Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:156

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài lầ xây dựng được cách thức phát hiện một số đột biến gen ty thể phổ biến và sàng lọc đột biến gen ty thể này ở bệnh nhân cơ não (encephalomyopathy); thiết lập được phương phương pháp xác định mức độ không đồng nhất của một loại đột biến gen ty thể (MELAS) ể ướ ầu tìm hiểu mối liên quan giữa ứ ộ h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người Việt Nam

IH QU GI H N I TRƢ NG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trƣơng Thị Huệ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CƠ NÃO NGƢ I VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C Hà Nội, 2013 IH QU GI H N I TRƢ NG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Trƣơng Thị Huệ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CƠ NÃO NGƢ I VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 30 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA H C: 1. PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa 2. PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội, 2013
I CAM ĐOAN T i xin a an y ng nh nghi n ứ i hực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa v PGS.TS. Nguyễn Thị V n nh ố iệ ế n ng ận n ng hự v hưa ng ư ai ng ố ng ấ ng nh n h NCS. Trương Thị Huệ i
L I C M ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, người thầy tâm huyết đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Người thầy đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất, luôn dành cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt quá trình làm nghiên cứu khoa học. Tôi xin gửi đến Thầy lời tri ân nhất về những điều mà Thầy đã dành cho tôi. i in ày tỏ lòng c ơn tới PGS. Nguy n hị ân nh, đã ch ẫn và giúp đỡ t i trong qu tr nh thực hiện luận án. i in chân thành c ơn đến GS.TS. Nguy n hanh Liê , Gi đốc Bệnh viện Nhi rung ương cùng c c B c sĩ Phạm Thị ân nh, B c sĩ rịnh Thúy Ngọc đã nhiệt t nh giúp đỡ, cung cấp và chia sẽ thông tin về bệnh nhân trong quá trình thu thập mẫu nghiên cứu. Tôi xin chân thành c ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, rường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành c ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh –K NN, rường Đại học Quy Nhơn, c c thầy, cô giáo, các anh chị bạn è đồng nghiệp trong Khoa Sinh học, các thành viên trong nhóm nghiên cứu Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng Thí nghiệm trọng điể ng nghệ n y và Prot in, rường Đại học Khoa học ự nhiên i in gửi lời c ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng au Đại học, Ban hủ nhiệm Khoa Sinh học và c c Phòng chức năng của rường Đại học Khoa học ự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều iện cho t i học tập, hoàn thành c c thủ t c cần thiết của một nghiên cứu sinh. Luận n đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài NAFOSTED 106.06.123.09 và b n thân t i cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tư cách là một nghiên cứu sinh của đề tài. Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới c c ậc ố, chồng con, gia đ nh, những người đã lu n ên t i, cổ vũ, động viên và tạo điều iện thuận lợi nhất cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận n NCS. Trương Thị Huệ ii
MỤC LỤC Trang LỜI M O N i LỜI M N ii M L iii NH M K HI U V H VIẾT TẮT vi NH M NG viii NH M H NH V TH ix MỞ ẦU .................................................................................................................. 1 HƯ NG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U ........................................................... 5 1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨ NĂNG ỦA TY THỂ NGƯỜI .......................................5 1.1.1. Cấu trúc của ty thể .....................................................................................5 1.1.2. Chứ năng ủa ty thể .................................................................................7 1.2. H GEN TY THỂ VÀ SỰ DI TRUYỀN CỦA CÁC GEN TY THỂ.....................12 1.2.1. Hệ gen ty thể ............................................................................................12 1.2.2. Sự di truyền theo mẹ và thuyế “nú ổ chai di truyền” ..........................16 1.2.3. Tính chấ h ng ồng nhấ v ngưỡng biểu hiện của ột biến ................18 1.2.4. Tố ộ ột biến của DNA ty thể ..............................................................20 13 T BIẾN TRONG H GEN TY THỂ NGƯỜI VÀ CÁC B NH LIÊN QUAN ....................................................................................................................21 131 ột biến iểm DNA ty thể ....................................................................... 