Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:228

Thêm vào BST

Báo xấu

63
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59

viÖn HÀN LÂM khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam ViÖn c«ng nghÖ sinh häc VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hà Nội, năm 2019 i
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phí Quyết Tiến Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Chu Kỳ Sơn Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Hà Nội, năm 2019 ii
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phí Quyết Tiến, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS. TS. Chu Kỳ Sơn, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Vũ Thu Trang, TS. Khiếu Thị Nhàn Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ, hợp tác nghiên cứu đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Lê Gia Hy và các cán bộ phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm với tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cám ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt và các cán bộ phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ, hợp tác trong nghiên cứu và hỗ trợ các trang thiết bị kỹ thuật tốt nhất để tôi thực hiện thành công các nghiên cứu thực nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã luôn bên tôi, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên i
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên ii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................... xi MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 4 1.1. Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu ................... 4 1.1.1. Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh ..................................................... 4 1.1.2. Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật ..................................................... 6 1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược ............... 7 1.1.4. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu .................................................... 9 1.2. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu .............................................. 11 1.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật ............................................. 11 1.2.2. Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh ........................................................... 12 1.2.3. Đánh giá đa dạng sinh học của xạ khuẩn theo sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ...................................................................................................................... 15 1.3. Sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh và một số nghiên cứu về loài Streptomyces cavourensis ..................................................................... 17 1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu .................................. 17 1.3.2. Các gen mã hóa enzyme tham gia quá trình tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn .................................................................................................................. 19 1.3.3. Nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc kháng sinh ....................................... 24 1.3.4. Một số cấu trúc kháng sinh sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn ................................... 26 1.3.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh ................................ 27 iii
1.3.6. Một số nghiên cứu về xạ khuẩn Streptomyces cavourensis ............................... 30 1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh tại Việt Nam và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ...... 31 1.4.1. Tình hình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh ở Việt Nam ................................... 31 1.4.2. Đặc điểm của cây quế (Cinnamomum sp.)......................................................... 33 1.4.3. Tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum sp.) .......... 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 37 2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 37 2.1.1. Mẫu nghiên cứu, chủng giống vi sinh vật và các dòng tế bào ung thư .............. 37 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................ 37 2.1.3. Môi trường nuôi cấy........................................................................................... 38 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 38 2.2.1. Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu quế ............................. 38 2.2.2. Xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh .............. 40 2.2.3. Phân loại các chủng xạ khuẩn dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA ........ 42 2.2.4. Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ......................................................... 43 2.2.5. Tách chiết, giải trình tự và phân tích hệ gen của chủng xạ khuẩn YBQ59 ....... 44 2.2.6. Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp cho xạ khuẩn................. 46 2.2.7. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn ............................................................................................................. 47 2.2.8. Xử lý thống kê.................................................................................................... 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................... 48 3.1. Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) ......................................................................................... 48 3.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) ........................... 48 iv
3.2.1. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) .................. 49 3.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh ............ 55 3.2.3. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh......... 57 3.2.4. Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh ..................................................................................................................... 61 3.2.5. Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline ................................ 62 3.3. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 ........................................................ 63 3.3.1. Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59 ....................................... 64 3.3.2. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ...................................................................... 67 3.3.3. Lựa chọn môi trường thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ............................................................................................................... 70 3.3.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh kháng sinh ............. 