Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:182

Thêm vào BST

Báo xấu

52
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án trình bày các nội dung chính sau: Lựa chọn gen mã hóa kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1; Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hóa kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá; Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hóa và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp; Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Vân NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Vân NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Vũ Huyền Trang 2. GS. TS. Lê Thanh Hoà Hà Nội – 2021
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo, TS. Vũ Huyền Trang và GS.TS. Lê Thanh Hoà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, PGS. TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Hồ Thị Thương, ThS. Nguyễn Thu Giang, KTV. Trần Thị Loan cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, phòng công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, hỗ trợ kinh phí, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Udo Conrad, TS. Phan Trọng Hoàng, Viện nghiên cứu di truyền và cây trồng thực vật (IPK) CHLB Đức đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện IPK cũng như trong thời gian tôi học tập tại Việt Nam. Tôi xin cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Xuân Hạnh Công ty CP thuốc thú y Ttrung ương NAVETCO đã giúp đỡ tôi thực hiện thành công các thí nghiệm công cường độc trên gà. Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam với đề tài Nghị định thư mã số NĐT.07.GER.15 và Bộ giáo dục và nghiên cứu CHLB Đức với đề tài “Plantfluvac” mã số 031A283 đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện các nghiên cứu trong luận án này. Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án. Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Vân
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Vân
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ i LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. ii MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................. viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của luận án ...................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án ........................................................................... 2 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án ......................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 4 1.1. Virus cúm A/H5N1 ................................................................................................... 4 1.1.1. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1 ...................................................... 4 1.1.2. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A ...................................................... 6 1.1.3. Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin .................................................. 8 1.1.4. Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1 ........ 13 1.2. Bệnh cúm gia cầm .................................................................................................. 16 1.2.1. Lịch sử và tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới ........................................ 16 1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam......................................................... 17 1.3. Vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm ................................................................. 22 1.3.1. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm trên thế giới ................................................. 23 1.3.2. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam................................................ 24 1.3.3. Nghiên cứu vaccine cúm phổ rộng .................................................................... 27 1.3.4. Nghiên cứu vaccine từ thực vật ......................................................................... 29 1.3.5. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA ELP hoá ........................................................ 33 1.3.6. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA oligomer hoá ................................................. 34 1.4. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp tạm thời ở thực vật thông qua Agrobacterium (agroinfiltration) .......................................................................... 36 1.4.1. Nguyên lý ........................................................................................................... 36 1.4.2. Ứng dụng agroinfiltration trong nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học trên thế giới ......................................................................................... 37 1.4.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thông qua agroinfiltration ở Việt Nam ............................................................................... 40 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 44 2.1. Vật liệu .................................................................................................................... 44 2.1.1. Nguồn vật liệu thực vật ...................................................................................... 44
