intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm sinularia nanolobata, sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung bộ Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:290

Thêm vào BST
Báo xấu
30
lượt xem 8
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm xác định được thành phần hóa học của ba loài san hô mềm S.nanolobata, S. conferta, S. leptocladosthu thập ở vùng biển Trung bộ Việt Nam; phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có trong các loài san hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các nghiên cứu y sinh dược học. Mời các bạn tham khảo tài liệu!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm sinularia nanolobata, sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung bộ Việt Nam

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Ninh Thị Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ BA LOÀI SAN HÔ MỀM SINULARIA NANOLOBATA, SINULARIA LEPTOCLADOS, SINULARIA CONFERTA THU THẬP Ở VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Ninh Thị Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ BA LOÀI SAN HÔ MỀM SINULARIA NANOLOBATA, SINULARIA LEPTOCLADOS, SINULARIA CONFERTA THU THẬP Ở VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9.42.01.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Hoài Nam 2. TS. Trần Mỹ Linh Hà Nội – 2021
  3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Nam và TS. Trần Mỹ Linh. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Ninh Thị Ngọc
  4. ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài VAST.TĐ.DLB.02/16- 18 và Nafosted 104.01–2013.31. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hoài Nam và TS. Trần Mỹ Linh - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn chỉ dạy cho tôi về mặt chuyên môn, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án . Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo và các đồng nghiệp phòng Dược liệu biển - Viện Hóa Sinh biển đặc biệt là GS.VS. Châu Văn Minh về sự chỉ bảo, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện Hóa sinh biển, Viện Công nghệ sinh học và Học viện Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học. Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng Tài nguyên sinh vật, Trung tâm Tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa sinh biển, Phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong việc định loài và thử hoạt tính. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Ninh Thị Ngọc
  5. iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ……………………………………………………………. i LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………........... ii MỤC LỤC……………………………………………………………………. iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT…………………………............ vii DANH MỤC BẢNG…………………………………………………………. x DANH MỤC HÌNH………………………………………………………….. xii MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN………………………………………………… 3 1.1. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư…………………. 3 1.1.1. Các dòng tế bào ung thư …………………………………………………….. 3 1.1.2. Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống ung thư ………………………………………………………………… 4 1.1.3. Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên apoptosis …………………………… 7 1.1.4. Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan tới chu kỳ tế bào ………………….. 10 1.2. Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thư …….. 10 1.2.1. Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ sinh vật biển ……………………………………………………………. 11 1.2.2. Tình hình nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính chống ung thư từ san hô mềm của Việt Nam…………………………………………………………. 14 1.3. Giới thiệu chung về san hô mềm …………………………………….. 15 1.3.1. Đặc điểm của san hô mềm ………………………………………………….. 16 1.3.2. Tổng quan về chi Sinularia ………………………………………………….. 18 1.3.3. Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại san hô mềm ……………. 18 1.3.4. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia …………………………………. 19 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……... 34 2.1. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………… 34 2.1.1. Loài san hô mềm S. nanolobata …………………………………………….. 34 2.1.2. Loài san hô mềm S. leptoclados ……………………………………………. 34 2.1.3. Loài san hô mềm S. conferta …..……………………………………………. 35