71 3.3.5. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ........................................................................................... 73 3.3.6. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ........................................................................................... 75 3.3.7. Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của chủng S. cavourensis YBQ59 ............................................................................................................... 76 3.4. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S. cavourensis YBQ59 .......................................................................................... 78 3.3.1. Tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thứ cấp .................................................... 78 3.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách được từ chủng S. cavourensis YBQ59 ............................................................................................................... 83 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ......................................................................... 86 v
4.1. Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) ......................................................................................... 86 4.1.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) ................................. 86 4.1.2. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh ............................. 89 4.1.3. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh kháng sinh ................ 92 4.2. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ........................................................................... 93 4.2.1. Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59 ....................................... 93 4.2.2. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ...................................................................... 94 4.2.3. Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ........................................................................................... 96 4.3. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S. cavourensis YBQ59 ........................................................................................ 102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 114 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ ...................................... 116 LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ........................................................................................ 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 125 vi
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về đa dạng sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu ............................................... 13 Bảng 1.2. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu ................................................................................................................. 16 Bảng 1.3. Các chất chuyển hóa được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn được sử dụng trong y học với các cơ chế sinh tổng hợp ...................................................... 22 Bảng 3.1. Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 297 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế ............................................................... 56 Bảng 3.2. Kết quả phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA ..... 58 Bảng 3.3. Sự phân bố của các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế ................ 60 Bảng 3.4. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 với các chủng S. cavourensis với các chủng tham chiếu ............................... 65 Bảng 3.5. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của chủng S. cavourensis YBQ59 ............... 66 Bảng 3.6. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chủng S. cavourensis YBQ59 .... 76 Bảng 3.7. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của từ dịch lên men của chủng YBQ59 ........................................................................................................... 77 Bảng 3.8. Tổng hợp các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng S. cavourensis YBQ59 ... 80 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn các hợp chất tinh sạch từ chủng S. cavourensis YBQ59 ........................................................................................................... 84 Bảng 3.10. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các chất tách được từ chủng S. cavourensis YBQ59 (IC50, μM) ...................................................... 85 vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S. galbus MBR-5 trên lá đỗ quyên sau 60 ngày quan sát ........................................................................ 6 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh (1-6) ............. 18 Hình 1.3. Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn polyketide bởi synthase gồm bốn mô đun riêng biệt. A. synthase bao gồm một protein đa mô đun đơn được mã hóa bởi một gen duy nhất chứa bốn mô đun enzyme, đặc trưng của loại PKS- I. B. Mỗi mô đun có mặt trên một protein của loại PKS-II. .......................... 21 Hình 1.4. Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn peptide gồm 4 mô đun và được mã hóa bởi hai gen khác nhau. Sản phẩm tạo ra là tetrapeptide....................................... 22 Hình 1.5. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline DOX, DNR, EPI và IDA ............................................................................... 27 Hình 1.6. Một số bộ phận của cây quế đơn (C. cassia Presl)......................................... 33 Hình 3.1. Khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) tại Hòa Bình (A), Lai Châu (B) và Yên Bái (C) phân lập trên một số môi trường đặc hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy ........................................................... 49 Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây quế (C. cassia Presl): số liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) .......................................................................................................... 50 Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các môi trường phân lập khác nhau: số liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) .................................................................................................................. 51 Hình 3.4. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh theo nhóm mầu khuẩn ty: số liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) .......................... 53 Hình 3.5. Đa dạng di truyền của 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa trên phân tích đa hình sản phẩm phản ứng BOX-PCR. Giếng M: Thang DNA chuẩn (100 viii