iv 2.1.2. Chủng vi sinh vật, plasmid, trình tự gen ............................................................ 44 2.1.3. Các cặp mồi sử dụng .......................................................................................... 45 2.1.4. Nguồn vật liệu động vật ..................................................................................... 45 2.1.5. Hóa chất ............................................................................................................. 45 2.1.6. Thiết bị ............................................................................................................... 45 2.1.7. Môi trường và đệm ............................................................................................ 46 2.2. Phương pháp........................................................................................................... 46 2.2.1. Phương pháp lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1 ..................................................................................................... 46 2.2.2. Phương pháp sử dụng trong thiết kế cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá ............................ 48 2.2.3. Phương pháp tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp ........................................... 55 2.2.4. Phương pháp đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm ............................................................. 57 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................. 62 3.1. Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1….. ............................................................................................................. 62 3.1.1. Thu thập và phân loại trình tự HA theo từng năm ............................................. 62 3.1.2. Phân tích đổi mã gen và tổng hợp nhân tạo chuỗi gen mã hóa kháng nguyên HA của chủng virus cúm A/H5N1 trên cơ sở những trình tự đã biến đổi ......... 63 3.1.3. Thiết kế trình tự HA COBRA đại diện các chủng virus cúm A/H5N1 quan tâm ..................................................................................................................... 67 3.1.4. Chuyển đổi các trình tự amino acid của kháng nguyên HACOBRA1 và HACOBRA2 thành các trình tự nucleotide ....................................................... 71 3.1.5. Phân tích và so sánh trình tự của các protein HA lựa chọn trong nghiên cứu… ................................................................................................................. 72 3.2. Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá ............................................................................. 74 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer .......................................... 76 3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP .............................. 79 3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer TP ................................ 82 3.2.4. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện kháng nguyên HA trên cây thuốc lá .............................................................................................................. 84 3.2.5. Đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên HA tái tổ hợp trong dịch chiết thô thuốc lá .............................................................................................................. 91 3.2.6. Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA trong dịch chiết thô lá thuốc lá ........................................................................................... 92 3.3. Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp ............................................................ 94
v 3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá bằng mITC .......... 94 3.3.2. Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP bằng IMAC ..................... 98 3.3.3. Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA sau tinh sạch ................................................................................. 100 3.4. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm ............................................................................. 103 3.4.1. Miễn dịch trên chuột thí nghiệm ...................................................................... 103 3.4.2. Miễn dịch trên gà thí nghiệm ........................................................................... 110 Chương 4. THẢO LUẬN ................................................................................................ 122 4.1. Lựa chọn gen HA là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam ................................. 122 4.2. HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường sự biểu hiện protein trong thực vật, đơn giản hoá trong tinh sạch nhưng không làm tăng cường hoạt tính sinh học của HA trimer ....................................................................................... 125 4.3. HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hoà phổ rộng trên động vật thí nghiệm ...................................................................................................... 127 4.4. HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật ............................ 128 4.5. Dịch chiết thô thuốc lá chứa kháng nguyên HA oligomer TP có thể sử dụng làm ứng viên vaccine phòng bệnh cúm A trên động vật .................................. 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 131 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................... 132 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .............................................................. 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 134 PHỤ LỤC............................................................................................................................ P1
vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp base pair BS3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA ethylene diamine tetra-acetate acid ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ELP elastin-like polypeptides EtBr ethidium bromide FAO The Food and Agriculture Organization HA Hemagglutinin HI hemagglutinin inhibition IMAC Immobilized metal ion chromatography kb kilobase kDa kilodalton LB Luria and Bertani mITC membrane-based inverse transition cycling OD optical density OIE The World Organisation for Animal Health PCR polymerase chain reaction SDS sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEC size exclusion chromatography TAE tris acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase v/p vòng/phút WHO World Health Organization
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các gốc amino acid ở các vị trí điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể, vị trí liên kết thụ thể, vị trí epitope và một vị trí glycosyl hoá bị biến đổi của các H5 từ một số chủng virus A/H5N1 khác nhau ............. 11 Bảng 1.2. Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phát triển vaccine ................... 23 Bảng 1.3. Các protein có hoạt tính sinh học, kháng thể và vaccine được sản xuất từ thực vật đang trong thử nghiệm lâm sàng hoặc có mặt trên thị trường ...................................................................................................... 30 Bảng 2.1. Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu................................................ 45 Bảng 3.1. Số lượng trình tự gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm ở Việt Nam ......................................................................... 63 Bảng 3.2. Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 1.1; 1.1.1 và 1.1.2 .................................................................................... 68 Bảng 3.3. Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 2.3.2.1, 2.3.2.1a, b và c ........................................................................... 69 Bảng 3.4. Danh sách các cấu trúc vector thiết kế chứa HA tự nhiên và nhân tạo .... 75 Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi các kháng nguyên HA oligomer ELP .......................... 98 Bảng 3.6. Bảng tổng hợp kết quả thiết kế, biểu hiện và đánh giá hoạt tính của các kháng nguyên HA tái tổ hợp ........................................................... 120 Bảng 4.1. Trình tự amino acid tại các vị trí phân cắt protein, liên kết thụ thể epitope kháng nguyên và vị trí glycosyl của các protein HA ............... 124
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8]. ........................................................... 5 Hình 1.2. Mô hình cấu trúc hemagglutinin xuyên lớp màng bao lipid kép .............. 10 Hình 1.3. Dòng thời gian xuất hiện các clade của A/H5N1 dựa vào trình tự của gen HA ở Việt Nam [1]........................................................................... 18 Hình 1.4. Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2006 đến 2014 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE .......................................................... 19 Hình 1.5. Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2015 đến 2017 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE .......................................................... 20 Hình 1.6. Bản đồ các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra ở các năm 2018 đến 11/09/2020 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE ................................................... 21 Hình 1.7. Sơ đồ dạng lục thể IgM (A) và dạng đơn tiểu đơn vị (B) ........................ 35 Hình 1.8. Quy mô thương mại N. benthamiana tăng trưởng (A) và khử trùng (B) ........................................................................................................... 39 Hình 1.9. Quy trình sản xuất virus cúm mùa tại công ty Medicago, Canada ........... 40 Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các bước thí nghiệm cơ bản trong nghiên cứu ..................... 46 Hình 2.2. Hình ảnh cây thuốc lá thuỷ canh 5 tuần tuổi (A) được loại bỏ bớt lá già, lá non và lá bánh tẻ trước khi biến nạp (B) ...................................... 52 Hình 2.3. Biến nạp dịch khuẩn vào lá thuốc lá bằng máy hút chân không .............. 52 Hình 3.1. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của protein H5TG chủng A/duck/Vietnam/TG24-O1/05 đã được tối ưu trong biểu hiện thuốc lá so với trình tự gốc ............................................................................... 66 Hình 3.2. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của protein H5HT chủng A/duck/Vietnam/HT-O2/2014 đã được tối ưu trong biểu hiện thuốc lá so với trình tự gốc ............................................................................... 67 Hình 3.3. Mô hình thiết kế các trình tự HA COBRA (A) và hình ảnh xây dựng cây phân loại dựa vào các trình tự của kháng nguyên HA tự nhiên và nhân tạo ................................................................................................... 71 Hình 3.4. Hình ảnh biểu diễn và so sánh trình tự amino acid của 4 kháng nguyên HA tự nhiên và HA nhân tạo .................................................................. 73 Hình 3.5. Các loại cassette biểu hiện kháng nguyên HA trong thực vật .................. 75 Hình 3.6. Mô hình thiết kế vector biểu hiện protein H5TG trimer ở thực vật ......... 76 Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen H5TG (A) và sản phẩm cắt vector tách dòng pRTRA_H5TG trimer bởi enzyme BamHI và PspOMI (B) ........................................................................... 77 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế cấu trúc vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer................................................................. 78 viii