  6. iv 2.2. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………….. 35 2.2.1. Xác định tên khoa học của các mẫu san hô mềm ………………………… 35 2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ………………………………………. 42 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ………………….. 47 2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào ung thư……. 48 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………….. 56 3.1. Xác định loài bằng chỉ thị phân tử ………………………………………. 56 3.1.1 Giải trình tự đoạn gen 28S rARN và msh1 của 3 mẫu san hô mềm……. 56 3.1.2. So sánh trình tự của 3 mẫu san hô mềm bằng chương trình BLAST … 57 3.2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất………….. 59 3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. nanolobata……………………………………………………………. 59 3.2.2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. leptoclados…………………………………………………………… 61 3.2.3. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. conferta……………………………………………………………….. 63 3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ các mẫu san hô mềm…………………………………………………… 65 3.2.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S. nanolobata…………………………………………………………. 65 3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S. leptoclados…………………………………………………………. 65 3.2.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S. conferta……………………………………………………………… 66 3.2.4. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE 27 và hợp chất SCO 27……………………………………………………………………. 67 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………. 75 4.1. Xác định loài của các mẫu san hô mềm dựa vào các trình tự ADN chỉ thị…………………………………………………………………………… 75 4.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S. nanolobata.. 77 4.2.1. Hợp chất SN 8: 3β,4α-dihydroxyergosta-5,24(28)-diene (hợp chất mới) 77 4.2.2. Hợp chất SN 6: 24(S),28-epoxyergost-5-ene-3β,4α-diol (hợp chất mới ) 80
  7. v 4.2.3. Hợp chất SN 20: Nanolobatol B (hợp chất mới ) ………………………… 82 4.2.4. Hợp chất SN 30: Nanolobatol A (hợp chất mới ) ………………………… 84 4.2.5. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại ……………………………….. 86 4.2.6. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S. nanolobata……………. 86 4.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S. leptoclados.. 87 4.3.1. Hợp chất SLE 10: Leptosteroid (chất mới) ……………………………….. 87 4.3.2. Hợp chất SLE 21: 5,6β-epoxygorgosterol (chất mới)…………………….. 89 4.3.3. Hợp chất SLE 27: Ergosta-5,24(28)-dien-3β,7β-diol…………………….. 92 4.3.4. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại………………………………... 94 4.3.5. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S. leptoclados……………. 94 4.4. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S. conferta....... 95 4.4.1. Hợp chất SCO 29: 7-methoxygorgosterol (chất mới) …………............. 95 4.4.2. Hợp chất SCO 30: 7α-Methoxy-ergosta-5-ene-3β-ol (chất mới)……….. 98 4.4.3. Hợp chất SCO 44: 3-hydroxyergosta-4-en-6-one (chất mới)…………. 100 4.4.4. Hợp chất SCO 42: ergost-24(28)-ene-3β,5α,6β-triol-3-acetate (chất mới)……………………………………………………………………………… 103 4.4.5. Hợp chất SCO 32: 3-hydroxyergosta-4,24(28)-dien-6-one (chất mới).. 106 4.4.6. Hợp chất SCO 27: 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-6- monoacetate…………………………………………………………………… 107 4.4.7. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại ……………………………….. 109 4.4.8. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S. conferta ………………. 109 4.5. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được………………………………………………………………………… 110 4.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài S. nanolobata……………………………………………………………... 111 4.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài S. leptoclados……………………………………………………………... 112 4.5.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài S. conferta…………………………………………………………………. 114 4.5.4. Nghiên cứu cơ chế chống ung thư của hợp chất SLE 27 và SCO 27…… 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………… 121
  8. vi TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN ………………………………………………… 123 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ……………….............. 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………. 126 PHỤ LỤC ……………………………………………………………………………..
