Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:157

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm phân tích một số đặc điểm sinh học và xác định được các điều kiện thích hợp cho việc nhân giống (bằng hình thức giâm hom thân, nuôi cấy mô) loài Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (THUNB. EX MURRAY) TREVIS) THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (THUNB. EX MURRAY) TREVIS) THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Lê Thị Bích Thủy 2. GS. TS. Nguyễn Đức Thành Hà Nội – 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với một số cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành, các hội nghị trong nước và quốc tế với sự đồng ý sử dụng số liệu của các đồng tác giả. Những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Lê Thị Lan Anh
ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của mình đến GS. TS. Nguyễn Đức Thành và TS. Lê Thị Bích Thủy, phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, hướng dẫn khoa học và định hướng nghiên cứu cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô tại Viện Công nghệ sinh học đã giảng dạy, cung cấp kiến thức mới để tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các nội dung trong chương trình đào tạo. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Ngô Văn Vụ - Hiệu trưởng trường Cao Đẳng Sư Phạm Hà Tây, các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô trong các Khoa, Phòng, Ban nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện tốt nhất, hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ chuyên môn tại trường trong suốt thời gian tôi đi học. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công Nghệ sinh học, tập thể các cán bộ thuộc Vườn Quốc gia Hoàng Liên và Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, hỗ trợ, giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo ở Viện Công nghệ sinh học và Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm ở Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các hồ sơ trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài Quỹ gen - Bộ Khoa học và Công nghệ: “Khai thác và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trev.) tại Sapa và Đà Lạt”. Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn tôi xin gửi đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, quan tâm, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian qua để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và công tác chuyên môn. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Nghiên cứu sinh Lê Thị Lan Anh
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...............................................v DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... ix MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài .................................................... 2 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................2 2.2. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................2 3. Những đóng góp mới của đề tài ........................................................................ 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .......................................................................... 3 4.1. Ý nghĩa khoa học ...........................................................................................3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...........................................................................................3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................5 1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) .............................. 5 1.1.1. Phân loại .....................................................................................................5 1.1.2. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa ......................................6 1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa ..............................7 1.1.4. Đặc điểm sinh sản .....................................................................................10 1.1.5. Đặc điểm hóa sinh .................................................................................... 11 1.1.6. Các nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Thạch tùng răng cưa ..............14 1.2. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa ................ 15 1.2.1. Các nguồn tự nhiên có chứa HupA ..........................................................15 1.2.2. Thành phần, cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học của HupA ....................18 1.2.3. Các nghiên cứu về tách chiết và xác định hàm lượng HupA ...................20 1.2.4. Vai trò của HupA trong y học ...................................................................22 1.2.5. Dược động học của HupA ........................................................................23 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở Việt Nam........................................................................................................ 25