ix Hình 3.9. Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer ................................... 78 Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế vector tách dòng gen mã hóa kháng nguyên HA oligomer ELP ........................................ 79 Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế cấu trúc vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP .................................................... 80 Hình 3.12. Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP .................... 81 Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HACOBRA1 oligomer TP .............................................. 82 Hình 3.14. Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP .................... 83 Hình 3.15. Kết quả gieo và nhân nhanh cây thuốc lá N. benthamiana in vitro từ hạt............................................................................................................ 84 Hình 3.16. Hình ảnh cây thuốc lá trồng thuỷ canh ................................................... 85 Hình 3.17. Hình ảnh thuốc lá sau 5 ngày biến nạp tạm thời. A–D là cây thuốc lá được sử dụng cho biến nạp ở 3, 4, 5 và 6 tuần tuổi ................................ 86 Hình 3.18. Phân tích sự biểu hiện của kháng nguyên HA trên lá thuốc lá bằng SDS-PAGE và Western blot ................................................................... 86 Hình 3.19. Phân tích sự biểu hiện của HApII theo các mật độ OD600 biến nạp khác nhau ................................................................................................ 87 Hình 3.20. Lựa chọn thời gian biến nạp ................................................................... 88 Hình 3.21. Mức độ biểu hiện của protein HApII sau các ngày biến nạp. ................ 89 Hình 3.22. Quy trình biểu hiện kháng nguyên HA của A/H5N1 tái tổ hợp trong cây thuốc lá trồng thuỷ canh ................................................................... 90 Hình 3.23. Mức độ biểu hiện của các kháng nguyên HA trên thuốc lá.................... 91 Hình 3.24. Hàm lượng kháng nguyên HA tái tổ hợp biểu hiện trong lá thuốc lá .... 92 Hình 3.25. Phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu của các kháng nguyên HA trong dịch chiết thô thuốc lá ............................................................................. 93 Hình 3.26. Quy trình tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP tái tổ hợp trong cây thuốc lá ............................................................................................. 94 Hình 3.27. Kết quả ly tâm loại bỏ tạp chất sử dụng PEG 8000 ở các nồng độ khác nhau ................................................................................................ 95 Hình 3.28. Kết quả phân tích protein trong dịch nổi bằng lai miễn dịch (A) và nhuộm Coomassie Brilliant Blue (B). ..................................................... 96 Hình 3.29. Cải tiến quá trình tinh sạch mITC bởi PEG. .......................................... 96 Hình 3.30. mITC dựa vào PEG để tinh sạch các protein HA oligomer ELP ........... 97 Hình 3.31. Tinh sạch H5TG trimer và oligomer TP bằng IMAC ............................ 99 Hình 3.32. Tinh sạch HACOBRA1 trimer bằng IMAC. .......................................... 99 Hình 3.33. Đặc điểm cấu trúc và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên H5TG tinh sạch ........................................................................ 100 ix
x Hình 3.34. Hoạt tính ngưng kết hồng cầu (A) và trạng thái oligomer hoá (B, C, D) của các kháng nguyên HACOBRA1, H5TG và H5HT tinh sạch .... 101 Hình 3.35. Đặc điểm cấu trúc của các kháng nguyên H5TG trimer và HACOBRA1 trimer tinh sạch bởi SEC ................................................ 102 Hình 3.36. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột thí nghiệm ............................ 103 Hình 3.37. ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu HA trong huyết thanh chuột ở độ pha loãng huyết thanh 16 x 10-3 ................................ 104 Hình 3.38. Phân tích Western blot (A) và ELISA (B) phát hiện kháng thể đặc hiệu IgG đặc hiệu kháng nguyên H5TG trimer và HACOBRA1 trimer trên chuột thí nghiệm ................................................................. 105 Hình 3.39. ELISA gián tiếp xác định điểm end-point của kháng thể chuột được gây miễn dịch với H5TG trimer và HACOBRA1 trimer...................... 107 Hình 3.40. Hiệu giá HI chống lại kháng nguyên HACOBRA1 trimer và H5TG trimer đồng gen và dị chủng ................................................................. 108 Hình 3.41. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên gà thí nghiệm ................................. 110 Hình 3.42. Phân tích Western blot (A) và ELISA (B) của huyết thanh gà phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu H5TG sau tiêm kháng nguyên lần 1 và lần 2 ....................................................................................................... 112 Hình 3.43. Phân tích HI của huyết thanh gà để phát hiện kháng thể trung hoà virus clade 1.1 sau công cường độc ...................................................... 113 Hình 3.44. Tỷ lệ gà sống sót sau công cường độc với chủng A/duck/TG/NAVET (3)/2013. ................................................................................................ 114 Hình 3.45. Phân tích Western blot (A) và ELISA (B) của huyết thanh gà phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu H5HT sau tiêm kháng nguyên lần 1 và lần 2. ...................................................................................................... 116 Hình 3.46. Phân tích HI của huyết thanh gà để phát hiện kháng thể trung hoà virus clade 2.3.2.1c trước và sau công cường độc. ............................... 117 Hình 3.47. Tỷ lệ gà sống sót sau công cường độc với chủng A/Chicken/DL/NAVET_0292/2013(H5N1) clade 2.3.2.1c ................. 118 Hình 3.48. Hiệu giá HI và tỷ lệ sống sót của gà sau công cường độc dịch chiết thô H5HT oligomer và trimer ............................................................... 119 Hình 4.1. Cấu trúc của các protein HA nhân tạo và tự nhiên được mô phỏng bởi RaptorX ................................................................................................. 123 Hình 4.2. Sự hình thành dạng HA oligomer trong tế bào thực vật......................... 128 x