bp); Giếng 1÷16 lần lượt là: HBQ7; HBQ8; HBQ9; HBQ10; HBQ11; HBQ16; HBQ19; HBQ33; HBQ40; HBQ43; HBQ46; HBQ47; HBQ49; HBQ55; HBQ56; HBQ62. ............................................................................. 54 Hình 3.6. Hoạt tính kháng C. albicans ATCC 10231 (A), P. vulgaris (B), P. aeruginosa (C), S. epidermidis kháng methicillin (D) tại Hòa Bình; hoạt tính kháng S. Typhimurium (E), S. epidermidis kháng methicillin (F) tại Lai Châu. P. vulgaris (G), S. epidermidis kháng methicillin (H) tại Yên Bái .................................................................................................................. 55 Hình 3.7. Số lượng xạ khuẩn kháng vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ, thân, lá trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái................................... 57 Hình 3.8. Số liệu thống kê khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của 96 chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái ....... 62 Hình 3.9. Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng xạ khuẩn. A: bổ sung acid; B: bổ sung kiềm............................................................................ 63 Hình 3.10. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng tuyển chọn ở Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái ............................................................................ 64 Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trường ISP2 và hình ảnh chuỗi bào tử và bề mặt chuỗi bào tử của chủng YBQ59 được quan sát dưới kính kiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 3000 X (B) và 20.000 X (C) ......... 65 Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại dựa trên quan hệ di truyền giữa các trình tự gen 16S rRNA của chủng S. cavourensis YBQ59 và các chủng xạ khuẩn đại diện. Bootstrap = 1000 lần lặp; Bar = 0,02 đại diện cho sự thay thế cho mỗi nucleotide. ........................................................................................ 67 Hình 3.13. Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp kháng ung thư bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1) (A) và kháng sinh macrotetrolide (ctg1114_1) (B) ..................................................................... 69 ix
Hình 3.14. Hoạt tính kháng S. Typhimurium ATCC 14028 và MRSE ATCC 35984 của chủng S. cavourensis YBQ59 trên các môi trường lên men khác nhau.. 71 Hình 3.15. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tính kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ....................................................................................... 72 Hình 3.16. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ....................................................................................... 72 Hình 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 ................................................................. 73 Hình 3.18. Ảnh hưởng của độ thông khí bề mặt (A) và tỷ lệ tiếp giống (B) đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 .............................. 74 Hình 3.19. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59. ...................................................................................... 75 Hình 3.20. Sơ đồ phân lập và tinh chế các chất sạch từ chủng S. cavourensis YBQ59 ........................................................................................................... 78 Hình 4.1. Cấu trúc hợp chất M2B5.1: 1-monolinolein (1) (C21H38O4) ........................ 103 Hình 4.2. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất M2B5.0: bafilomycin D (2) (C35H56O8) ............................................................................................. 105 Hình 4.3. Cấu trúc hợp chất M2B9.8: nonactic acid (3) (C10H18O4) ........................... 106 Hình 4.4. Cấu trúc hợp chất M2B8.3: 4’,7-dihydroxyisoflavone (daidzein (4)) (C15H10O4) .................................................................................................... 107 Hình 4.5. Cấu trúc hợp chất M2B7.5: 3'-hydroxydaidzein (5) (3',4',7- trihydroxyisoflavone) (C15H10O5) ................................................................ 107 Hình 4. 6. Cấu trúc hợp chất M2B3.8: 5,11-Epoxy-10-cadinanol (6) (C15H26O2)....... 108 Hình 4.7. Cấu trúc hợp chất M2B4.3: prelactone B (7) (C9H16O3).............................. 109 Hình 4.8. Cấu trúc hợp chất M2B6.17: daucosterol (8) (C35H60O6) ............................ 110 x
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích 26-L5 Ung thư ruột kết ở người A Vùng adenyl hóa A549 Tế bào ung thư phổi ở người ACP Acyl carrier protein AL Acyl-CoA ligas AntiSMASH Antibiotics and secondary metabolite analysis shell AT Acyl transferase Cụm gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp (biosynthetic BGC gene clusters) C Vùng ngưng tụ 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc CKS Chất kháng sinh d Đường kính lỗ thạch D Đường kính vòng vô khuẩn DH Dehydratase DCW Khối lượng tế bào khô Detortionless enhancement by polarization transfer (Phổ DEPT DEPT) DH Dehydratase DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid xi
DO Lượng oxy hòa tan DOX Doxorubicin DNR Daunorubicin E Vùng epime hóa EPI Epirubicin ER Enoulreductase ESI-MS Khối phổ lượng ion hóa phun mù điện tử FT-IR Phổ hồng ngoại Fourtier GC-MS Sắc ký khí-khối phổ GISA Glycopeptides intermediate và Staphylococcus aureus GO Dữ liệu gene ontology 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HepG2 Tế bào ung thư gan ở người Hep3B Tế bào ung thư gan ở người HGT Chuyển gen ngang (Horizontal gene transfer ) HMBC Heteronuclear multiple bond correlation (Phổ HMBC) HMEC Ung thư vú ở người HSQC Heteronuclear single quantum coherence (Phổ HMQC) IAA Indole-3-acetic acid IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm IDA Idarubicin IPH Isatin-3-phenylhydrazone IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) ISC Isatin-3-semicarbazone xii
ISP Chương trình xạ khuẩn quốc tế ITC Isatin-3-thiosemicarbazone kb Kilo base KB Ung thư cổ tử cung ở người GEGG Kyoto encyclopedia of genes and genomes KR Ketoreductase KS Ketosynthase KTKS Khuẩn ty khí sinh KTCC Khuẩn ty cơ chất LC50 Liều gây chết 50% LLC Tế bào ung thư phổi Lewis M Methyl hóa MCF7 Tế bào ung thư vú ở người Mb Mega base MDA-MB-435 Tế bào ung thư tuyến vú ác tính ở người ME-180 Tế bào ung thư cổ tử cung MIC Nồng độ ức chết tối thiểu (Minimum inhibitory concentration) MS Khối phổ MRSA Staphylococcus aureus kháng methicillin MRSE Staphylococcus epidermidis kháng methicillin MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide N50 Đánh giá chất lượng lắp ráp NCBI Ngân hàng cơ sở dữ liệu NR Cơ sở non-redundant xiii