22 132 ột biến khác trên DNA ty thể ..........................................................29 1.3.3. Các bệnh i n an ến rối loạn ty thể d ột biến gen nhân ..................33 14 PHƯ NG PH P PH T HI N T BIẾN GEN TY THỂ .........................35 141 ặ iểm chung của bệnh d ột biến gen ty thể..............................35 1 4 2 Ph n í h ột biến iểm DNA ty thể bằng PCR kết h p với RFLP ........38 1 4 3 Ph n í h ột biến iểm bằng x ịnh trình tự gen ................................39 1 4 4 Ph n í h ột biến gen ty thể bằng một số phương ph p h ................39 iii
HƯ NG 2 NGUYÊN LI U V PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU .. 43 2.1. NGUYÊN LI U ................................................................................................43 2.1.1. Mẫu máu ..................................................................................................43 2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác ...............................................................43 2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT B ...................................................................43 2 3 PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU.......................................................................44 2 3 1 T h hiế N ổng số t mẫu máu ......................................................44 2.3.2. Tách chiết DNA plasmid .........................................................................44 2.3.3. Kiể av ịnh ư ng DNA tách chiết ..................................................45 2.3.4. Nhân b n ạn gen ty thể chứa ột biến bằng kỹ thuật PCR ..................46 2.3.5. Kỹ thuật PCR kết h p với kỹ thuậ a h nh hiề d i ạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) ..............................................................................................46 2.3.6. Nhân dòng trực tiếp ạn gen chứa ột biến vào vector pGEM- T ........47 2 3 7 Gi i nh ự ạn g n hứa ột biến .................................................48 238 iện di DNA trên gel agarose .................................................................50 239 iện di DNA trên gel polyacrylamide .....................................................51 2 3 10 ịnh ư ng ột biến A3243G bằng kỹ thuật real-time PCR .................52 2 3 11 ịnh ư ng acid lactic trong máu ...............................................................56 HƯ NG 3 KẾT QU VÀ TH O LUẬN ................................................. 57 3.1. PHÂN TÍCH Ặ TRƯNG ỦA B NH NHÂN CH N NGHIÊN CỨU T BIẾN GEN TY THỂ .......................................................................................57 311 ặ iểm về bệnh lý: .........................................................................57 312 ặ iểm về tuổi và giới tính: ...........................................................59 3.2. XÂY DỰNG CÁCH THỨC PHÁT HI N M T S T BIẾN IỂM TRONG H GEN TY THỂ ....................................................................................................60 3.2.1. Tách chiết DNA t mẫ v nh gi ộ tinh sạch ...........................60 3.2.2. Thiết kế các cặp mồi ặc hiệu và lựa chọn enzyme cắt cho kỹ thuật PCR- RFLP dùng ể phát hiện ột biến iểm trong hệ gen ty thể ........................61 323 X ịnh iều kiện thích h p cho phân tích PCR-RFLP .........................66 iv