iv 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới ......25 1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam .......30 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................31 2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 31 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................31 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ...................................................................................32 2.1.3. Môi trường nuôi cấy .................................................................................33 2.1.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm .............................................................33 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 34 2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa .................................................................................................................34 2.2.2. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa ........................................39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................46 3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ... 46 3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa ......................46 3.1.2. Đánh giá đặc điểm vi phẫu Thạch tùng răng cưa .....................................49 3.1.3. Đánh giá đặc điểm sinh thái học của Thạch tùng răng cưa ......................51 3.1.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa bằng chỉ thị phân tử RAPD .......................................................................................................53 3.1.5. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng. .......................................................................................................59 3.2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa ................................................................ 68 3.2.1. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng giâm hom thân .........68 3.2.2. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô .............88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ..................................................109 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 110 PHỤ LỤC
v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACh Acetylcholine Axetylcholin AChE Acetylcholinesterase Enzym acetylcholinesteraza AD Alzheimer’s disease Bệnh Alzheimer AFLP Amplified fragment length Đa hình chiều dài của đoạn polymorphism được khuếch đại. BA 6-benzyladenin 6-benzyladenin BuChE Butyrylcholinesterase Enzym butyrylcholinesteraza CTAB Cetyltrimethyl Xetyltrimethyl amoniumbromit amoniumbromide CYP Cytochrome P450 Xytochrom P450 DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleoside Deoxyribonucleosit triphosphat triphosphate EDTA Ethylene diamin tetra acetate Ethylene diamin tetra axetat HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography HupA Huperzine A Huperzin A H. serrata Huperzia serrata Thạch tùng răng cưa IAA β-indole acetic acid Axit β-indole acetic IBA Indole-3-butyric acid Axit indole-3-butyric IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa một nửa concentration Kb Kilobase Kilo bazơ LC-MS Liquid chromatography-mass Sắc ký lỏng khối phổ spectrometry MS Murashige and Skoog medium Môi trường Murashige và Skoog NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic
vi Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraza Phy Physostigmine Physostigmin RAPD Random amplified Đa hình phân đoạn DNA được polymorphic DNA nhân bản ngẫu nhiên Rf Rentention factor Hệ số di chuyển RNase Ribonuclease Enzim ribonucleaza SD Standard deviation Độ lệch tiêu chuẩn TE Tris EDTA Tris EDTA THA Tetrahydroaminoacridine Tetrahydroaminoacridin TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng UPLC - MS Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp ghép đầu chromatography - mass dò khối phổ Spectrometry UPLC-PDA Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp với đầu dò chromatography- photodiode PDA array UPLC-Q/TOF/ Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp/ phương MS chromatography/ quadrupole pháp quang phổi khối thời gian time of flight/ mass chạy tứ cực spectrometry UV Ultra violet Tia tử ngoại
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu……………………… …32 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 16 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu... …36 Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy mô sẹo………………………………………43 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu ở Lâm Đồng và Lào Cai……………………………………………………………..…46 Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16 mồi RAPD…………………………………………………………..…55 Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa……….…56 Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa thu hái vào tháng 9 (mùa thu).……….............…64 Bảng 3.5. Hàm lượng HupA của rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa………….…66 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chiều dài hom thân đến sự sinh trưởng của cây con Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng giâm hom………………………………………………………………69 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sự sinh trưởng của cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm tại Lâm Đồng và Lào Cai….…71 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lâm Đồng………………………………………………………………..…74 Bảng 3.9. Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lào Cai….…76 Bảng 3.10. So sánh hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của hom thân Thạch tùng răng cưa ở hai vùng nghiên cứu……....78 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của độ sâu hom thân giâm đến sinh trưởng cây con Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng……….…80 Bảng 3.12. So sánh hiệu quả giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai và Lâm Đồng sau 4 tháng…………………………………...........…..81 Bảng 3.13. Sự sinh trưởng của cây con sau 2 tháng bón phân tại Lâm Đồng….…83 Bảng 3.14. Sự tăng trưởng của cây con trong bầu ươm ở các thời gian khác nhau…………………………………………………………………. …84