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Cúm gia cầm thể độc lực cao (highly pathogenic avian influenza, HPAI) do virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh. Dịch cúm gia cầm liên tục tái phát hàng năm với tốc độ lây lan nhanh và diễn biến phức tạp. Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 có thể xâm nhiễm gây bệnh ở người với tỉ lệ tử vong rất cao và đang trở thành mối đe dọa nguy hiểm cho sức khoẻ cộng đồng. Vaccine là một biện pháp hiệu quả bảo vệ sức khoẻ người và vật nuôi chống lại virus cúm gia cầm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tiến hoá của virus cúm gia cầm A/H5N1, trong đó đáng chú ý là sự biến đổi của gen mã khoá kháng nguyên bề mặt hemagglutinin (HA) - một trong hai kháng nguyên đích của virus cúm A/H5N1 được sử dụng cho phát triển vaccine, có thể làm thay đổi tính kháng nguyên dẫn đến ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vaccine. Tại Việt Nam, bệnh cúm gia cầm A/H5N1 khởi phát và gây dịch cho đàn gia cầm vào năm 2003, chủ yếu thuộc clade 1 và 2. Các clade này tiếp tục tiến hoá và phân nhánh nhỏ hơn như clade 1.1, 1.1.1, 1.1.2, 2.3.1, 2.3.2, 2.3.4… [1]. Clade 2.3.2 phân bố phổ biến tại Việt Nam trong giai đoạn 2009–2014 và sau đó biến đổi tiếp để tạo thành các phân nhánh nhỏ hơn, phổ biến như clade 2.3.2.1a/b/c. Từ 2014–2017, clade 2.3.2.1c và 2.3.4.4 chiếm ưu thế và thể hiện sự tiến hóa dựa vào địa lý một cách khác biệt. Các virus clade 2.3.2.1c phát hiện ở các vùng phía Bắc, Trung và Nam, trong khi các virus clade 2.3.4.4 chỉ được phát hiện ở các vùng Bắc và Trung tạo thành các nhóm nhỏ. Những virus này đã trải qua sự tái tổ hợp đa dạng với sự tồn tại của ít nhất 12 kiểu gen và giữ lại các motif đặc trưng điển hình [2]. Sự tiến hoá phức tạp này của virus cúm gia cầm A/H5N1 đã làm cho vaccine hiện có trở nên kém hiệu lực, công tác phòng chống dịch bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam ngày càng khó khăn, dịch bệnh tái bùng phát dễ dàng. Tính từ 2003 đến nay, Việt Nam là nước được ghi nhận có số ổ dịch cao nhất trên thế giới. Do đó, nếu chúng ta có thể chủ động được nguồn vaccine
2 cập nhật nhất cũng như có tính bảo hộ phổ rộng và lâu dài sẽ giúp giảm chi phí cho sản xuất, kinh doanh và chủ động đáp ứng nhanh nhu cầu khi có các biến chủng virus mới xuất hiện tại Việt Nam. Trước vấn đề cấp thiết đó đòi hỏi quá trình nghiên cứu và sản xuất vaccine cần được rút ngắn, tăng quy mô sản xuất, giảm công sức và chi phí để cung cấp kịp thời một lượng lớn vaccine cúm trên diện rộng. Mô hình sản xuất kháng nguyên HA tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltration) đang được xem là một giải pháp hữu hiệu, đơn giản, an toàn và có thể cho phép sản xuất vaccine với số lượng lớn và nhanh chóng (1–2 tháng) đáp ứng kịp thời khi dịch bệnh xảy ra. Mô hình này đã được nhóm nghiên cứu của TS. Phan Trọng Hoàng và cộng sự tại Viện nghiên cứu di truyền và cây trồng thực vật CHLB Đức nghiên cứu với nhiều thành công trong việc tạo ra các kháng nguyên HA dạng monomer và trimer có và không có ELP hoá hay các dạng HA oligomer. Dạng trimer của HA đã được chứng minh là giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch hơn so với dạng HA monomer. HA trimer đã tạo ra các kháng thể trung hòa có khả năng tương tác với cả các hạt có cấu trúc giống virus đồng dạng từ thực vật và virus cúm A/H5N1 dị chủng đã bị bất hoạt. Đáng chú ý, việc dung hợp ELP vào kháng nguyên HA trimer không ảnh hưởng tới quá trình trimer hóa hay tính sinh miễn dịch của HA, nó làm tăng cường mức độ biểu hiện mạnh mẽ của protein HA trimer được ELP hóa. Đặc biệt, các HA trimer ELP hóa có thể được tinh sạch dễ dàng bằng quy trình mITC với tiềm năng có thể mở rộng quy mô sản xuất [3]. Nhóm nghiên cứu cũng đã chứng minh HA dạng oligomer được tạo thành từ các HA dạng trimer trong thực vật dựa vào tương tác đặc hiệu của S·Protein và S·Tag có hoạt tính sinh miễn dịch tốt hơn so với dạng HA trimer [4]. Căn cứ vào tình hình thực tiễn và các luận cứ khoa học trên, đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch” đã được lựa chọn cho luận án này. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án 1) Tạo được kháng nguyên HA A/H5N1 tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá. 2) Đánh giá được khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên HA A/H5N1 tự nhiên và nhân tạo ở các dạng trimer, oligomer TP và oligomer ELP
3 tái tổ hợp có nguồn gốc từ thuốc lá. 3) Đề xuất được ứng viên tiềm năng cho định hướng phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Nội dung 1: Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1 Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá. Nội dung 3: Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp. Nội dung 4: Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.