3 2 4 X y dựng ch thức phát hiện ột biến iểm trong DNA ty thể .............72 3.3. SÀNG L S T BIẾN GEN TY THỂ Ở B NH NHÂN NÃO .......................................................................................................................73 3.3.1. Sàng lọ ột biến A3243G bằng PCR-RFLP ..........................................73 3.3.2. Sàng lọ ột biến A8344G / mấ ạn 9 bp bằng PCR-RFLP ................77 3.3.3. Sàng lọ ột biến T14728C bằng PCR-RFLP .........................................82 3.4. SỰ BIỂU HI N CỦ T BIẾN GEN TY THỂ Ở MỨ GI NH ..........88 3.4.1. Nghiên cứ ột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS ........................88 3.4.2. Sự di truyền phân tử của ột biến mấ ạn 9 bp (nucleotide 8272-8280) ..101 3.4.3. Sự di truyền phân tử của ột biến T14727C thuộc hội chứng ơ n ...105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH ......................................................................... 111 M TS ÔNG TR NH Ã ÔNG LIÊN QU N ẾN LUẬN ÁN .......................................................................................................................... 112 TÀI LI U THAM KH O...........................................................................113 v
DANH MỤC C C HIỆU V CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate Amp Ampicillin ANT Adenine nucleotide translocase bp Base pair (cặp azơ) BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ hu nh quang) COII Cyt c oxidase II CoQ Coenzyme Q CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia (liệt mắ ơ ng i iến triển kinh niên) Cyt c Cytochrome c Cyt b Cytochrome b D-loop Vòng chuyển vị dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate ddH2O Deionized distilled H2O (nước cất loại ion, khử trùng) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide FAD+ Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng khử) IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase KSS Kearns-Sayre syndrome (hội chứng KSS) LB Luria Bertani LHON L ’ h di a y p i n pa hy (liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber) LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa) MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes vi
(não giậ ơ ăng a id a i v gi tai biến mạch) MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres ( ộng kinh giậ ơ với các s i ỏ xé rách) MIDD Maternally inherited diabetes and deafness (bệnh tiể ường v iếc di truyền theo mẹ) MRI Magnetic resonance image (hình nh chụp cộng hưởng t ) mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể) nDNA Nuclear DNA (DNA nhân) NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử) NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos (hội chứng gây liệt, mất sự iều hòa và viêm võng mạc OD Optical density (mậ ộ quang học) PCR Polymerase chain reaction (ph n ứng chuỗi polymerase) PEO Progressive external ophthalmoplegia (liệ ơ ắt ngoài tiến triển) RFLP Restriction fragment length polymorphism (sự a h nh ạn phân cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (dạng oxy ph n ứng) SDS Sodium dodecylsulphate TAE Tris -Acetate-EDTA TBE Tris -Borate-EDTA TEMED N N N’ N’- Tetramethyl-Ethylenediamine Tm Melting temperature (nhiệ ộ nóng ch y) X-gal 5-Bromo-4 chloro-3-indolyl--D galactopyranoside vii
DANH MỤC CÁC B NG B ng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể ..................................................................... 14 ng 2 1 Thành phần trong b n gel polyacrylamide ............................................... 51 B ng 2.2. Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR..............................54 B ng 3.1. ặ iểm lâm sàng và tỷ lệ bệnh nhân bị ộng .............................................57 B ng 3.2. Trình tự mồi và chế ộ nhiệt cho PCR ..................................................... 63 B ng 3.3. Enzyme giới hạn dùng ng ph n í h ột biến ......................................69 B ng 3.4. Một số ột biến trong hệ gen ty thể ư c phát hiện ở bệnh nh n ơ n ............86 B ng 3.5. Tỷ lệ ột biến A3243G của bệnh nh n v người thân trong các gia nh ........................................................................................................................... 94 B ng 3.6. Triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ ột biến A3243G của người con trong gia nh ..................................................................................................................... 98 viii