viii Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian ra ngôi đến sinh trưởng cây con Thạch tùng răng cưa……………………………………………….…..85 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các chất khử trùng đến mẫu Thạch tùng răng cưa sau 30 ngày nuôi cấy……………………………………………….…89 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến nuôi cấy chồi Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy……………………………………91 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của BA đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy…………………………………………………..…93 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của Kinetin đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy……………………………………………94 Bảng 3.20. So sánh hiệu quả của BA và kinetin đến tạo cụm chồi Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy……………………………………..…95 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy…………………………………………………….…96 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của α - NAA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy.…………………………………………..…97 Bảng 3.23. So sánh hiệu qủa của α - NAA và IBA đến sự phát triển rễ sau 60 ngày nuôi cấy…………………………………………………..…97 Bảng 3.24. Kết quả nuôi cấy mô sẹo Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng………....100 Bảng 3.25. Tạo đa chồi mô sẹo Thạch tùng răng cưa trên môi trường ¼ MS + 1 mg/l kinetin sau 4 tháng…………………………….........102
ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata………………………………..…..6 Hình 1.2. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa trên thế giới………………….…..7 Hình 1.3. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam……………………..8 Hình 1.4. Hình thái của cây mầm ở các độ tuổi khác nhau………………………10 Hình 1.5. Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của lycopodium alkaloid thu từ loài Thạch tùng răng cưa……………………………………………12 Hình 1.6. Các hợp chất khác từ loài Thạch tùng răng cưa…………………….…13 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của hai hợp chất HSE-1 (a) và HSE-2 (b)……….…13 Hình 1.8. Con đường sinh tổng hợp của HupA.................................................. …..18 Hình 1.9. Các đồng phân quang học của HupA……………………………….…18 Hình 1.10. Cấu trúc tương tự của HupA và acetylcholine (ACh)…………………19 Hình 1.11. Cấu trúc phân tử HupA……...…………………………………………19 Hình 1.12. Các tương tác chính giữa AchE và phân tử HupA ………………….…20 Hình 2.1. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lào Cai…………………………………..…31 Hình 2.2. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lâm Đồng……………………………….…31 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát…………………………………..…34 Hình 3.1. Hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng ….……………47 Hình 3.2. Một số hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai………....…47 Hình 3.3. Cây Thạch tùng răng cưa trong rừng tại Lâm Đồng………………… …48 Hình 3.4. Đế mầm trên cây Thạch tùng răng cưa mẹ…………………………... …49 Hình 3.5. Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai………………….…50 Hình 3.6. Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng…………………50 Hình 3.7. Vi phẫu lá Thạch tùng răng cưa…………………………………… …51 Hình 3.8. Thạch tùng răng cưa trên bờ suối tại Nam Ban, Lâm Đồng................. …51 Hình 3.9. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC5.…………………………………………………………..…54 Hình 3.10. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC13………………………………………………………….. …54 Hình 3.11. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB13……………………………………............................……54 Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa..……………56 Hình 3.13. Hình ảnh chạy TLC HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa………….…60 Hình 3.14. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại DL1…....…61
x Hình 3.15. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai..…62 Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết lá Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai……………………………..…62 Hình 3.17. Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết lá cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng…………………….. …63 Hình 3.18. Phổ ESI - MS Positive và peak ion phân tử 243,0………………… …63 Hình 3.19. Cây con Thạch tùng răng cưa trong vườn ươm…………………….…81 Hình 3.20. Cây Thạch tùng răng cưa ngoài vườn ươm tại Lâm Đồng………….…85 Hình 3.21. Sơ đồ một số khâu cơ bản trong quy trình nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng giâm hom thân……………………………………..…86 Hình 3.22. Mẫu Thạch tùng răng cưa sau 30 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường MS ………………………………………………………….…90 Hình 3.23. Chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy trên môi trường ¼ MS………...…92 Hình 3.24. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy trên môi trường ¼ MS có bổ sung 1 mg/l kinetin……………………………………………….…95 Hình 3.25. Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy trong môi trường 1/4 MS có bổ sung 1 mg/l IBA……………………………………...…98 Hình 3.26. Cây Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy trong nhà kính…. …98 Hình 3.27. Nuôi cấy mô sẹo đỉnh chồi Thạch tùng răng cưa trên môi trường ¼ MS + 0,015 mg/l IBA + 0,3 mg/l kinetin + 3 mg/l glutamin……....101 Hình 3.28. Đa chồi hình thành từ mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường ¼ MS………………………………………………………....101 Hình 3.29. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa được hình thành từ mô sẹo sau 4 tháng nuôi cấy……........................................................................... ..103 Hình 3.30. Cây Thạch tùng răng cưa in vitro nuôi cấy trên môi trường 1/4 MS + 1 mg/l IBA………………………………………………………. ..103 Hình 3.31. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết toàn bộ cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2019.....................105