4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Virus cúm A/H5N1 1.1.1. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 (Influenza A virus subtype H5N1) thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Alphainfluenzavirus, loài virus cúm A (Influenza A virus). Virus cúm A được phân loại thành các phân nhóm theo sự kết hợp của hai protein bề mặt virus hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Cho đến nay có 18 phân nhóm HA khác nhau và 11 phân nhóm NA khác nhau và trong tự nhiên các phân nhóm HA và NA có thể tái tổ hợp luân chuyển (reassortment) tạo nên các phân type HxNy mới. Tùy thuộc vào vật chủ gốc, virus cúm A có thể được phân loại là cúm gia cầm (ví dụ: cúm gia cầm A/H5N1, A/H9N2, A/H5N6… ), cúm lợn (ví dụ: cúm lợn A/H1N1, A/H3N2…) hoặc các loại virus cúm động vật khác. Virus cúm A có phổ thích ứng rộng có thể gây bệnh trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau như: chim, gia cầm, thuỷ cầm, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và người. Đặc điểm thích ứng đa vật chủ là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi hoặc tái tổ hợp các phân đoạn gen (đặc biệt là gen kháng nguyên HA và NA) giữa các chủng lưu hành để tạo ra chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới. Đặc biệt hơn, các phân type hay chủng mới gây bệnh khi chúng vượt qua được “rào cản loài” (species-barrier) dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [5]. Sự xuất hiện của một loại virus cúm A mới và rất khác biệt có khả năng lây nhiễm sang người và lây truyền từ người sang người là rất có thể và có khả năng gây ra đại dịch cúm toàn cầu. Virus cúm A/H5N1 gây bệnh nặng ở gia cầm và dẫn đến tỷ lệ tử vong cao nên còn được gọi là virus cúm gia cầm thể độc lực cao (highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV) type A và phân type (subtype) H5N1, HPAI A(H5N1)) [https://en.wikipedia.org/wiki/Influenza_A_virus_subtype_H5N1]. Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu đường kính từ 50–100 nm. Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm và dài từ 200–300 nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi chứa RNA. Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm
5 đã được đặc hiệu hóa để gắn protein màng của virus vào, bao gồm một số protein được glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein dạng trần không được glycosyl hoá (non-glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA, protein enzyme cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix). Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin. Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhô lên từ bề mặt của virus, mỗi gai có độ dài từ 10–14 nm. Các gai này được cấu tạo bởi hai loại glycoprotein HA và NA. Các gai HA thường nhiều hơn và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4–5):1. Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8]. Hệ gen virus cúm A/H5N1 là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn RNA riêng biệt (Hình 1.1), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2) [6]. Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50–100 nm, đường kính 9–10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP)
6 với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein của virus (vRNP) (Hình 1.1). Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có độ dài từ 10.000–15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm A) và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus. Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8–1,1% RNA, 70–75% là protein, 20–24% lipid và 5–8% là carbohydrate [7]. Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm trong lịch sử ở động vật và người [6, 9]. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lây truyền trong quần thể sinh vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections). Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học là chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi gen thông qua H9N2 (trên lợn) [5, 10]. Virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể sử dụng nguồn phôi gà để sản xuất vaccine vô hoạt cho gia cầm. Để khắc phục điều này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã kiến tạo thành công hướng sản xuất vaccine H5N1 bằng phương pháp di truyền ngược (reverse genetics - based technology). Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo tái tổ hợp gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch nhưng không gây bệnh. Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi nội gen và xảy ra nhanh nên việc sản xuất vaccine cũng gặp không ít khó khăn và đòi hỏi sự cập nhật liên tục. 1.1.2. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên tục, nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho một loại protein của virus. Hai đầu 5' và 3' của RNA hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn trong tất cả virus cúm A, đó là 5'-AGUAGAACAAGG... và 3'- UCG(U/C)UUUCGUCC... [8]. Sáu phân đoạn từ 1–6, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho các protein riêng biệt, phân đoạn 7 và 8 mã hoá cho từng phần của