DANH MỤC C C H NH Hình 1. 1. Các hình dạng khác nhau của ty thể ...........................................................5 Hình 1. 2. Cấu trúc của ty thể......................................................................................6 Hình 1.3. Cấu trúc màng trong ty thể ..........................................................................7 Hình 1.4. Ty thể v nh a ổi năng ư ng trong tế bào..................................9 H nh 1 5 ơ hế của sự lão hoá theo thuyết ty thể ..................................................10 Hình 1.6. Sự tổng h p và nh hưởng của ROS trong ty thể .....................................10 Hình 1.7. Hệ gen ty thể người ...................................................................................13 Hình 1.8. Thuyết nút cổ chai di truyền .....................................................................17 Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide c i biến dạng LNA .............................................53 Hình 2.2. Nguyên lý hoạ ộng của mẫu dò Taqman ...............................................54 Hình 2.3. Biểu ồ mộ ường biểu diễn khuế h ại (A) và biể ồ chuẩn về mối quan hệ giữa số b n N í h ó ng ẫu chuẩn và chu k ngưỡng ương ứng (B) ......................................................................................................................55 Hình 3.1.Tỷ lệ các nhóm tuổi của bệnh nhân ................................................................ 59 H nh 3 2 iện di s n phẩm DNA tổng số t mẫu máu của các bệnh nhân..............60 H nh 3 3 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen chứa ột biến t mẫu máu của bệnh nhân. ..........................................................................................................................67 H nh 3 4 iện di s n phẩm PCR - RFLP ạn gen chứa ột biến của các bệnh nhân ...................................................................................................................................71 H nh 3 5 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen 3134-3331 trong hệ gen ty thể của các bệnh nhân. ...........................................................................................................73 H nh 3 6 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) của một số bệnh nhân nghi bị ột biến A3243G. ..........................................................................................73 H nh 3 7 iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi pUC19-Fw/pUC19-Rv (A) và cặp mồi MAG (B) của ột biến A3243G .................75 H nh 3 8 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) kiểm tra s n phẩm ............ biến nạp chứa ột biến A3243G t khuẩn lạc trắng..................................................75 ix
Hình 3.9. So sánh trình tự n id ạn gen 3134-3331 của ty thể bệnh nhân ...76 Hình 3.10. Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể chứa ột biến A3243G của ệnh nh n N4 ....................................................................................76 H nh 3 11 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen 8155-8366 trong hệ gen ty thể của các bệnh nhân ............................................................................................................77 H nh 3 12 iện di s n phẩ P R ư c cắt bằng BanII của một số bệnh nhân ......78 Hình 3.13. iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi ........... pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi MRAG (B).................................................79 Hình 3.14. So sánh trình tự n id ạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân (mẫu BN2, phụ lụ 2) nghi ang ột biến mấ ạn với trình tự gen chuẩn ...........80 Hình 3.15. Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (8155-8366)...........80 H nh 3 16 iện di s n phẩ P R ư c cắt bằng BanII của một số bệnh nhân ......81 Hình 3.17. So sánh trình tự n id ạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân ..... (mẫu BN22, phụ lụ 2) nghi ang ột biến với trình tự gen chuẩn .........................82 Hình 3.18. Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (8155-8366) chứa ột biến G8251A .............................................................................................................82 H nh 3 19 iện di s n phẩm PCR nhân nh n ạn gen 14601-14753 trong hệ gen ty thể của các bệnh nh n 83 H nh 3 20 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng DraI) của một số bệnh nhân nghi bị ột biến T14728C .........................................................................................83 H nh 3 21 iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi ETC-Fw/ETC-Rv (B) ................................84 Hình 3.22. So sánh trình tự nucleotid ạn gen 14601-14753 của ty thể bệnh nhân (mẫu BN7, phụ lụ 2) nghi ang ột biến T14728C với trình tự gen chuẩn ..85 Hình 3.23. Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (14601-14753) chứa ột biến T14727 ở ệnh nh n N7 ........................................................................85 Hình 3.24. Ph hệ các gia nh ang ột biến A3243G ...........................................89 H nh 3 25 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) ạn g n ang ột biến A3243G của h nh vi n ng gia nh ệnh nhân .......................................90 x
Hình 3.26. So sánh trình tự ạn gen chứa ột biến A3243G t các thành viên của gia nh N42 ( ) v gia nh N58 ( ) ..........................................................91 Hình 3.27. Biể ồ khuế h ại ằng a-i P R ạn gen ty thể ang ột biến 3243G ử dụng N h h nh vi n ủa 5 gia nh ệnh nh n v p a id ang ạn g n ở nồng ộ h nha ................................................................95 H nh 3 28 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng BanII) ạn g n ang ột biến mấ ạn của h nh vi n ng gia nh ệnh nh n ang ột biến ............102 Hình 3.29. So sánh trình tự ạn gen chứa mất ạn 9 bp t các thành viên của gia nh N15 .........................................................................................................102 Hình 3.30. Ph hệ của hai gia nh ệnh nh n ang ột biến T14727C ................105 H nh 3 31 iện di s n phẩm PCR-RFLP ạn g n ang ột biến T14727C của các h nh vi n ng hai gia nh ệnh nhân .................................................................106 Hình 3.32. So sánh trình tự ạn gen chứa ột biến T14727C t các thành viên của gia nh N7 ( ) v gia nh N50 ( ) ..........................................................107 Hình 3.33. Cấu trúc bậc 2 của RNA vận chuyển acid glutamic ở ty thể người và vị í ột biến T14727C . .............................................................................................108 xi
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ty hể bào quan ó ặ ng hầu hết ế nhân chuẩn với chứ năng chính là s n xuấ năng ư ng dưới dạng ATP cho tế bào. Ty thể tạo ra năng ư ng bằng cách oxy hóa các acid hữ ơ v a id é thông qua quá trình phosphoryl hóa oxy hóa x y ra bên trong ty thể. ATP là nguồn năng ư ng lớn ư c sử dụng cho tất c nh a ổi chất cần thiết bên trong tế bào. Ty thể có hệ gen riêng, có cấu trúc s i i, DNA mạch vòng với í h hước 16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide của chuỗi vận chuyển iện tử, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA) khác nhau liên quan ến hoạ ộng chứ năng ủa y hể. So với DNA của nhân tế bào thì DNA của ty thể dễ bị tổn hương d ty thể là một i ường giàu chất oxy ph n ứng và do thiếu ơ hế sửa chữa hiệu qu dẫn ến nhiề ột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể. Nă 1988, Wallace và tập thể ng ố ột biến iể ầu tiên trên hệ gen ty thể người gây bệnh i n an ến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (L ’ h di a y optic neuropathy - LHON). Sự mấ ạn N ũng ư c tìm thấy ở ơ ủa bệnh nhân liệ ơ ắt ngoài tiến triển mãn tính (chronic progressive external ophthalmoplegia - CPEO) và hội chứng Kearns-Sayre (KSS) ũng ư c phát hiện vào cùng nă 1988. h ến nay hơn 300 ột biến khác nhau trong hệ gen ty thể người ư x ịnh, trong ó ó hơn 200 ột biến có kh năng g y ệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau. Gần như ất c các tế ều dựa vào nguồn năng ư ng ổn ịnh do ty thể cung cấp, d ó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn a hệ thống nh hưởng ến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và tổ chức. Các bệnh do ột biến gen ty thể có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi với diễn biến khác nhau. Mứ ộ nghiêm trọng của bệnh ty thể ăng h ộ tuổi và tỷ lệ DNA ty thể (mtDNA) ột biến có mặt trong các mô bị ộng. Biểu hiện lâm sàng do các rối loạn ty thể thay ổi rất lớn, có thể i n an ến nhiề ơ an phức tạp hoặ ặ ưng h ng mô. Các triệu chứng lâm sàng hay thấy ở n ơ ắt và giác quan. Các triệu chứng ó 1