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, trước những tác động lớn của biến đổi khí hậu, dịch bệnh và sự khai thác quá mức của con người, vấn đề nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen các loài cây trồng nói chung, trong đó có các loại cây dược liệu đang là vấn đề được khoa học và xã hội quan tâm. Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) là loại cây dược liệu quý, thuộc danh sách "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về cây thuốc. Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa là huperzine A (HupA) có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt là bệnh Alzheimer ở người già [1]. Với kết quả nghiên cứu và phát hiện về tác dụng tuyệt vời của HupA dựa trên kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học phương tây đã cho thấy triển vọng phát triển các loại thuốc chữa bệnh Alzheimer từ loài cây này [2]. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, số lượng người có vấn đề về suy giảm trí nhớ nói chung và người mắc bệnh Alzheimer nói riêng đang ngày một tăng cao, nhu cầu về thuốc thảo dược có chứa hoạt chất HupA vì thế không ngừng tăng, đây có thể là nguyên nhân chính dẫn đến việc khai thác quá mức làm suy giảm nghiêm trọng nguồn gen loài cây dược liệu quý này trong tự nhiên. Do đó, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân và nuôi cấy mô nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này. Các nghiên cứu cho thấy, loài Thạch tùng răng cưa sinh trưởng tốt trong rừng với đất mùn ẩm ướt, độ cao 350 - 1700 m, lượng mưa trên 1500 mm/ năm, độ ẩm trên 78% [3, 4]... Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa đã được tìm thấy trên các vùng cao tại một số khu vực như Lào Cai, Lâm Đồng, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Nghệ An, Tây Nguyên, Quảng Trị…[5]. Trong đó, Lâm Đồng và Lào Cai là hai khu vực có điều kiện khí hậu và môi trường sống thích hợp hơn cho sự phát triển của loài Thạch tùng răng cưa so với các khu vực khác trong cả nước. Tuy nhiên, Thạch tùng răng cưa có đặc tính sinh trưởng chậm, khả năng sinh sản kém, mức khai thác nguồn cây trồng tự nhiên quá lớn đã làm mất dần nguồn gen quý này ở nước ta, dẫn đến loài Thạch tùng răng cưa không đáp ứng được nhu cầu về nguồn nguyên liệu
2 cho sản xuất dược phẩm. Do vậy, để chủ động nguồn dược liệu cho chiết xuất hoạt chất HupA dùng làm thuốc, việc nghiên cứu một số đặc điểm sinh học để lựa chọn giống cây có khả năng sinh tổng hợp HupA cao, từ đó tìm ra các phương pháp để tái sinh và nhân giống nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này là vô cùng cần thiết. Hơn nữa, Việt Nam cũng chưa có công trình nghiên cứu nào thành công về nhân giống loài Thạch tùng răng cưa với quy mô lớn. Xuất phát từ thực tế và nhận định trên, chúng tôi lựa chọn hai vùng Lâm Đồng và Lào Cai để thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng”. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 2.1. Mục tiêu nghiên cứu Phân tích một số đặc điểm sinh học và xác định được các điều kiện thích hợp cho việc nhân giống (bằng hình thức giâm hom thân, nuôi cấy mô) loài Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam. 2.2. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh thái học và tính đa hình DNA của loài Thạch tùng răng cưa. i. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Thạch tùng răng cưa. ii. Đặc điểm sinh thái học của loài Thạch tùng răng cưa. iii. Tính đa hình DNA của loài Thạch tùng răng cưa. 2. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên thu thập tại Lào Cai và Lâm Đồng. 3. Nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng răng cưa. i. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân. ii. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức nuôi cấy mô. 4. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy
3 mô. 3. Những đóng góp mới của đề tài Luận án là nghiên cứu mới có hệ thống khi kết hợp cùng lúc phương pháp phân tích về hình thái, giải phẫu thực vật và sinh học phân tử để đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng. Xác định được hàm lượng HupA trong 8 mẫu nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, trong đó, các mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng có hàm lượng HupA (90,23 µg/g) cao hơn so với các mẫu thu tại Lào Cai (76,28 µg/g); hàm lượng HupA ở lá cao hơn thân và rễ; lá Thạch tùng răng cưa thu hái vào mùa thu (tháng 9) có hàm lượng HupA (92,50 µg/g) cao hơn thu hái vào mùa xuân (tháng 3) (75,10 µg/g). Đã xác định được một số khâu cơ bản làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp giâm hom thân (tại Lào Cai và Lâm Đồng) với tỉ lệ cây hồi xanh sau ra ngôi đạt 97,78% và phương pháp nuôi cấy mô với tỉ lệ sống sót trên giá thể đạt 97%; đồng thời, xác định được hàm lượng HupA trong cây nuôi cấy mô đạt 300 µg/ g khối lượng khô. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của luận án cung cấp các thông tin khoa học về đặc điểm hình thái, tính đa dạng về hệ gen, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng. Cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong nhân giống, mở ra triển vọng đáp ứng nguồn cây giống đồng đều và chất lượng cho phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học có ý nghĩa định hướng cho công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam. Xác định được thời điểm thu hoạch và bộ phận thu hái Thạch tùng răng cưa để nhận được hàm lượng HupA cao nhất phục vụ cho y học; đồng thời, giảm thiểu
4 được việc khai thác dẫn đến mất dần nguồn gen Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên. Thành công trong phương pháp nhân giống sẽ góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa tại các vùng có khả năng trồng ở Việt Nam, cung cấp nguyên liệu có hoạt chất HupA cao phục vụ cho việc sản xuất thuốc điều trị các bệnh rối loạn về trí nhớ.
