SXFn3 .....................................................................89 3.5.2. Đánh giá hoạt tính của các protein sau tinh chế .................................. 90 3.5.2.1. Đánh giá hoạt tính riêng rẽ của các protein trên cơ chất CMC .......90 3.5.2.2. Đánh giá SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính của enzyme trên CMC ...91 3.5.2.3. Đánh giá SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính enzyme trên giấy lọc......92 3.5.3. Đánh giá khả năng Fn3 làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất ......... 94 3.5.3.1. Trên cơ chất CMC..............................................................................95 3.5.3.2. Trên cơ chất giấy lọc .........................................................................97 3.5.3.3. Đánh giá khả năng nới lỏng cấu trúc tinh thể trên bề mặt giấy lọc ..98 3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên sự hấp phụ SFn3, SXFn3 với cơ chất 99 3.5.4.1. Ảnh hưởng của pH lên sự hấp phụ của SFn3, SXFn3 với cơ chất ....99 3.5.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hấp phụ SFn3, SXFn3 với cơ chất 100
vi 3.6. Đánh giá một số tính chất của enzyme có cấu trúc hoàn thiện ............... 101 3.6.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của SXFn3Egc ................................ 101 3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của SXFn3Egc ........................ 103 3.6.3. Đánh giá độ bền nhiệt của SXFn3Egc ................................................ 104 3.6.4. Ảnh hưởng của ion kim loại, hóa chất đến hoạt tính của SXFn3Egc .. 105 3.6.5. Đặc điểm động học của XFn3Egc ...................................................... 108 KẾT LUẬN ............................................................................................................ 110 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ……….…………. 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 113 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 136
vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Bacterial artificial Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi BAC chromosome khuẩn BG Beta-glucosidase Beta-glucosidase Công cụ so sánh mức độ tương Basic Local Alignment BLAST đồng về trình tự nucleotit/axit Search Tool amin trực tuyến của NCBI bp Base pair Cặp base CBH Cellobiohydrolase Cellobiohydrolase Carbohydrate binding CBD Vùng liên kết với carbohydrate domain CBM Cellulose binding module Vùng liên kết với cellulose CD Catalytic domain Vùng xúc tác CE Carbohydrate esterase Carbohydrate esterase DNA được tổng hợp từ khuôn cDNA Complementary DNA mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose Cơ sở dữ liệu protein của sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn đơn bào/cơ Clusters of Orthologous sở dữ liệu từ 7 hệ gen sinh vật COG/KOG Groups/euKaryotic nhân chuẩn (3 loài động vật, 1 loài Orthologous Groups thực vật, Arabidopsis thaliana, 2 loài nấm và các ký sinh trùng nội bào) CSDL Cơ sở dữ liệu DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNS/DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid Axit 3,5-dinitrosalicylic 2’-deoxyribonucleoside 5’- 2’-deoxyribonucleoside 5’- dNTP triphosphate triphosphate Ethylene diamine tetraacetic EDTA Axit ethylene diamine tetraacetic acid EG Endoglucanase Endoglucanase Evolutionary genealogy of Cơ sở dữ liệu chứa các nhóm genes: Non-supervised orthologous (các gen trong các eggNOG Orthologous Groups loài khác nhau được tiến hóa từ một tổ tiên chung) Fn3 Fibronectin type III module Module FN3 GB Gigabyte Gigabyte (109 byte) His (H) Histidine Axit amin histidin High performance liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography HTS High throughput sequencing Giải trình tự thông lượng cao Ig Immunoglobulin module Module Ig