  9. vii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 13 C-NMR Carbon Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectroscopy cacbon 1 H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Phổ tương tác proton-proton Correlation Spectroscopy 1 H-NMR Proton Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectroscopy proton 5-EPA 5-Episinuleptolide Acetate 5-Episinuleptolide Acetate 6-OHDA 6-hydroxydopamine 6-hydroxydopamine ADC Antibody–drug conjugate Liên hợp thuốc kháng thể ATCC American Type Culture Ngân hàng chủng chuẩn của Mỹ Collection A-549 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư cổ tử cung người CC Cartridge columns Cột sắc ký CD Circular dichroism Phổ lưỡng sắc tròn Spectroscopy COX-2 Cyclooxygenase-2 Cyclooxygenase -2 DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DLAT Dihydrolipoyllysine-residue Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase acetyltransferase DLD-1 Colon Cancer Cell Line Dòng tế bào ung thư ruột kết DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Dulbecco’s Modified Eagle Medium Medium DMSO Dimethylsulfoside Dimethylsulfoside ADN Deoxyribo Nucleic Acid Axit Deoxyribo Nucleic FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bò H2SO4 Sulfuric acid Axit sunfuric Hep-G2 Human hepatocellular Tế bào ung thư biểu mô gan
  10. viii carcinoma cell HL-60 Human promyelocytic Tế bào ung thư máu leukemia cell HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HR-TOF-MS High Resolution Time of-Flight Phổ khối phân giải cao thời gian Mass Spectrometer bay HSQC Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 Coherence liên kết IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% IL-12 Interleukin 12 Interleukin 12 IL-6 Interleukin 6 Interleukin 6 iNOS Inducible Form of Nitric-Oxide Inducible Form of Nitric-Oxide Synthase Synthase IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại LC-MS Liquid chromatography – mass Sắc kí lỏng - khối phổ spectrometry LPS Lipopolysaccharide Lipopolysacaride LU-1 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư phổi ở người LysoPC Lysophosphatidylcholine Lysophosphatidylcholine MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú ở người MDAMB- Human breast cancer cell Tế bào ung thư vú ở người 435 MMAE Monomethyl auristatin E Monomethyl auristatin E MMAF Monomethyl auristatin F Monomethyl auristatin F MMP Mitochondrial transmembrane Điện thế màng ty thể potential MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- 2,5-diphenyltetrazolium diphenyltetrazolium bromide
  11. ix bromide NF-B Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B NOESY Nuclear Overhauser Phổ NOESY Enhancement Spectroscopy PC Phosphatidylcholine Phosphatidylcholine PI3K/Akt An intracellular signaling Một đường tín hiệu nội bào quan pathway important in trọng trong việc điều hòa chu kỳ regulating the cell cycle tế bào PS Phosphatidylserine Phosphatidylserine PTP1B Protein tyrosine phosphatase Protein tyrosine phosphatase 1B 1B RAW264.7 Macrophage cell line Dòng tế bào đại thực bào SCO S. conferta S. conferta SK-Mel-2 Human Melanoma cell Tế bào ung thư da ở người SLE S. leptoclados S. leptoclados SN S. nanolobata S. nanolobata SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B TCA Trichloro acetic acid axit trichloro axetic TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane (CH3)4S
  12. x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thông tin tóm tắt của một số loại thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ sinh vật biển (SVB) đã được cấp phép và đang ở các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha I, II, III ………………………… 14 Bảng 1.2. Một số hoạt chất phân lập từ san hô mềm chi Sinularia ………………………………………………………………….. 30 Bảng 2.1. Các cặp mồi được sử dụng trong phân tích chỉ thị phân tử các mẫu san hô mềm nghiên cứu …………………………………… 38 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR …………………………………….. 38 Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ……………………………….. 