có thể kết h p với nhau trong các hội chứng riêng biệ như hội chứng KSS, hội chứng não giậ ơ è h i ơ ỏ xé rách (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres – MERRF), hội chứng não giậ ơ ăng a id a i v gi tai biến mạch (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes – MELAS) hoặc viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh (hội chứng Leigh). Tuy nhiên các triệu chứng ó ũng ó hể không nằm trong một bệnh c nh cụ thể nào, mộ v i ột biến thể hiện kiể h nh ương ự nhau làm cho việc chẩn n ệnh dựa trên lâm sàng trở nên rấ hó hăn. Vì vậy bệnh d ột biến gen ty thể hó ó ư c những chẩn n chính xác nếu chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng và các chỉ tiêu cận lâm sàng. Hiện nay, phân tích DNA là những phương ph p hiện ại nhất cho phép phát hiện nhanh v hính x ột biến gen gây bệnh. Nghiên cứ ột biến trong hệ gen ty thể cho phép phát hiện ra nguyên nhân của nhiều bệnh khác nhau. Hiện nay, trên thế giới ó nhiều công trình nghiên cứu về bệnh d ột biến gen ty thể. Tuy nhiên, do tính phức tạp ng ộng lâm sàng, mô bệnh học, ơ hế phát sinh và biểu hiện bệnh nên sự sai sót trong hệ gen ty thể ở nhiều bệnh nhân vẫn hưa ư c phát hiện v h ng ó phương ph p iều trị hiệu qu . Ở Việt Nam, bệnh d ột biến gen ty thể òn í ư c nghiên cứu, h ến nay chỉ mới có một vài công trình mang tính chất khởi ầu trong phát hiện bệnh ty thể ở mứ ộ gen và protein. ặc biệ hưa ó ng nh n i nghi n ứu mứ ộ h ng ồng nhất (heteroplasmy) của ột biến gen ty thể ũng như ự liên quan giữa mứ ộ h ng ồng nhất với triệu chứng lâm sàng của bệnh. ề tài luận án của húng i ư ặt ra với mục tiêu áp dụng và thiết lập phương ph p phân tích chính xác v x ịnh mứ ộ h ng ồng nhất một số ột biến gen ty thể ở các bệnh nh n người Việt Nam nhằm góp phần vào công tác khám và iều trị các bệnh do rối loạn hệ gen ty thể. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Xây dựng ư c cách thức phát hiện một số ột biến gen ty thể phổ biến và sàng lọc ột biến gen ty thể này ở bệnh nh n ơ n (encephalomyopathy). 2
- Thiết lập ư c phương ph p x ịnh mứ ộ h ng ồng nhấ của một loại ột biến gen ty thể (MELAS) ể ướ ầu tìm hiểu mối liên quan giữa ứ ộ h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Các bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể ến h v iều trị tại Bệnh viện Nhi T ng ương Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Thu thập mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA tổng số t các bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể ến h v iều trị tại Bệnh viện Nhi T ng ương - Thiết kế mồi ặc hiệu và lựa chọn enzyme giới hạn phù h p cho việc sàng lọc phát hiện ột biến gen ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP. - Xây dựng cách thức phát hiện một số ột biến gen ty thể phổ biến và áp dụng cách thức thiết lập ư c ể sàng lọ ột biến này ở người Việt Nam, nghiên cứ ột biến gen ty thể ở mứ ộ gia nh - ịnh ư ng số b n a ang ột biến bằng phương ph p a -time PCR sử dụng mẫu dò hu nh quang c i tiến, tìm hiểu sự liên quan giữa mứ ộ h ng ồng nhất và tình trạng bệnh lý của một loại ột biến gen ty thể. 4. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cứu của luận n ư c thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng iểm Công nghệ Enzy v P in T ường ại học Khoa học Tự nhi n ại học Quốc gia Hà Nội. 5. Đóng góp mới của đề tài - ã thiết lập ư c cách thức phát hiện 15 loại ột biến iểm trong hệ gen ty thể ở người Việt Nam bao gồm: các ột biến T3271C và T3291C (hội chứng MELAS); A8344G và T8356C (hội chứng MERRF); G11778A, G3460A và T14484C (hội chứng LHON); T8993G/C và T9176G (hội chứng Leigh), A1555G (hội chứng iếc) v ột biến G4298A, T10010C, T14727C, T14728C và T14709C (hội chứng ơ n nói h ng). 3