viii Tên viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Isopropy-β-D IPTG Isopropy-β-D-thiogalactosidase thiogalactosidase Kb Kilobase Kilobase (1000 cặp bazơ) kDa Kilodalton Đơn vị đo trọng lượng của protein Kyoto Encyclopedia of Cơ sở dữ liệu về bộ gen, con KEGG Genes and Genomes đường sinh học, bệnh tật và các chất hóa học Nồng độ cơ chất để tốc độ phản Km Michaelis constant ứng đạt ½ tốc độ tối đa LB Luria-Betani Môi trường nuôi cấy LB Môi trường nuôi cấy LB bổ sung LBA Luria-Betani ampicillin ampicillin MB Megabyte Megabyte (106 byte) Phần mềm phân tích tối ưu các MEGAN MEtaGeneomic ANalyser trình tự đa hệ gen National Center for Trung tâm quốc gia về thông tin NCBI Biotechnology Information công nghệ sinh học NGS Next-generation sequencing Đọc trình tự thế hệ mới Cơ sở dữ liệu chứa các trình tự NR Non-redundant hoàn toàn giống nhau đã được hợp nhất từ ngân hàng gen OD Optimal density Mật độ quang học ORF Open reading frame Khung đọc mở PCR Polymarase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Read (đoạn trình tự ADN ngắn riêng rẽ) có cả hai đầu tương đồng PE Pair-end với contig (đoạn trình tự ADN thường được gộp từ các read) PFAM Protein families Các họ protein Chỉ số đo nồng độ ion H+, ion OH- pH Hydrogen power trong dung dịch pNPG p-nitrophenol-β-glucoside p-nitrophenol-β-glucoside 4-nitrophenyl β-D- 4-nitrophenyl β-D-xylopyranoside pNPX xylopyranoside Cơ sở dữ liệu trình tự rARN tiểu RDP Ribosomal Database Project đơn vị nhỏ của vi khuẩn và vi khuẩn cổ RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate SDS-polyacrylamide gel Điện di trên gel polyacrylamide SDS-PAGE electrophoresis biến tính TEMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine Vmax Maximum velocity Vận tốc tối đa Vietnam Sugar and VSSA Hiệp hội Mía đường Việt Nam Sugarcane Association w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích
ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tỷ lệ cellulose trong một số nguồn lignocellulose phổ biến 11 Bảng 1.2. Một số vi sinh vật thủy phân cellulose được xác định từ dạ cỏ 14 Bảng 1.3. Một số ứng dụng của cellulase 23 Bảng 2.1. Các cặp mồi dùng để thiết kế tách dòng gen bằng PCR 35 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng cắt thu vector pET22b-SUMO và gen 39 XFn3Egc Bảng 2.3. Vị trí các gen và phương pháp thu nhận gen để tách dòng 41 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng và chương trình PCR khuếch đại các gen 41 Bảng 2.5. Thành phần gel polylacrylamide biến tính và không biến tính 44 Bảng 3.1. Tổng hợp các trình tự được chú giải mã hóa cho các enzyme thủy 56 phân cellulose bởi dữ liệu COG và KEGG Bảng 3.2. Kết quả so sánh trình tự tương đồng của vùng X trên trình tự 70 Bảng 3.3. Ước đoán một số tính chất của trình tự 13359 71 Bảng 3.4. Tổng hợp đặc điểm của các gen tách dòng và ước đoán đặc điểm 79 của protein do các gen mã hóa
x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Thành tế bào ở thực vật với thành phần chính là lignocellulose bao 5 gồm cellulose, hemicellulose và lignin liên kết chặt chẽ với nhau Hình 1.2. Cấu trúc phân tử và sự liên kết giữa các sợi cellulose 6 Hình 1.3. Sự liên kết của các sợi cellulose 7 Hình 1.4. Lượng nhiên liệu được yêu cầu sản xuất từ nguồn nguyên liệu tái 10 tạo từ năm 2008 đến năm 2022 tại Mỹ Hình 1.5. Cấu trúc Cellulase Cel7A từ Trichoderma reesei 15 Hình 1.6. Cấu trúc module của một số cellulase từ Thermobifida fusca 16 Hình 1.7. Cấu trúc tinh thể beta-glucanase từ loài A. aculeatus có chứa FN3 17 Hình 1.8 Cấu trúc tinh thể của cellulase BlCel5B của Bacillus licheniformis 19 Hình 1.9. Một mô hình cấu trúc cellulosome tham gia thủy phân cellulose 21 Hình 1.10. Cơ chế phân hủy/khử polimer hóa cellulose bằng cellulase 23 Hình 2.1. Các bước chính được thực hiện trong công trình nghiên cứu 38 Hình 2.2. Các gen XFn3, Fn3Egc, Fn3, Egc được thiết kế để tách dòng và 41 biểu hiện riêng rẽ từ gen có cấu trúc module XFn3Egc Hình 2.3. Sơ đồ qui trình đưa các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3Egc, XFn3 vào 42 vector biểu hiện pETSUMO Hình 2.4. Đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc OD595 vào hàm lượng BSA 46 Hình 2.5. Đường chuẩn glucose biểu thị sự phụ thuộc OD540 vào glucose 47 Hình 2.6. Sự phụ thuộc tốc độ vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver-Burk 52 Hình 3.1. Cấu trúc của 148 trình tự hoàn thiện có chứa module FN3 hoặc Ig 60 Hình 3.2. Phân tích cấu trúc của vi khuẩn dạ cỏ dê chứa các gen phân giải 62 cellulose Hình 3.3. Các loài vi khuẩn phổ biến nhất mang gen cellulase được khai thác 63 từ dữ liệu đa hệ gen dạ cỏ dê Việt Nam Hình 3.4. Độ tương đồng của 243 trình tự có chứa cấu trúc module FN3 và Ig 64 dựa trên cơ sở dữ liệu CAZy Hình 3.5. Độ tương đồng của 243 trình tự có chứa cấu trúc module FN3 và Ig 65 dựa trên cơ sở dữ liệu CAZy Hình 3.6. Đặc điểm suy diễn về khả năng bền nhiệt (a), khoảng pH hoạt động 66
xi (b) và giá trị pI của các trình tự có cấu trúc module (c) Hình 3.7. Kết quả khảo sát vùng bảo thủ trên các trình tự bằng SwissProt 69 Hình 3.8. Kết quả khảo sát vùng bảo thủ trên các trình tự bằng Phyre2 70 Hình 3.9. Khả năng sử dụng các mã bộ ba trên gen (A) và mức độ phù hợp mã 72 bộ ba (B) của gen mã hóa XFn3Egc Hình 3.10. Trình tự gen XFn3Egc và trình tự acid amin của nó sau khi được tối 73 ưu các mã bộ ba để biểu hiện trên chủng E. coli Hình 3.11. Điện di đồ kiểm tra gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3 XFn3Egc và 74 vector Hình 3.12. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-fn3 (A) và sản 75 phẩm cắt kiểm tra plasmid pETSUMO-Fn3 (B) Hình 3.13. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-Egc (A) và sản 76 phẩm cắt kiểm tra plasmid pETSUMO-Egc (B) Hình 3.14. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-Fn3Egc (A) và 77 sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pETSUMO-Fn3Egc (B) Hình 3.15. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-XFn3Egc (A) và 78 sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pETSUMO-XFn3Egc (B) Hình 3.16. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-XFn3 (A) và sản 78 phẩm cắt plasmid pETSUMO-XFn3 (B) Hình 3.17. Điện di đồ kiểm tra protein SFn3, SEgc, SFn3Egc, SXFn3, 81 SXFn3Egc của các dòng E. coli tái tổ hợp tương ứng Hình 3.18. Điện di đồ SFn3, SEgc, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 được biểu 82 hiện trong E. coli BL21 Hình 3.19. Thử hoạt tính SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 được biểu hiện 84 Hình 3.20. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm các phân đoạn tinh chế enzyme SFn3 86 bằng cột sắc ký ái lực His-tag trên gel polyacrylamide 12,6% Hình 3.21. Kiểm tra độ sạch của SFn3 tái tổ hợp bằng phần mềm Quantity One 86 Hình 3.22. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế enzyme 87 SFn3Egc bằng cột sắc ký ái lực His-tag Hình 3.23. Kiểm tra độ sạch SFn3Egc tái tổ hợp bằng phần mềm Quantity One 87 Hình 3.24. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế 88 SXFn3Egc bằng cột sắc ký ái lực His-tag trên gel polyacrylamide
xii 12,6% có SDS Hình 3.25. Kiểm tra độ sạch SXFn3Egc tái tổ hợp bằng Quantity One 88 Hình 3.26. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế enzyme SXFn3 bằng cột sắc ký ái lực His-tag trên gel polyacrylamide 89 12,6% Hình 3.27. Kiểm tra độ sạch của SXFn3 tái tổ hợp bằng Quantity One 89 Hình 3.28. Thử hoạt tính các protein SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 sau 90 tinh chế trên đĩa thạch CMC-agar Hình 3.29. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein sau tinh chế 92 trên cơ chất CMC Hình 3.30. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein sau tinh chế 93 trên cơ chất giấy lọc Hình 3.31. Đánh giá vai trò của SFn3 và SXFn3 khi hấp phụ trên cơ chất CMC 95 đến hoạt tính của các protein SFn3Egc, SXFn3Egc Hình 3.32. Kiểm tra khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng ái lực của enzyme với cơ 96 chất CMC Hình 3.33. Đánh giá vai trò của SFn3 và SXFn3 khi hấp phụ trên cơ chất giấy 98 lọc đến hoạt tính của các protein SFn3Egc, SXFn3Egc Hình 3.34. Ảnh SEM cấu trúc và bề mặt các sợi cellulose của giấy lọc 99 Hình 3.35. Ảnh hưởng của pH lên sự hấp phụ của SFn3 và SXFn3 với giấy lọc 100 Hình 3.36. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự hấp phụ của SFn3, SXFn3 với giấy lọc 101 Hình 3.37. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của SXFn3Egc 102 Hình 3.38. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của SXFn3Egc 103 Hình 3.39. Hoạt tính còn lại của SXFn3Egc khi được ủ ở 30oC, 40oC, 50oC, 105 60oC trong thời gian từ 30 phút đến 90 phút Hình 3.40. Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính của SXFn3Egc 106 Hình 3.41. Ảnh hưởng của nồng độ ion Mn2+ đến hoạt tính tương đối của 107 endoglucanase SXFn3Egc trên cơ chất CMC Hình 3.42. Ảnh hưởng của một số hóa chất lên hoạt tính của enzyme 108 Hình 3.43. Động học enzyme tái tổ hợp SXFn3Egc trên nguồn cơ chất CMC 109
1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng có ý nghĩa thực tiễn vô cùng to lớn đối với loài người thông qua các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như là y học, nông nghiệp, công nghiệp, xử lý ô nhiễm môi trường. Do đó, các nghiên cứu về sự đa dạng các trình tự từ vi sinh vật nhằm phát hiện những gen mới để khai thác và ứng dụng chúng vào phục vụ cuộc sống luôn là chủ đề quan trọng được các nhà sinh học đặc biệt quan tâm. Mặc dù vậy, các phát hiện gần đây cho thấy phần lớn (khoảng 99%) các loài vi sinh vật trong môi trường là chưa nuôi cấy được. Do vậy, nghiên cứu dựa vào phương pháp nuôi cấy thông thường sẽ không thể khai thác được toàn bộ nguồn gen có tiềm năng của vi sinh vật. Trong giai đoạn gần đây, thông qua kỹ thuật Metagenomics giải trình tự toàn bộ hệ gen của tất cả các vi sinh vật được thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường, các gen từ vi sinh vật, kể cả vi sinh vật không nuôi cấy đã được nghiên cứu, đánh giá một cách tổng thể. Tại nước ta, cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp với qui mô sản xuất ngày càng lớn và tập trung như hiện nay, các phụ phẩm nông nghiệp mà trong đó nguồn sinh khối lignocellulose chiếm phần lớn đang chủ yếu bị đốt bỏ gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến môi trường. Trong khi đó, nhân loại đang phải đối mặt với tình trạng suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch cũng như hệ quả nghiêm trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính. Việc nghiên cứu sử dụng nguồn năng lượng carbonhydrate từ nguyên liệu có khả năng tái tạo với trữ lượng khổng lồ như lignocellulose là hết sức cấp thiết để tạo ra các sản phẩm thay thế các nhiên liệu được sản xuất từ nguyên liệu hóa thạch. Lignocellulose nói chung hay cellulose nói riêng là sinh khối có cấu trúc vững chắc, được chuyển hóa theo nhiều bước để tạo thành sản phẩm cuối cùng mà trong đó giai đoạn đường hóa đóng vai trò then chốt. Trong quá trình này, cellulase được xác định là nhân tố chính quyết định tới hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm. Do vậy, trong những năm gần đây trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu tìm kiếm nguồn cellulase mới có hoạt tính cao, có ái lực mạnh với cơ chất để chuyển hóa hiệu quả cellulose. Khác với enzyme khác, phần lớn các cellulase có cấu trúc module, có nghĩa là ngoài vùng có chức năng xúc tác, enzyme còn chứa thêm một số module khác có cấu trúc độc lập và ít được nghiên cứu, điển
2 hình như module FN3, Ig, CBM. Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu về vai trò của các module chưa biết chức năng đến hoạt tính xúc tác của cellulase chưa được công bố nhiều. Nhiều giả thiết cho rằng, chúng không chỉ tồn tại như một vùng nối liên kết các vùng hoạt tính mà chúng còn thể hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng khác như ổn định cấu trúc, làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất. Vì vậy, nghiên cứu làm rõ vai trò sinh học của các module này trong cấu trúc của cellulase là hết sức có ý nghĩa cho việc lựa chọn hoặc thiết kế các enzyme để nâng cao hiệu quả thủy phân nguồn sinh khối cellulose. Từ năm 2014 đến năm 2017, bằng nguồn kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước (Mã số: ĐTĐLCN.15/14), phòng Kỹ thuật di truyền (Viện CNSH, Viện HLKH&CNVN) đã giải mã DNA đa hệ gen của hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê chăn thả tự nhiên trên núi tại tỉnh Ninh Bình và Thanh Hóa. Kết quả, từ 8,6 Gb dữ liệu trình tự, đề tài đã khai thác được 816 trình tự mã hóa cho cellulase. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới việc đánh giá đa dạng các trình tự cellulase có cấu trúc module, tìm ra cấu trúc module đặc thù mới cho nghiên cứu vai trò của module đến hoạt tính của enzyme. Do đó, chúng tôi đã thực hiện Luận án: “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong trong dạ cỏ của dê”. ● Mục tiêu nghiên cứu: - Nghiên cứu đánh giá đa dạng cellulase và cellulase có cấu trúc module từ khu hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê bằng kỹ thuật Metagenomics; - Nghiên cứu vai trò của module chưa rõ chức năng (FN3 hoặc Ig) lên hoạt tính của cellulase. ● Nội dung nghiên cứu: Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu chính sau: 1. Phân tích, đánh giá đa dạng họ GH, nguồn gốc cellulase và các cellulase có cấu trúc module được mã hóa từ các khung đọc mở trong dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật dạ cỏ dê tại Việt Nam.
3 2. Phân tích lựa chọn trình tự có cấu trúc module điển hình cho nghiên cứu biểu hiện, xác định vai trò của vùng chưa biết chức năng. 3. Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế enzyme từ trình tự được lựa chọn (SXFn3Egc) và các gen chứa module của nó (Fn3, XFn3, Egc, Fn3Egc) dưới dạng dung hợp với SUMO. 4. Nghiên cứu vai trò của module chưa biết chức năng đến khả năng phân giải cellulose của enzyme. 5. Nghiên cứu, đánh giá một số tính chất của enzyme tái tổ hợp được biểu hiện từ trình tự được lựa chọn có cấu trúc module. ● Những đóng góp mới của Luận án: 1. Từ 816 ORF mã hóa cellulase của vi khuẩn dạ cỏ dê Việt Nam, 243 ORF mã hóa cellulase được xác định có cấu trúc chứa module chưa rõ chức năng là FN3 hoặc Ig. Trong số các cellulase hoàn thiện chứa module FN3, 99,2% FN3 đi kèm với module xúc tác betaglucosidase GH3 và chỉ có một FN3 đi kèm với module xúc tác endoglucanase GH5. Toàn bộ module Ig đều đi kèm với module xúc tác endoglucanase GH9. Cấu trúc mã hóa endoglucanase GH5 chứa module FN3 là cấu trúc mới ít được phát hiện và nghiên cứu. 2. Đã tổng hợp và biểu hiện trình tự mã hóa endoglucanase GH5 (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module khác nhau (Fn3, XFn3, Fn3Egc, Egc) trong E. coli để nghiên cứu vai trò của FN3 trong cấu trúc của enzyme. Module FN3 được xác định có khả năng làm tăng tính tan và ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất tan là CMC. 3. SXFn3Egc hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 4. Enzyme ổn định và bền ở nhiệt độ dưới 60oC trong 90 phút. Km đạt 1,26 mg/ml và Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml. Hoạt tính enzyme tăng 2 lần khi sử dụng 40 mM Mn2+ và giảm khi bổ sung các ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Ni2+, K+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+), và 6 loại hóa chất (SDS, urea, 2-mercaptoethanol, EDTA, tween 80, triton X-100). ● Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Luận án: * Ý nghĩa khoa học:
4 Luận án đã khai thác và nghiên cứu cấu trúc của endoglucanase GH5 chứa module FN3 là cấu trúc mới, ít được nghiên cứu và công bố trên thế giới. Module FN3 trong cấu trúc này được chứng minh có khả năng ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất tan là CMC. * Ý nghĩa thực tiễn: Xác định được vai trò của module FN3 trong cấu trúc endoglucanase GH5 là cơ sở để thiết kế các enzyme chứa các module bổ sung hoặc enzyme cocktail phù hợp có khả năng phân giải cellulose hiệu quả, ứng dụng trong sản xuất các nhiên liệu sinh học thế hệ mới và xử lý ô nhiễm môi trường.