39 Bảng 3.1. Kết quả phân loại các mẫu san hô mềm nghiên cứu dựa vào phân tích độ tương đồng (%) trình tự các đoạn ADN chỉ thị (gen 28S rARN và msh1) ……………………............................ 59 Bảng 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SN... 65 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SLE. 66 Bảng 3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SCO 67 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào ung thư phổi của hợp chất SCO 27 ……………………………………………….. 68 Bảng 3.6. Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SCO 27 trên dòng tế bào ung thư phổi A549 …………………………………………. 69 Bảng 3.7. Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SLE 27 trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 …………………………………………. 72 Bảng 3.8. Tỉ lệ (%) tế bào MCF-7 trong pha G0/G1, S, G2/M và apoptosis (sub-G1) sau 48 h xử lí với hợp chất SLE 27 ………………….. 73 Bảng 4.1. Số liệu phổ của hợp chất SN 8, tương tác chính trên HMBC ….. 78 Bảng 4.2. Số liệu phổ của hợp chất SN 6, tương tác chính trên HMBC ….. 81 Bảng 4.3. Số liệu phổ của hợp chất SN 20, tương tác chính trên HMBC … 83 Bảng 4.4. Số liệu phổ của hợp chất SN 30, tương tác chính trên HMBC … 85 Bảng 4.5. Số liệu phổ của hợp chất SLE 10, tương tác chính trên HMBC .. 88 Bảng 4.6. Số liệu phổ của hợp chất SLE 21, tương tác chính trên HMBC .. 90 Bảng 4.7. Số liệu phổ của hợp chất SLE 27, tương tác chính trên HMBC... 93
  13. xi Bảng 4.8. Số liệu phổ của hợp chất SCO 29, tương tác chính trên HMBC.. 97 Bảng 4.9. Số liệu phổ của hợp chất SCO 30, tương tác chính trên HMBC.. 99 Bảng 4.10. Số liệu phổ của hợp chất SCO 44, tương tác chính trên HMBC.. 101 Bảng 4.11. Số liệu phổ của hợp chất SCO 42, tương tác chính trên HMBC.. 104 Bảng 4.12. Số liệu phổ của hợp chất SCO 32, tương tác chính trên HMBC.. 106 Bảng 4.13. Số liệu phổ của hợp chất SCO 27, tương tác chính trên HMBC.. 108
  14. xii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Quá trình diễn ra apoptosis thông qua con đường nội bào và ngoại bào ……………………………………………………….. 8 Hình 1.2. Các cơ chế góp phần làm tránh quá trình apoptosis và gây ung thư ………………………………………………………………. 9 Hình 1.3. Cấu trúc tập đoàn san hô mềm …………………………………. 17 Hình 1.4. Các dạng tập đoàn chủ yếu của san hô mềm……………………. 17 Hình 1.5. Cấu trúc minh họa một số hợp chất sesquiterpen phân lập từ chi Sinularia…………………………………………………………. 20 Hình 1.6. Sơ đồ minh họa cơ chế tác động của hợp chất Sinularin (18) lên tế bào ung thư dạ dày …………………………………………… 21 Hình 1.7. Sơ đồ minh họa cơ chế của Sinulariolide gây ra apoptosis thông qua con đường ty thể và p38MAPK trên các tế bào TSGH ……. 23 Hình 1.8. Cấu trúc minh họa một số hợp chất cembranoid phân lập từ chi Sinularia…………………………………………………………. 23 Hình 1.9. Cấu trúc minh họa một số hợp chất cembranoid phân lập từ chi Sinularia ………………………………………........................... 25 Hình 1.10. Cấu trúc minh hóa một số hợp chất norcembranoid diterpen phân lập từ chi Sinularia……………………………………….. 26 Hình 1.11. Cấu trúc minh họa một số hợp chất diterpenoid phân lập từ chi Sinularia…………………………………………………………. 27 Hình 1.12. Cấu trúc minh họa một số hợp chất steroid (123-139) phân lập từ chi Sinularia …………………………………………………. 28 Hình 1.13. Cấu trúc minh họa một số hợp chất steroid (140-160) phân lập từ chi Sinularia …………………………………………………. 29 Hình 2.1. Mẫu san hô mềm S. nanolobata thu tại vùng biển Lăng Cô…….. 34 Hình 2.2. Mẫu san hô mềm S. leptoclados thu tại vùng biển Cồn Cỏ……... 35 Hình 2.3. Mẫu san hô mềm S. conferta thu tại vùng biển Cồn Cỏ……….... 35 Hình 2.4. Ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ các mẫu SN, SLE và SCO……………………………………………………………... 37 Hình 2.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn các đoạn gen chỉ thị từ 39