NRPS Nonribosomal peptide synthetase NRPs nonribosomal peptide OD Mật độ quang Ox Oxy hóa P388 Ung thư bạch cầu PCP Peptidyl carrier protein PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) PGAP Prokaryotic genome annotation pipeline PK Polyketide PKS Polyketide synthase PKS-I Polyketide synthase type I PKS-II Polyketide synthase type II RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SEM Kính hiển vi điện tử quét SK-BR-3 Tế bào ung thư vú ở người SK-LU-1 Tế bào ung thư phổi ở người SKK Sinh khối khô TE Thioesterase TLC Sắc ký lớp mỏng XKNS Xạ khuẩn nội sinh VSV Vi sinh vật VVK Vòng vô khuẩn VRE Enterococcus faecalis kháng vancomycin xiv
1 MỞ ĐẦU Một trong những thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và kháng vi sinh vật (VSV). Cho đến nay, sử dụng kháng sinh là phương thức quan trọng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV gây ra. Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc kháng sinh đã trở thành yếu tố chính dẫn tới xuất hiện các chủng VSV gây bệnh kháng đa thuốc (Singh, 2012). Theo Demain và Sanchez (2009), VSV đã và đang thay đổi tính kháng với các thuốc kháng sinh hiện đang sử dụng trong điều trị nhờ xuất hiện các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền. Vì vậy, hướng nghiên cứu và phát triển các tác nhân kháng khuẩn mới là ưu tiên của nhiều nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới (Alekshun, 2007). Bên cạnh điều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV, việc tìm kiếm và phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học như có hoạt tính kháng tế bào ung thư, kháng viêm cũng là những vấn đề mang tính toàn cầu. Trong khoảng 20 năm gần đây, nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh (XKNS) trên cây dược liệu đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học, công ty dược phẩm do XKNS cho thấy tiềm năng lớn sinh tổng hợp các chất kháng sinh, kháng u, chất kích thích tăng trưởng thực vật, các loại enzym và chính XKNS cũng có thể góp phần tăng cường sức sống của cây chủ cũng như mang lại những tính chất dược lý cho cây dược liệu. Theo Bérdy (2012), khoảng 70% chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong lâm sàng được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Trong số 33.500 hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ VSV, xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces đóng vai trò quan trọng và cho thấy đã sinh tổng hợp 10.400 hợp chất. Vì vậy, sự đa dạng của xạ khuẩn trong tự nhiên nói chung và XKNS nói riêng rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Ngoài ra, nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn được sinh tổng hợp bởi các enzyme polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) nên việc nghiên cứu những gen pks, nrps liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp
2 rất hữu ích trong việc đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ xạ khuẩn (Ayuso và cs., 2005). Cho đến nay, rất ít nghiên cứu về tài nguyên XKNS trên cây dược liệu Việt Nam được công bố và cần được nghiên cứu nhằm bảo tồn, lưu giữ và khai thác nguồn gen VSV bản địa. Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu của cây quế (Cinnamomum sp.) đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư (Singh và cs., 1995; Tariq và cs., 2006) nhưng các nghiên cứu về XKNS trên cây quế chưa được công bố nhiều. Trong nghiên cứu này, các XKNS được phân lập trên các môi trường chọn lọc và đa dạng sinh học của XKNS được đánh giá qua đặc điểm sinh học, phân bố, khả năng sinh kháng sinh và đặc điểm di truyền. Các chủng XKNS có hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế bào ung thư phổi, mang các gen chức năng pks-I, pks-II, nrps được sàng lọc. Từ đó, nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp và tách chiết, tinh sạch các hợp chất và giải trình tự, lắp ráp de novo, dự đoán và chú giải hệ gen của XKNS được tuyển chọn để tìm kiếm thông tin về những gen liên quan đến quá trình tổng hợp kháng sinh. Từ những lý do trên nghiên cứu sinh thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59” MỤC TIÊU Đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59.
3 NỘI DUNG 1. Phân lập và nghiên cứu sự đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) tại các điểm thuộc tỉnh Hòa Bình, Yên Bái và Lai Châu. 2. Tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh hoạt tính cao và xác định một số gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn. 3. Nghiên cứu đặc điểm di truyền, lên men, tách chiết và xác định một số cấu trúc kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CHO LUẬN ÁN - Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống về đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) tại miền Bắc Việt Nam. - Sàng lọc được chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ rộng và phân lập được 8 hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2), nonactic acid (3), daidzein (4), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol (6), prelactone B (7), daucosterol (8), trong đó các hợp chất 1, 3-8 được phát hiện lần đầu từ loài S. cavourensis và hợp chất 1, 2 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng kháng sinh cao (MIC50 8,5-30,3 µg/ml) và ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư A549, MCF, Hep3B (IC50 3,6-24,7 µM).
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu 1.1.1. Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh Thuật ngữ nội sinh “endophytic” lần đầu tiên được định nghĩa bởi de Bary năm 1866, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sự khác biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật” (de Bary, 1866). Khái niệm khác về XKNS được đưa ra khi Smith (1957) phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh. Tuy nhiên, định nghĩa được các nhà VSV học thừa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000) “VSV nội sinh là VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ”; VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, chống côn trùng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất... (Staniek và cs., 2008; Nalini và Prakash, 2017). Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng nấm, ức chế phát triển tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng... (Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011; Kaishing và cs., 2018). Nấm, vi khuẩn và XKNS đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học như alkaloid, steroid, terpenoid, peptide, polyketone, flavonoid, quinol, phenol và thuốc trừ sâu tự nhiên azadirachtin cũng được sản xuất bởi VSV nội sinh hiện đang được ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y dược (Li và cs., 2008; Molina và cs., 2012; Golinska và cs., 2015; Ganapathy và Natesan, 2018; Singh và Dubey, 2018). Vi khuẩn: hơn 200 chi từ 16 ngành vi khuẩn đã được công bố là nội sinh trong thực vật, phần lớn các loài thuộc ngành Actinobacteria, Proteobacteria và