5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) 1.1.1. Phân loại Thạch tùng răng cưa tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis, (trước đây gọi là Lycopodium serratum Trevis, Huperziaceae), thuộc bộ Lycopodiales, họ Lycopodiaceae, chi Huperzia. Chi Huperzia có khoảng 500 loài trên toàn thế giới [6, 7]. Ở Việt Nam, họ Lycopodiaceae có 3 chi là Huperzia, Lycopodium và Lycopodiella với tổng số 14 loài. Trong đó, chi Huperzia là chi lớn nhất với 10 loài gồm Huperzia cancellata (Spring) Trevis., H. carinata (Poir.) Trevis, H. chinense (Christ) Ching, H. hamitolnii (Spring) Trevis, H. subdisticha Mak, H. obovalofolia (Bon.), H. plegmaria (L.) Roth., H. salvinoides (Herter) Alston., H. serrata (Thunb.) Trevis và H. squarrosa (Forst.) Trevis [8, 9, 10]. Đây là những loài được đánh giá có tiềm năng sử dụng trong điều trị nhiều bệnh như Alzheimer, Parkinson, đau, sưng tấy, phát ban, tâm thần phân liệt và bệnh nhược cơ ở các nước Đông Á [5]. Theo Nguyễn Thọ Biên (2017), họ Lycopodiaceae ở Việt Nam gồm 12 loài có tác dụng chữa bệnh, trong đó có 11 loài được phát hiện ở tỉnh Lâm Đồng: Thạch tùng (thông đá, thăng kim thảo - Lycopodium clavatum L.); Thạch tùng nhiều bông (Huperzia chinense (H. Chirst) Ching); Thạch tùng phi lao (Lycopodium casuarinoides Spring); Thạch tùng răng cưa (H. serrata (Thunb.) Trevis); Thạch tùng thân gập (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis); Thạch tùng xoan ngược (Huperzia abovalifolia (Bon); Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm); Thông đất dẹp (Lycopodium complanatum L.); Thông đất Haminton (Huperzia hamilltonii (Spreng.) Trevis); Thông đất râu (Huperzia plegmaria (L.) Rothm); Thông đất song (Huperzia carinata (Desv. Ex Poir.) Trevis [11]; Thạch tùng Ford (Huperzia fordii (Backer) R. D. Dixit) chỉ gặp ở vùng núi thấp của Hà Nội (Ba Vì) [12]. Bốn trong số 12 loài trên đã được đưa vào danh mục cây thuốc Việt Nam (2016) gồm: Thạch tùng Ford, Thạch tùng nhiều bông, Thạch tùng phi lao, Thạch tùng răng cưa [12].
6 1.1.2. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa Thạch tùng răng cưa (Hình 1.1) thuộc loài thân cỏ mọc ở đất, thân cao 15 cm - 40 cm, thân đơn hay lưỡng phân 1 - 2 lần, hình trụ, đường kính khoảng 2 mm. Lá hình bầu dục, mũi mác, dài 15 mm, rộng 3 mm, phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cưa, rễ dạng chùm [13]. Ngoài ra, theo nghiên cứu của Phạm Hoàng Hộ (2006), cây Thạch tùng răng cưa thu ở Sa Pa và Đà Lạt có đặc điểm là: thân đứng, cao 8 cm - 20 cm, lá thon hẹp, kích thước 2 – 3 cm x 0,40 cm, tương đối mỏng, gân rõ giữa, bìa có răng không đều. Bào tử nang ở nách lá không khác lá thường, hình thận, màu vàng tươi [14]. Sự phát triển của túi bào tử từ lúc bắt đầu đến khi trưởng thành mất gần 1 năm. Cấu trúc của thành túi bào tử trưởng thành bao gồm một lớp biểu bì, ở giữa là hai lớp tế bào và một lớp mô dưỡng chất gọi là tapetum. Do đó, túi bào tử của loài Thạch tùng răng cưa thuộc loại túi bào tử dày (eusporangium) [15]. Bào tử được phát tán ra khi túi bào tử trưởng thành. Mầm tập trung nhiều ở phần trên của cây và những mầm này có thể phát triển thành cây mới sau khi rơi xuống đất. Tuy nhiên, Thạch tùng răng cưa ít khi được nhân giống bằng mầm [16]. Bào tử Thân Lá Hình 1.1. Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata [17]. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa ở khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa - Quảng Trị cho thấy cây trưởng thành là những cây có khả năng sản sinh bào tử nang có màu vàng tươi, hình thận với kích thước 0,8 mm mọc ở nách lá. Ngược lại, cây tái sinh thường chưa sản sinh bào tử nang, chiều cao và đường kính nhỏ hơn cây trưởng thành, với chiều cao 3,54 cm, đường kính 0,75