- Thiế ập ư phương ph p ph hiện v ịnh ư ng ứ ộ h ng ồng nhấ ủa ộ iến 3243G h ộ hội hứng MEL S v ướ ầ h hấy ối liên quan giữa mứ ộ h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý. - L ng nh ầu tiên phát hiện thấy ột biến mới T14727C trên gen MTTE mã hóa cho tRNAGlu ở bệnh nh n ơ n . 6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài Cách thức phát hiện các ột biến gen ty thể ư c tạo ra trong nghiên cứu này có thể dễ dàng phát triển h nh y nh ể áp dụng vào việc xét nghiệm bệnh do rối loạn ty thể ở các bệnh viện. 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CẤU TRÚC V CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢ I 1.1.1. Cấu trúc của ty thể Ty thể là bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật, bắ ầ ư c nghiên cứu t giữa thế kỷ XIX Nă 1857, nhà gi i phẫu họ người Thụy Sĩ K i ần ầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế ơ Hơn a ươi nă a (1890), nhà mô họ người ức, Richard Altmann, bằng phương ph p nh ộm fuchsine an sát ư c ty thể ở nhiều tế h nha dưới kính hiển vi quang học. Hình dạng ặ ưng ủa ty thể là thon dài với ường kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm (hình 1.1 A). Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào, ty thể có hình dạng v í h hước khác nhau (hình 1.1 B, C). Ty thể có kh năng hay ổi í h hước, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấ ú d i hơn h ặc phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn Ng i a, ty thể có kh năng di h yển ể ph n ứng với những hay ổi sinh lý trong tế bào [30]. Hình 1. 1. Các hình dạng khác nhau của ty thể [30] A: Dạng thon dài, B và C: Dạng biến ổi Trong tế bào, ty thể nằm r i rác ở nguyên sinh chấ nhưng ũng ó hể nằm tập trung ở khu vực cần nhiề năng ư ng như i ủa tinh trùng. Số ư ng của ty thể ở một tế ũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng ư ng của tế ó ó thể t vài ty thể ở tế da h ến vài nghìn ty thể ở tế ơ [30]. 5
Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong, ương ự như màng sinh chất. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, khoang giữa hai ng ư c gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn v chất nền tạo thành các ăng ư c [16, 38]. Hình 1. 2. Cấu trúc của ty thể [http://micro.magnet.fsu.edu/cells/mitochondria/mitochondria.html] Màng ngoài ty thể ó ộ d y 6 n ng ó p in hiếm kho ng 60% và lipid chiếm kho ng 40%. Màng có nhiều protein lỗ (porin), kênh ion cho phép các chất với khối ư ng phân tử lớn ến 10 kDa và các ion di chuyển tự do t ngoài nguyên sinh chấ v x ang gian ng v ngư c lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase [16]. Màng trong của ty thể ũng ng ip p in ó ộ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và mộ ư ng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ giữa cholesterol/phospholipid là 1/53. Màng trong ăn v hất nền tạo nên các ăng ư c. Cấ ú “ ” ăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và iề n y i n an ến chứ năng của nó là ăng ường vận chuyển iện tử và tổng h p ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ ộng ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+. M ng ng nơi ủa 5 phức h p thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển iện tử (phức h p I-IV), ATP synthase (phức h p V, còn gọi là F1F0- ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) [16, 38]. 6
Hình 1.3. Cấu trúc màng trong ty thể [73] Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) nơi trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ t chất nền i a d h ạ ộng của chuỗi vận chuyển iện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) là chấ ang iện tử ơ ộng cho chuỗi hô hấp, gi i phóng Cyt c v ương sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình tự chết của tế bào (apoptosis). Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể Như vậy, ở tế bào ộng vật, thực vậ v người ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể [16, 38]. Khi ạ í h hước lớn tối a y hể tiến h nh ph n i tạo ra hai ty thể mới. T ước tiên, hệ gen ty thể ư c sao chép ể ăng ố ư ng b n a Sa ó ng trong thắt lại rồi ến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra. Tuy nhiên, nhiều ty thể h ng ph n iv ị phân hủy ng yz h ơ hế tự tiêu (autophagy). ơ hế này giúp duy trì số ư ng ty thể ặ ưng ng ột tế bào [30]. 1.1.2. Chức năng của ty thể 1.1.2.1. y thể và qu tr nh trao đổi năng lượng trong tế ào Ty thể là bào quan s n xuấ năng ư ng cho tế bào bằng cách oxy hóa các h p chất hữ ơ tạo ra CO2, H2O và gi i phóng toàn bộ năng ư ng (hình 1.4). Các ph n ứng n y ư c xúc tác bởi các phức h p của chuỗi hô hấp I, II, III và IV nằm ở màng trong của ty thể [36, 61]. Nguồn tạ a năng ư ng trong ty thể là 7