5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cellulose 1.1.1. Thành phần và cấu trúc của cellulose Cellulose cùng với hemicellulose và lignin là 3 thành phần chính cấu thành nên sinh khối lignocellulose (Hình 1.1). Đây là thành phần cấu tạo chủ yếu của thành tế bào thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Các thành phần của lignocellulose trong các loài thực vật khác nhau thường có tỷ lệ khác nhau nhưng cellulose thường chiếm tỷ lệ cao nhất (38-50%) so với hemicellulose (23- 32%) và lignin (15-25%) [1], [2]. Đặc biệt, cellulose chiếm tỷ lệ khá cao ở một số nguyên liệu như giấy thải từ bột giấy hoá học (60-70%), giấy (85-99%), sợi cotton (95-97%) [3]. Ở thực vật, cellulose được tạo thành nhờ quá trình quang hợp và thường phân bố ít ở lá so với ở thân cây [4]. Cellulose là thành phần có vai trò quan trọng để giữ cho cấu trúc của thành tế bào thực vật ổn định [5]. Bên cạnh đó, cellulose cũng được tổng hợp bởi một số vi khuẩn và động vật nguyên sinh có vai trò chủ yếu để tạo màng bảo vệ tế bào. Cellulose từ vi khuẩn được xác định có cấu trúc siêu mịn, độ tinh khiết và khả năng phân hủy sinh học cao hơn so với cellulose từ nguồn thực vật [6]. Cellulose Thành tế VI SỢI bào thực vật Thực vật Liên kết hydro Tế bào thực vật Hình 1.1. Thành tế bào ở thực vật với thành phần chính là lignocellulose bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin liên kết chặt chẽ với nhau [7]
6 Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử mạch thẳng cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, còn lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Các thành phần này liên kết với nhau chủ yếu bằng các liên kết hydro để tạo cấu trúc khối vững chắc là lignocellulose [8]. Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay được viết dưới dạng [C6H7O2(OH)3]n (do mỗi mắt xích của cellulose có chứa 3 nhóm –OH). Khối lượng phân tử của cellulose rất lớn (khoảng 1.000.000 – 2.400.000 đvC), tùy thuộc vào giá trị n. Giá trị n thể hiện số lượng các đơn phân và phụ thuộc vào loại nguyên liệu cellulose. Thông thường, mỗi chuỗi cellulose ở thành tế bào thực vật nói chung có khoảng 5.000-7.000 đơn phân. Ví dụ, trong gỗ có khoảng 10.000 đơn phân và trong bông có khoảng 15.000 đơn phân. Do đó, khối lượng phân tử trung bình của cellulose ở bông có thể lên tới khoảng 2.400.000 đvC [9]. Các đơn phân β-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside tạo thành một chuỗi thẳng. Nhóm hydroxyl của chuỗi này tạo liên kết hydro với phân tử oxy của chuỗi bên cạnh (liên kết hydro liên phân tử) hoặc trên cùng chuỗi (liên kết hydro nội phân tử) hình thành cấu trúc tinh thể chắc chắn, khó bị phân hủy [10], [11], [12] (Hình 1.2). Hình 1.2. Cấu trúc hóa học và sự liên kết giữa các phân tử cellulose [12] Từ năm 1913, Nishikawa và Ono đã phát hiện ra cấu trúc và sự sắp xếp của các sợi cellulose dựa trên phương pháp nhiễu xạ tia X [13]. Phát hiện cho thấy cellulose riêng lẻ có xu hướng tự sắp xếp theo cách có tổ chức cao dẫn đến trạng