  15. xiii các mẫu san hô mềm nghiên cứu. (A) đoạn gen 28S rARN sử dụng cặp mồi 28SF và 28SR. (B) đoạn gen msh1 sử dụng cặp mồi MSHF và MSHR. M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder. SN, SLE, SCO ký hiệu tên của các mẫu san hô mềm nghiên cứu…... Hình 2.6. Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau khi biến nạp vector pTZ57R/T gắngen 28S rARN của các mẫu san hô mềm SN (giếng số 1-7), SLE (giếng số 8-14), SCO (giếng số 15-21). M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder………….. 40 Hình 2.7. Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau khi biến nạp vector pTZ57R/T gắn gen msh1 của các mẫu san hô mềm SN (giếng số 22-28), SLE (giếng số 29-35), SCO (giếng số 36-42). M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder………….. 41 Hình 2.8. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. nanolobata.. 43 Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. leptoclados.. 45 Hình 2.10. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. conferta…. 47 Hình 3.1. Một số hình ảnh về kết quả BLAST (so sánh) các trình tự gen chỉ thị của mẫu nghiên cứu với các trình tự trên NCBI………… 58 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài S. nanolobata………………………………………………………. 60 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài S. leptoclados……………………………………………………… 63 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài S. conferta…………………………………………………………. 63 Hình 3.5. Hình thái tế bào A549 dưới tác động của SCO 27 ở các nồng độ khác nhau và đối chứng dương (camptothecin 5 µM). ………… 68 Hình 3.6. Khả năng kích thích sản sinh caspase 3 của SCO 27 và đối chứng …………………………………………………………… 69 Hình 3.7. Tác động của SCO 27 đến quá trình apoptosis tế bào A549 ở thời điểm 24h tại các nồng độ khác nhau 5 µM (C), 10 µM (D), đối chứng âm (A) và đối chứng dương (B) sử dụng phương pháp nhuộm Annexin V/PI……………………………………… 70 Hình 3.8. Tác động của hợp chất SLE 27 ở nồng độ 10, 30 và 100 µM lên 71
  16. xiv hình thái tế bào ung thư vú MCF-7. Mũi tên chỉ các tế bào ở trạng thái apoptosis……………………………………………… Hình 3.9. Tác động của SLE 27 đến quá trình apoptosis tế bào MCF-7 ở thời điểm 24 h tại các nồng độ khác nhau 10 µM (B), 30 µM (C), 100 µM (D) và đối chứng âm (A) sử dụng phương pháp nhuộm Annexin V/PI…………………………………………… 72 Hình 3.10. Ảnh hưởng của hợp chất SLE 27 (nồng độ 10; 30; 100 µM) đến chu kì tế bào MCF-7 ở thời điểm 48h, sử dụng hệ thống Flow cytometer Novocyte (ACEA Biosciences Inc.) và phần mềm NovoExpress……………………………………………………. 73 Hình 4.1. Kết quả phân tích chủng loại theo phương pháp NJ (Neighbor- Joining) trên MEGA6 của các mẫu San hô mềm dựa vào đa hình trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của các mẫu nghiên cứu và các mẫu san hô mềm liên quan trên ngân hàng gen NCBI………….. 75 Hình 4.2. Kết quả phân tích chủng loại theo phương pháp NJ trên MEGA6 của các mẫu san hô mềm dựa vào đa hình trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN của các mẫu nghiên cứu và các mẫu san hô mềm liên quan trên ngân hàng gen NCBI…………………………….. 76 Hình 4.3. Hợp chất tham khảo 3β-hydroxy-24-methylenecholest-5-en-7- one………………………………………………………………. 78 Hình 4.4. Cấu trúc phẳng và các tương tác COSY (▬) và HMBC () chính của hợp chất SN 8………………………………………… 79 Hình 4.5. Mô tả tương tác HMBC và NOESY của hợp chất SN 8………. 79 Hình 4.6. Cấu trúc và các tương tác COSY (▬) và HMBC () chính của hợp chất SN 6…………………………………………………… 82 Hình 4.7. Cấu trúc phẳng và các tương tác COSY (▬) và HMBC () chính của hợp chất SN 20………………………………………. 84 Hình 4.8. Cấu trúc phẳng và các tương tác COSY (▬) và HMBC () chính của hợp chất SN 30………………………………………. 85 Hình 4.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất SLE 10…………………………. 89 Hình 4.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất SLE 21…………………………. 92