7 gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối ghép (splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp protein [8]. Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). RNP kết hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của virus. Phân đoạn 1 mã hoá cho enzyme polymerase PB2 (polymerase basic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã, có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực tế là: 87 kDa) [8]. Phân đoạn 2 mã hoá cho enzyme polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNAtranscriptase), có độ dài 2341 nucleotide, với trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) [11]. Phân đoạn 3 mã hoá cho enzyme kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNAtranscriptase) tham gia tổng hợp RNA, có độ dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực tế: 85 kDa) [11]. Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu). Có 18 loại HA, trong đó chỉ có H1, H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người. Virus mang gen H5, H7 và H9 có thể lây nhiễm từ chim sang người. HA được phân bố rải rác trên bề mặt của virus, là protein kháng nguyên bề mặt type I liên quan đến sự bám dính của virus và gắn virus vào thụ thể acid sialic của tế bào, có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu gà và tham gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của virus, hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus. HA có phân tử lượng là 63 kDa (nếu không được glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48 kDa và HA2 là 29 kDa) [12], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type virus, đối với H5N1 là 1704–1707 bp, H7N1 là 1683–1695 bp, H9N1 là 1683 bp, H1N1 là 1701 bp. Phân đoạn 5 mã hoá cho protein nucleoprotein (NP) có trọng lượng phân tử tính toán là 56 kDa, gen NP của H5N1 có độ dài là 1497 bp [8]. Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu hiện đặc tính kháng nguyên
8 đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein. Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA). NA có trọng lượng phân tử theo tính toán 50 kDa (thực tế: 48–63kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1 là 1350–1410 bp [12]. NA là protein màng type II tồn tại như các gai hình nấm trên bề mặt của virus. NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính enzyme phân cắt liên kết giữa thụ thể acid sialic và HA, để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào, nhờ vậy mà đẩy nhanh quá trình lan truyền virus trong tế bào chủ. Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng bám dính vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình xâm nhập, nhân lên và giải phóng virus. Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1 và M2. Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng bao gói và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus. Tiểu phần M2 là protein nội màng, có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân tử tính toán của M1 là 28 kDa (thực tế: 25 kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân đoạn M có độ dài khoảng 1027 bp [14]. M là protein màng không được glycosyl hóa, mang tính chất protein đệm, có vai trò bao gói RNA của hệ gen virus và là kênh vận chuyển các thành phần của virus qua màng. Phân đoạn 8 mã hoá cho protein không cấu trúc NS (non-structural protein) có độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A và gồm hai tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2. Tiểu phần NS1 có chức năng vận chuyển mRNA ra tế bào chất, dịch mã, là protein kháng interferon và tiểu phần NS2 có vai trò vận chuyển RNP ra khỏi nhân, trọng lượng phân tử tính toán NS1 là 27 kDa (thực tế: 25 kDa), của NS2 là 14 kDa (thực tế: 12 kDa), NS có độ dài 890 bp [15]. Nếu thiếu protein NS, virus sinh ra sẽ không hoàn chỉnh, trở thành virus thiểu năng. 1.1.3. Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin Protein HA là một trong hai kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A [16], có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus. Protein HA có khả năng gây