7 mm. Đối với cây trưởng thành có dạng cây thân thảo đứng có chiều cao trung bình 11,89 cm - 14,25 cm, đường kính thân trung bình 1,80 mm. Lá có hình dạng lưỡi mác, chiều dài 1,84 cm - 2,57 cm, chiều rộng 0,37 cm - 0,41 cm, gân giữa nổi rõ, mép lá có răng cưa không đều với số lá trung bình 79,80 lá/ cây [18]. 1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa Thạch tùng răng cưa phân bố trên toàn thế giới nhưng tập trung nhiều nhất ở khu vực ôn đới phía đông, phía nam đến vùng nhiệt đới Đông Nam của Châu Á, cũng như Châu Đại Dương và Trung Mỹ (Hình 1.2) [19]. Chúng sống bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, phát triển tốt trong rừng hoặc trong khe núi với đất mùn ẩm ướt, ở độ cao 350 m - 1700 m, lượng mưa trên 1500 mm, độ ẩm tương đối cao 78%, hàm lượng nước trong đất 10% - 30%, pH đất 4,57 - 5,31, độ dẫn đất 0,06 - 0,85 cm/ cm, và hàm lượng chất hữu cơ 6,18% - 9,75% [3, 4]. Hình 1.2. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa trên thế giới [20]. Theo nghiên cứu của Kaur và cộng sự (2016), Thạch tùng răng cưa chủ yếu được tìm thấy ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam, Indonesia, Fiji, Samoa, Mexico, Mỹ, Thái Lan, bán đảo Malaysia, Nga, Đài Loan, Úc và Cuba. Ấn Độ phát hiện được 21 loài thuộc chi Huperzia. Trong đó, 6 loài bao gồm Huperzia cancellta (Spring) Trevis., H. carinata (Desv.) Trevis., H. quasipolytrichoides (Hayata) Ching (H. cryptomerina sensu Dixit), H. nummulariifolia (Blume) Jermy, H. phyllantha (Hook & Arn) Holub và H. vernicosa (Hook & Grev.) Trevis bị đe dọa nghiêm trọng và bốn loài là H. ceylanica (Spring) Trevis., H. nilagirica (Spring) Dixit., H. selago (Linn) Bernh. Ex Schrenk & Mart subsp arctica (Grossh ex. Tolm.) A. Love & D. Love (H. dixitiana P. Mondal & S. R. Ghosh) và H. phlemaria (Linn) Rothm. (Phlegmariurus Plegmaria
8 (Linn.) Sen & Sen) xuất hiện với tỉ lệ hiếm. Thạch tùng răng cưa chủ yếu được tìm thấy ở vùng cận nhiệt đới đến rừng ôn đới ở độ cao 900 m - 3500 m khu vực Đông Bắc của Ấn Độ như West Bengal (Darjeeling), Meghalaya, Manipur và đồi Nilgiri của Tamilnadu [21]. Ở Trung Quốc, Thạch tùng răng cưa chủ yếu xuất hiện trong rừng lá rộng thường xanh, tập trung nhiều ở các khu vực từ vùng phía Nam đến sông Dương Tử; nơi đây, lượng mưa hàng năm trên 1000 mm và chúng thường sinh trưởng trong các môi trường được che bóng, ẩm ướt và đất mùn axit, ở độ cao dao động từ 300 đến 2700 m [4]. Ở nước ta, cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá. Cây thường phân bố ở độ cao trên 1000 m so với mực nước biển. Cây phát triển tốt trong môi trường bóng mờ, ẩm ướt và rất ẩm ướt, đất có nguồn chất hữu cơ phong phú, độ mùn cao, điều này làm hạn chế môi trường sống của chúng ở các vùng có độ cao cao hơn tại Việt Nam [22]. Chúng phân bố rải rác tại các vùng cao như Lâm Đồng, Lào Cai, Nghệ An, Cao Bằng, Quảng Trị, Quảng Nam - Đà Nẵng, Khánh Hòa, Tam Đảo [5, 8] (Hình 1.3). Hình 1.3. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam [20]. Từ Bắc vào Nam, bốn quần thể bản địa của loài này phân bố tại các khu bảo tồn thiên nhiên đã được xác định ở Việt Nam bao gồm Vườn Quốc gia Hoàng Liên (tỉnh Lào Cai), Vườn Quốc gia Bạch Mã (tỉnh Thừa Thiên Huế), Khu bảo tồn Quốc