  17. xv Hình 4.11. Cấu trúc của hợp chất SLE 27…………………………………... 94 Hình 4.12. Cấu trúc và các tương tác COSY (▬) và HMBC () chính của hợp chất SCO 29………………………………………………... 98 Hình 4.13. Các tương tác NOESY quan trọng của hợp chất SCO 29………. 98 Hình 4.14. Cấu trúc và các tương tác HMBC () chính của hợp chất SCO30…………………………………………………………... 100 Hình 4.15. Cấu trúc và các tương tác HMBC () chính của hợp chất SCO44 ………………………………………………………….. 103 Hình 4.16. Cấu trúc và các tương tác HMBC () chính của hợp chất SCO42…………………………………………………………... 106 Hình 4.17. Cấu trúc và các tương tác HMBC () chính của hợp chất SCO32…………………………………………………………... 107 Hình 4.18. Cấu trúc và các tương tác HMBC ()chính của hợp chất SCO27 ………………………………………………………….. 109 Hình 4.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất SN 6 và SN 8 ………………….. 111 Hình 4.20. Giá trị IC50 của hợp chất SLE 27 trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm………………………………………………………. 113 Hình 4.21. Cấu trúc hóa học của các hợp chất SLE 10, SLE 27 và SLE 28... 113 Hình 4.22. Giá trị IC50 của hợp chất SCO 27 trên ba dòng tế bào ung thư… 115 Hình 4.23. Cấu trúc hóa học của các hợp chất SCO27, SCO35 và SCO37… 115
  18. 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nhiều quốc gia đã khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển nhằm phục vụ các nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc chữa trị bệnh hiểm nghèo như: ung thư, viêm gan, các bệnh về viêm nhiễm và do virus gây ra. Cho đến thời điểm này đã có một số dược phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biển đến được tay người sử dụng, điển hình như Cytarabine, Vidarabine, Eribulin, Trabectedin…Để có được thành quả này, các viện nghiên cứu trên thế giới đã sàng lọc hoạt tính sinh học của hàng triệu hợp chất từ các loài sinh vật biển, đồng thời đầu tư nguồn lực tài chính và thời gian cho các giai đoạn nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đối với các hợp chất tiềm năng. Với lợi thế sở hữu đường bờ biển dài trên 3.260 km cùng với rất nhiều đảo và vịnh, Việt Nam có tiềm năng lớn lao trong việc khai thác với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú cả về thành phần loài và trữ lượng. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất giá trị từ sinh vật biển Việt Nam hiện còn chưa nhiều và hạn chế ở bước thử nghiệm hoạt tính in vivo và nghiên cứu về cơ chế tương tác giữa thuốc và tế bào ung thư. Các nghiên cứu hiện đang ở giai đoạn đầu so với các nuớc trong khu vực và lùi xa so với các nước tiên tiến. Nguyên nhân là do còn một số khó khăn như: việc khảo sát và thu thập mẫu sinh vật ở biển yêu cầu trang thiết bị hiện đại và chuyên gia giàu kinh nghiệm, các hợp chất phân lập được từ sinh vật biển thường có hàm lượng rất nhỏ, cấu trúc phức tạp, một số hợp chất dễ phân hủy ngay trong quá trình phân tích. Do đó, hiện nay yêu cầu cấp thiết đối với nước ta là cần phát triển nhiều nghiên cứu nhằm từng bước hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của những loài sinh vật biển. Chi Sinularia là một trong các chi san hô mềm được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học của nhiều hợp chất phân lập được từ các đối tượng san hô mềm thuộc chi này. Tuy nhiên, các nghiên cứu đối với nhiều loài san hô mềm thuộc chi Sinularia như S. nanolobata, S. leptoclados, S. conferta ở Việt Nam rất ít và hầu như chưa có các nghiên cứu một cách hệ thống và bài bản về các loài nêu trên. Xuất phát từ thực tế trên, NCS đã lựa chọn đề tài luận án “Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất
  19. 2 phân lập từ ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam”. Mục tiêu của luận án: - Xác định được thành phần hóa học của ba loài san hô mềm S. nanolobata, S. conferta, S. leptoclados thu thập ở vùng biển Trung bộ Việt Nam. - Phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có trong các loài san hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các nghiên cứu y sinh dược học. Nội dung luận án bao gồm: 1. Xác định tên khoa học của ba loài san hô mềm thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam bằng chỉ thị phân tử 2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ ba loài san hô mềm S. nanolobata, S. conferta, S. leptoclados. 3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được. 4. Đánh giá cơ chế gây độc tế bào của một số hợp chất tiêu biểu.
  20. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 1.1.1. Các dòng tế bào ung thư Lịch sử nghiên cứu ung thư và việc thành lập các dòng tế bào ung thưcó liên quan chặt chẽ với nhau [1]. Nhiều nhà nghiên cứu đã tìm hiểu các cơ chế phức tạp biến đổi từ một tế bào bình thường thành tế bào ung thư. Năm 1951, những cải tiến trong việc xác định các yêu cầu sinh hóa đối với sự phát triển của các tế bào sinh lý và biến đổi đã cho phép Tiến sĩ George Otto Gey tại Bệnh viện Johns Hopkins thành lập dòng tế bào ung thư đầu tiên và nổi tiếng từ người, được đặt tên là HeLa [2]. Tên “HeLa” là từ viết tắt của Henrietta Lacks, một phụ nữ trẻ da đen bị ảnh hưởng bởi ung thư biểu mô cổ tử cung, từ đó tế bào HeLa được tạo ra. Sự ra đời của dòng tế bào HeLa có thể coi là một cột mốc quan trọng khác trong lịch sử sinh học tế bào, đồng thời nó đã mở ra những hướng mới trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư. Bắt đầu từ sự ổn định của chúng, các tế bào HeLa đã tạo thành ví dụ đầu tiên về “bệnh ung thư ở người trong ống nghiệm”. Dòng tế bào HeLa rất ổn định và tăng sinh mạnh – điều này dẫn đến việc chúng dễ nhiễm chéo vào nhiều dòng tế bào khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu. Sự tăng sinh ổn định của dòng tế bào HeLa và đặc tính dễ bị nhiễm virus bại liệt nên đến năm 1954, Jonas Salk đã phát triển một loại vacxin phòng bệnh bại liệt bằng việc sử dụng các tế bào HeLa. Ngày nay, các dòng tế bào ung thư đã được sử dụng rộng rãi cho các mục đích nghiên cứu và được chứng minh là một công cụ hữu ích để tìm hiểu về mặt di truyền của các bệnh ung thư, thực tế cho thấy chúng là một mô hình tuyệt vời cho việc nghiên cứu các cơ chế sinh học gây ra căn bệnh này [3]. Nghiên cứu ứng dụng các dòng tế bào ung thư đã cho phép tìm hiểu thông tin về sự tăng hoặc giảm sự biểu hiện của các gen liên quan và các con đường truyền tín hiệu trong tế bào ung thư [4]. Hơn nữa, việc sử dụng mô hình tế bào là cơ sở cho sự phát triển và thử nghiệm các loại thuốc chống ung thư hiện đang được sử dụng [5, 6] và cũng là một phương pháp thay thế cho cấy ghép khối u động vật trong thử nghiệm hóa trị liệu [7]. Trên thực tế, việc sử dụng mô hình tế bào in vitro trong nghiên cứu ung thư là rất quan trọng để điều tra các con đường di truyền, di truyền ngoài gen (epigenetics), sự tăng sinh, quá trình tự chết (apoptosis) và sự tiến triển của ung thư,
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học
320 tài liệu
1253 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2